西藏青稞根際土壤可培養(yǎng)放線菌的遺傳多樣性及其促生功能分析

高 雪，辜運富，尼瑪扎西*， 劉國一， 劉 婷， 劉 怡， 普布貴吉

（1.省部共建青稞和牦牛種質(zhì)資源與遺傳國家重點實驗室/西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，拉薩 850000；2.四川農(nóng)業(yè)大學資源學院，成都 611130）

青稞（HordeumvulgareLinn.var.nudum Hook.f.）是禾本科大麥屬作物，在西藏、四川等地已廣泛種植。目前，在青稞種植過程中，產(chǎn)量低、病害多已成為制約青稞產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要因素。傳統(tǒng)農(nóng)藥、化肥的施用雖然能在較短時間內(nèi)提高青稞產(chǎn)量，緩解供需矛盾，但會對生態(tài)環(huán)境造成不可逆破壞[1]。放線菌可以分解多種有機物，調(diào)節(jié)土壤養(yǎng)分，促使土壤團粒結構的形成以改善土壤，還可分泌植物生長調(diào)節(jié)劑和抗病活性物質(zhì)等次生代謝產(chǎn)物促進植物生長，抑制植物病害的發(fā)生[2-4]，因此篩選具有潛在應用價值的高效放線菌并將其制成生物菌劑應用于青稞生產(chǎn)，對于優(yōu)化青稞栽培上的施肥制度、培肥青稞種植土壤具有重要意義。

目前，有關土壤放線菌的研究主要集中于放線菌抗菌活性的鑒定和拮抗菌株的篩選等方面，何建清等[5]從西藏色季拉山22 份土壤樣品中分離的120株放線菌菌株中，篩選出一株菌株2152 對水稻稻瘟病菌（PyriculariaoryzaeSacc）、立枯絲核菌（Rhizoctoniasolani）、棉花枯萎菌（Fusariumaxysporumf.sp.vasinfectum）、煙草赤星病菌（Alternariaalternata）4 種供試病原菌表現(xiàn)強烈的抑菌效果。程少軍等[6]從黔東北區(qū)域采集的61 份土樣中分離的80 株放線菌著重于菌株的抗菌活性測定，篩選出2 株放線菌表現(xiàn)出較強的抗菌活性。D.Ryan 等[7]研究發(fā)現(xiàn)，鏈霉菌產(chǎn)生的抗生素對瘡痂鏈霉菌（Streptomycesscabies）具有一定的抑制作用。D.R.Sacramento 等[8]從巴西熱帶地區(qū)土壤中分離出鏈霉菌菌株606 能產(chǎn)生抗病原細菌和抗病原真菌的活性物質(zhì)，也有很強的抗病毒的生物活性。綜上，放線菌所產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物可作為農(nóng)用抗生素抑制病原菌并促進植物生長，對提升作物品質(zhì)具有積極作用。但迄今為止，關于西藏地區(qū)青稞根際土壤中放線菌多樣性的研究鮮有報道。

本試驗以西藏地區(qū)青稞根際土壤樣品為材料，對其中的可培養(yǎng)放線菌進行分離，并通過反轉(zhuǎn)錄重復因子擴增（BOXA1R-PCR）技術對分離菌株進行多樣性分析；通過16S rRNA 基因測序?qū)Ψ蛛x菌株的系統(tǒng)發(fā)育地位進行分析。以期初步揭示西藏地區(qū)青稞根際土壤中的放線菌資源，為豐富放線菌資源庫，篩選高效放線菌菌株應用于青稞栽培提供菌株資源和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 采樣點介紹

西藏位于青藏高原西南部，地處北緯（26°50′—36°53′），東經(jīng)（78°25′—99°06′）之間，平均海拔在4 000 m 以上，地域遼闊，地貌壯觀，資源豐富，素有世界屋脊之稱。西藏的氣候，由于地形、地貌和大氣環(huán)流的影響，獨特且復雜多樣，總體上具有西北嚴寒干燥，東南溫暖濕潤的特點，適于青稞喜涼、耐旱、喜光特性。西藏是我國青稞的主產(chǎn)地之一，其獨特的自然氣候為青稞提供了良好的生長條件，形成了產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展。采樣點具體信息見表1。

