牙齦卟啉單胞菌通過上調(diào)S100A2促進(jìn)食管鱗癌的侵襲性

焦葉林，劉其偉，阮豪杰，陳 攀，許海軍，李孟祥，齊義軍，高社干

食管鱗癌(Esophageal squamous cell cancer, ESCC)是全球食管癌的主要組織學(xué)類型[1]，是中國癌癥死亡四大原因之一，占所有食管癌90%以上[2]。由于大多數(shù)患者在最初診斷時(shí)已經(jīng)發(fā)生了轉(zhuǎn)移，盡管接受了多種治療方案，ESCC患者的5 a總生存率僅有10%[3]。因此，尋求預(yù)防、早期診斷和靶向治療的分子標(biāo)志物至關(guān)重要。

慢性感染是腫瘤形成與發(fā)展的重要因素之一，約有20%腫瘤與感染相關(guān)[4-5]?？谇谎例l卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis,P.gingivalis)不僅能夠引起牙周炎，還與多種全身性疾病密切相關(guān)。P.gingivalis富集于ESCC組織并與ESCC低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良顯著相關(guān)，提示P.gingivalis可能促進(jìn)了ESCC演進(jìn)過程[6]。P.gingivalis感染ESCC細(xì)胞前后共鑒定出255個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)分子，其中S100A2表達(dá)上調(diào)。本研究進(jìn)一步分析了ESCC組織中P.gingivalis與S100A2表達(dá)一致性，并探討了S100A2沉默后阻斷P.gingivalis對ESCC的促進(jìn)作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑RPMI 1640培養(yǎng)基(Hyclone，貨號 SH30809.01B)，胎牛血清(Hyclone，貨號SV30184.02)，GAM細(xì)菌培養(yǎng)基(日水制業(yè)株式會社，貨號05433)，RIPA裂解液(Sigma，貨號R0278)，Bradford蛋白定量試劑盒(康為，貨號CW0013)，PVDF膜(Millipore)，顯色液ECL(康為，CW0049A)，β-actin抗兔一抗(CST，貨號4970S)，S100A2抗兔一抗(Abcam，貨號ab109494)，HRP標(biāo)記羊抗兔二抗(Earth，貨號110581)，細(xì)胞侵襲遷移實(shí)驗(yàn)使用Transwell遷移小室(Corning，貨號3422)，Transwell浸潤小室(BD，貨號354480)，細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNAs由上海吉瑪公司合成生產(chǎn)，免疫組化(Immunohistochemistry,IHC)采用鏈霉素抗生素蛋白-過氧化物酶連接法，DAB(索萊寶，貨號DA1010)。

1.2 細(xì)胞株、菌株和組織來源本研究中ESCC細(xì)胞系KYSE70細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室凍存，P.gingivalisATCC 33277來源于ATCC細(xì)胞庫，ESCC組織標(biāo)本來源于河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院2012年至2017年47例ESCC 患者手術(shù)標(biāo)本。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)KYSE70用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)所使用的細(xì)胞均處于對數(shù)生長期。

1.3.2P.gingivalis培養(yǎng)和感染P.gingivalis用GAM培養(yǎng)基、37 ℃厭氧條件下(85% N2,10% H2和CO2)培養(yǎng)。P.gingivalis感染細(xì)胞用MOI 10。

1.3.3 細(xì)胞增殖、遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)于96孔板每孔接種2000個(gè)，每組3復(fù)孔，分別在P.gingivalis感染后4、6、8、12、24、48、72 h終止培養(yǎng)，用MTT法檢測細(xì)胞活性，繪制細(xì)胞生長曲線。細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)采用遷移小室，小室上層接種5.0×104個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24～48 h后終止實(shí)驗(yàn)，固定、0.2%結(jié)晶紫染色，顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)。

1.3.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)siS100A2細(xì)胞轉(zhuǎn)染，5 pmol siRNAs和8 μL siRNA-mate混合、室溫孵育10 min，然后加入目標(biāo)細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)48～72 h。

1.3.5 蛋白提取細(xì)胞培養(yǎng)至收集時(shí)，預(yù)冷PBS洗3次，加入適量蛋白裂解液，冰上靜置5 min，用細(xì)胞刮收集細(xì)胞于Ep管，4 ℃、13 000 r·min-1離心10 min，收集上清即提取蛋白，Bradford法測定蛋白濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.6 Western-bloting配制5%濃縮膠和12%分離膠，蛋白樣品30 μg電泳分離，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，一抗4 ℃過夜孵育，二抗室溫孵育1 h，ECL顯色。