1.1.2 樣品采集

從西藏拉薩5 個青稞生產(chǎn)區(qū)域采用抖根法[7]隨機采集青稞根際土壤，剔除青稞殘根等雜物后，裝入無菌塑料袋內(nèi)密封帶回實驗室低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 培養(yǎng)基

分離純化土樣中的放線菌用高氏一號培養(yǎng)基[9]、改良ISP5 培養(yǎng)基[10]、淀粉酪素培養(yǎng)基[11]、改良淀粉酪素培養(yǎng)基[12]、甘油-門冬酰胺培養(yǎng)基[13]、玉米粉瓊脂培養(yǎng)基[14]、腐殖酸瓊脂培養(yǎng)基[15]；溶磷能力測定用溶磷篩選培養(yǎng)基（PKO 培養(yǎng)基），菌株拮抗性測定用PDA 培養(yǎng)基。

表1 采樣點信息Table 1 Sampling point information

1.1.4 植物病原菌菌株

包括禾谷鐮孢菌（Fusariumgraminearum）、灰葡萄孢（Ascomycota）、大豆疫霉病菌（PhytophthorasojaeKaufmann&Gerdemann）和辣椒疫霉（PhytophthoracapsiciLeonian）4 種病原菌，均由四川農(nóng)業(yè)大學植物病理室及微生物室提供。

1.1.5 主要試劑和儀器

化學試劑均為分析純試劑；PCR 擴增相關試劑及引物測序等，上海生物工程技術有限公司。PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)、電泳儀等，美國Bio-Rad 公司。2×TaqPCR Master Mix，天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 放線菌分離

采用稀釋涂布平板法[16]，取10-5、10-6、10-7共3個濃度的根際土壤樣品稀釋液，均勻涂布在培養(yǎng)基上。28 ℃倒置培養(yǎng)5～7 d，采用平板劃線分離法[17]，進行劃線分離培養(yǎng)直至獲得純培養(yǎng)。

1.2.2 分泌吲哚乙酸（IAA）特性測定

采用Salkowski 比色法測定分離菌株分泌IAA能力[18]。

1.2.3 溶磷特性測定

為評價分離菌株的應用潛力，采用培養(yǎng)基溶解圈法[19]測定菌株的溶磷特性。測定溶解圈直徑，計算平均值來表征供試放線菌菌株的溶磷能力。

1.2.4 抗病活性測定

采用平板對峙法[20]測定放線菌抗病活性。放線菌的拮抗性強度統(tǒng)計標準R（拮抗圈直徑）＞20 mm、6 mm＜R≤20 mm 和R=0 mm 分別表示拮抗性極強、中等及無拮抗性3 個等級[14]。

1.2.5 DNA 提取及BOXA1R-PCR 分析

采用酶解法提取分離放線菌的DNA[21]，然后用1.0%瓊脂糖凝膠檢測，于-20 ℃冰箱中保存。選取BOX 引物（5'-CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3'）進行PCR 擴增[22]。PCR 反應體系：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，引物（10 μmol/L）0.5 μL，模板DNA（10 mg/L）1 μL，加ddH2O 補齊至25 μL。PCR 反應條件：95 ℃4 min；95 ℃1 min；55 ℃1 min；65 ℃8 min，共35 個循環(huán)；65 ℃16 min。擴增引物以2 000 bp DNA ladder 作分子量標準，在80 V 電壓下經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳60 min，用凝膠成像系統(tǒng)拍照檢測。將BOXA1R-PCR 圖譜中同一位置有條帶的記為“1”，無條帶的記為“0”。采用軟件NTSYSpc 2.1 中的平均連鎖聚類法（UPGMA）進行聚類分析并獲得樹狀圖譜。

1.2.6 16 S rRNA 基因測序

基于菌落特征、溶磷能力、IAA 產(chǎn)量、抗菌活性以及BOXA1R-PCR 遺傳分析綜合結果，選取32 株代表菌株以引物1492r [5'-TACGG（C/T）TACC TTGTTACGACTT-3']和27f [5'-AACTKAAGAGTTTGATCCTGGCTC-3']進行分離菌株16S rRNA 基因片段的擴增[23]，片段長度為1 500 bp。PCR 反應體系：2×TaqPCR Master Mix 25 μL，引物（10 mol/L）各0.5 μL，模板DNA（10 mg/L）1 μL，加ddH2O 補齊至50 μL。PCR 反應條件：94 ℃5 min；94 ℃1 min；56 ℃1 min；72 ℃2 min，共35 個循環(huán)；72 ℃12 min。擴增產(chǎn)物送擎科生物技術有限公司測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

基礎數(shù)據(jù)的處理利用Excel 2010 進行，將所得序列去載體后GenBank 中進行Blast 同源性檢索（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov），利用Mothur 軟件在97%的相似性水平上進行可操作分類單元（opera-tional taxonomic units，OTUs）分析[24]。將獲得的同源序列和測定序列用Clustal X 進行分析，采用MEGA 7.0 軟件包中的Kimura 2-Parameter Distance 進行多序列匹配，用鄰接法（Neighbor-joining）構建系統(tǒng)發(fā)育樹。獲得的32 條序列登錄號為：MH286154-MH286185。

2 結果與分析

2.1 土樣理化性質(zhì)

各土樣基本理化性質(zhì)見表2。5 個土壤樣品中除JC-1 土樣偏酸性外，其余4 個土壤樣品均為微堿性土壤，其中LZ-3 pH 最高。JC-1 土樣的土壤有機質(zhì)含量為5 個土樣中最高，但速效鉀含量最低。ZL-1土壤樣品的全氮、速效鉀、有效磷含量為5 個土樣中最高且土壤速效鉀含量遠高于其他土壤樣品。

2.2 土壤放線菌的分離計數(shù)

本試驗從西藏拉薩5 個青稞種植區(qū)域的根際土壤中共分離放線菌129 株。不同地點分離得到的菌株數(shù)量不同，其中從隆子地區(qū)的土樣中分離的放線菌最多，為82 株，LZ-2、LZ-3、LZ-4 中分別分離的放線菌數(shù)量為29、27、26 株；其次從扎朗縣分離得到34 株放線菌；而加查縣分離得到的放線菌最少，為13 株。結果表明，西藏青稞種植區(qū)域根際土壤放線菌資源存在顯著差異。綜合來看，從ZL-1 土樣中分離的放線菌數(shù)量最多，因為其全氮、速效鉀、有效磷含量相對較高且土壤pH 為中性至微堿性，為放線菌的生長提供了基本的營養(yǎng)物質(zhì)和生存條件。從JC-1 土樣中分離的放線菌數(shù)量最少，雖然該土樣有機質(zhì)含量最高，但pH 呈酸性，不滿足放線菌適宜在中性至微堿性的土壤中生存的要求。

表2 土壤樣品基本理化性質(zhì)Table 2 Basic physicochemical properties of soil samples

2.3 不同菌株分泌吲哚乙酸（IAA）能力

分離純化所得129 株菌株中，測得產(chǎn)IAA 菌株有51 株，占分離菌株的39.5%（表3）。其中產(chǎn)IAA量在20 ～30 mg/L 之間的菌株占產(chǎn)IAA 菌株的19.6%；30～40 mg/L 之間的菌株占產(chǎn)IAA 菌株的51.0%；40～50 mg/L 之間的菌株占產(chǎn)IAA 菌株的13.7%；大于57 mg/L（即高產(chǎn)IAA）的菌株占產(chǎn)IAA菌株的15.7%，其中KT211 產(chǎn)量最高，加入色氨酸培養(yǎng)5 d 后IAA 產(chǎn)量達66.8 mg/L。

2.4 不同菌株溶磷能力

分離所得的129 株菌株中具有溶磷能力的放線菌比例為60.0%，有21.0%的菌株溶磷圈直徑大于2 cm（表3），其中菌株KT203 的溶磷圈直徑最大，溶磷效果最好。

2.5 放線菌拮抗特性評價

對分離所得放線菌進行抗菌活性測定（表3），與各種病原菌的拮抗特性的比例分別為：禾谷鐮孢菌（52.0%），其中拮抗性極強20.0%，拮抗性中等32.0%，以KT214 菌株對其拮抗能力為最強；灰葡萄孢（32.0%），其中拮抗性極強11.0%，拮抗性中等21.0%；大豆疫霉病菌（25.0%），其中拮抗性極5.0%，拮抗性中等20.0%；辣椒疫霉（9.0%），其中拮抗性極強1.0%，拮抗性中等8.0%，以KT23 菌株對其拮抗能力為最強。

2.6 BOXA1R-PCR 分析與系統(tǒng)發(fā)育分析

通過對分離所得放線菌基因組進行PCR 擴增，從而認識西藏青稞種植地土壤樣品中放線菌的遺傳多樣性，遺傳圖譜類型見表4，129 株菌被分成19種不同的遺傳圖譜類型。基于BOXA1R-PCR 遺傳圖譜和菌落特征，選取32 株代表菌株進行16S rRNA 基因片段測序，長度約1 500 bp。所得序列提交NCBI 數(shù)據(jù)庫，用Clustal X 軟件進行多序列比對，利用Mothur 軟件，放線菌基因系統(tǒng)發(fā)育分析基于3%的序列差異，32 個序列被劃歸為5 個OTUs，

分別是OTU1（MH286154，MH286158，MH286160，MH286161，MH286167，MH286174，MH286176，MH 286178，MH286181，MH286182，MH286183，MH286 185）、OTU2（MH286168，MH286179，MH286180）、OTU3（MH286171，MH286173）、OTU4（MH286172）、OTU5（MH286156）。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，代表菌株分屬于鏈霉菌屬（Streptomyces），擬諾卡氏菌屬（Nocardiopsis），類諾卡氏菌屬（Nocardioides），小單孢菌屬（Micromon-ospora）和放線菌屬（Actinomyces）5 個屬，其中鏈霉菌屬（Streptomyces）為優(yōu)勢種屬。

表3 放線菌代表菌株溶磷特性、抗病能力與IAA 產(chǎn)量Table 3 Actinomycetes represent the characteristics of phosphorus soluble phosphorus，resistance to disease and IAA production

表4 土壤放線菌代表菌株鑒定結果Table 4 Soil Actinomycetes represent the identification results of bacterial strains

圖1 代表菌株16S rRNA 基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析Figure 1 Phylogenetic analysis of 16S rRNA gene sequences of the representative isolates

3 討論與結論

青稞具備三高兩低的營養(yǎng)成分構成[25]，有較高的營養(yǎng)價值。近年來，各種植物病害嚴重影響了青稞的產(chǎn)質(zhì)量，傳統(tǒng)上多施用化學農(nóng)藥進行防治，這會影響土壤生態(tài)平衡，導致土壤質(zhì)量下降甚至土壤退化，不利于農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[26]。利用拮抗放線菌或其次生代謝產(chǎn)物防治植物病害是生物防治中的重要措施。

從西藏青稞根際土壤樣品中分離共129 株放線菌，分屬于鏈霉菌屬（Streptomyces），擬諾卡氏菌屬（Nocardiopsis），類諾卡氏菌屬（Nocardioides），小單孢菌屬（Micromonospora）和放線菌屬（Actinomyces）5個屬，其中以鏈霉菌屬（Streptomyces）為優(yōu)勢菌群，這與謝靜等[27]從西藏林芝八一鎮(zhèn)土壤中分離出的 29 株放線菌都屬于鏈霉菌屬（Streptomyces）；與羅紅麗等[28]從西藏不同海拔、不同氣候條件的5 個地區(qū)采集的10 份土樣分離的放線菌中，鏈霉菌屬（Streptomyces）和諾卡氏菌屬（Nocardia）所占比例較大；王孝國等[29]在對艾比湖植物根系的可培養(yǎng)放線菌的研究中發(fā)現(xiàn)鏈霉菌屬（Streptomyces）和擬諾卡氏菌屬（Nocardiopsis）占優(yōu)勢的結果相一致，表現(xiàn)出一定的遺傳多樣性。

放線菌在土壤元素的生物地球化學循環(huán)和肥力形成中起到重要作用。有研究表明，微生物產(chǎn)生的約8 000 種生物活性物質(zhì)中，近70%由放線菌產(chǎn)生[30]。M.Radhakrishnan 等[31]從較少被探索的生態(tài)系統(tǒng)（如堿土、沙漠等）中，篩選出了D5（沙漠），CSA14（森林），CA33（堿性土壤）等9 株拮抗性較強的放線菌菌株；鄭亞強等[32]研究作物根際土壤放線菌篩選出菌株J2-3/4 對作物真菌病害具有較好的抑菌活性，這表明放線菌能產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)，抑制病原菌生長。試驗分離到的放線菌表現(xiàn)出了較明顯的抑菌活性，其中KT214 和KT23 表現(xiàn)出較強的抑菌能力。王呈玉等[33]從人參根際土壤中分離得鏈霉屬放線菌菌株DC-A 菌株合成IAA 的量明顯高于對照組，同時具有較強的溶磷能力；李靜等[34]從攀枝花礦區(qū)糙野青茅根際土中分離的27 株放線菌中，10 株具有溶磷作用，14 株菌都能夠產(chǎn)IAA，其中菌株SCAU9004 產(chǎn)IAA 的能力最大，培養(yǎng)5 d 后IAA 產(chǎn)量達到42.85 mg/L，這表明放線菌可產(chǎn)生生長調(diào)節(jié)劑，促進植物發(fā)育，提高植物的營養(yǎng)吸收能力。本試驗分離的放線菌中有51 株菌株（占總分離菌株的39.5%）能產(chǎn)IAA，KT211 產(chǎn)量最高，加入色氨酸培養(yǎng)5 d 后IAA 產(chǎn)量達66.8 mg/L，77 株（占總分離菌株的60.0%）表現(xiàn)出溶磷活性。綜合測定的各項功能性狀，初步篩選出了放線菌菌株KT215、KT417，均表現(xiàn)出了較好的溶磷能力、抗菌活性和較高的IAA 產(chǎn)量。KT215 初步鑒定出為埃德爾鏈霉菌（Streptomycesederensis），F(xiàn).V.Ritacco 等[35]指出可產(chǎn)生黑色素和抗生素；KT417 初步鑒定為藍微褐鏈霉菌（Streptomycescyaneofuscatus），A.F.Bra?a 等[36]研究表明藍微褐鏈霉菌在海洋中分布廣泛且對真菌有較好的抗菌活性。

綜上，本文通過7 種培養(yǎng)基共分離得129 株放線菌菌株，其中有51 株菌株（占總分離菌株的39.5%）能產(chǎn)IAA，8 株產(chǎn)量較高（＞57 mg/L），77 株（占總分離菌株的60.0%）表現(xiàn)溶磷活性。129 株放線菌可分為19 種遺傳圖譜類型，分離菌株大致歸于鏈霉菌（Streptomyces），擬諾卡氏菌屬（Nocardiopsis），類諾卡氏菌屬（Nocardioides），小單孢菌屬（Micromonospora）和放線菌屬（Actinomyces），其中，以鏈霉菌（Streptomyces）為優(yōu)勢種屬。放線菌是抗生素的主要產(chǎn)生菌，所以其活菌制劑在農(nóng)作物病害的生物防治方面具有重要作用，本試驗篩選抗病能力強且高產(chǎn)IAA 的菌株，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有潛在應用價值。