1.3.7 免疫組化采用鏈霉素抗生素蛋白—過氧化物酶連接法，PBS 1∶500稀釋S100A2一抗，DAB顯色、蘇木素復(fù)染檢測組織表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，免疫組化結(jié)果分析采用卡方檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1P.gingivalis誘導(dǎo)S100A2蛋白水平上調(diào)P.gingivalis感染ESCC細(xì)胞24 h后，Western blot檢測到ESCC細(xì)胞KYSE70中S100A2蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(見圖1)。

2.2 S100A2沉默阻斷了P.gingivalis誘導(dǎo)的ESCC細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為siS100A2轉(zhuǎn)染后，MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(圖2A)、遷移實(shí)驗(yàn)(圖2B)和侵襲實(shí)驗(yàn)(圖2C)檢測對照細(xì)胞和siS100A2轉(zhuǎn)染KYSE70細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力，發(fā)現(xiàn)P.gingivalis感染明顯增強(qiáng)對照細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，轉(zhuǎn)染siS100A2的KYSE70細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力明顯降低，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.3 ESCC組織中S100A2表達(dá)及S100A2與P.gingivalis豐度相關(guān)性IHC檢測47例ESCC組織中S100A2表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ESCC組織中S100A2的表達(dá)(圖3A)明顯高于癌旁(圖3B)。卡方分析ESCC中S100A2表達(dá)與P.gingivalis相關(guān)性，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示ESCC中S100A2表達(dá)與P.gingivalis豐度呈正相關(guān)，P<0.01(圖3B)。

圖2 P. gingivalis感染KYSE70細(xì)胞、siS100A2轉(zhuǎn)染后KYSE70及對照細(xì)胞增殖(A)、遷移(B)和侵襲能力(C)變化

圖3 IHC檢測ESCC組織中S100A2表達(dá)和P. gingivalis豐度(A)、S100A2和P. gingivalis相關(guān)性(B)

3 討論

由于ESCC早期階段缺乏典型臨床癥狀，目前尚缺乏特異、敏感的ESCC腫瘤標(biāo)志物分子，而食管胃鏡篩查患者依從性差，并且還需專業(yè)醫(yī)務(wù)人員，因此，大多數(shù)ESCC患者首次就診時(shí)已發(fā)展至中晚期，大于50%中晚期病人就診時(shí)已呈現(xiàn)出影像學(xué)可見的轉(zhuǎn)移灶[7-9]。因此，明確ESCC病因、鑒定ESCC分子標(biāo)志物，是有效預(yù)防ESCC發(fā)生、降低ESCC發(fā)生率、提高早期診斷ESCC及靶向治療的基礎(chǔ)。

上消化道微生態(tài)紊亂是ESCC 發(fā)生發(fā)展的重要因素之一[4-6]。正常的食管微生態(tài)主要由以鏈球菌為主的革蘭氏陽性菌構(gòu)成，而食管炎或Barrett’s食管的微生態(tài)以革蘭氏陰性的厭氧菌為主[10]。流行病學(xué)研究表明，口腔P.gingivalis豐度與ESCC發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)，并且ESCC患者口腔微生態(tài)多樣性顯著減少[7-11]。ESCC組織中P.gingivalis豐度明顯高于癌旁組織，并且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，與分化程度、生存期呈負(fù)相關(guān)。

S100A2是 S100 蛋白家族中重要成員，其表達(dá)異常與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)。S100A2基因位于與上皮細(xì)胞分化有關(guān)的染色體 1q.21，具有多種生物學(xué)功能，如蛋白磷酸化、細(xì)胞支架構(gòu)建及細(xì)胞內(nèi)外鈣離子平衡等[12]。此外，研究者也發(fā)現(xiàn) S100A2的異常表達(dá)與腫瘤的演進(jìn)過程相關(guān)，如：胃癌中S100A2表達(dá)缺失可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，并與腫瘤大小、分化、淋巴轉(zhuǎn)移及預(yù)后有關(guān)[12-13]。然而，與之相反的是，在大腸癌中，S100A2的過表達(dá)增加腫瘤侵襲性[12-14]。Cao等應(yīng)用IHC分析ESCC中S100A2表達(dá)，發(fā)現(xiàn)S100A2 mRNA、蛋白的陽性表達(dá)率分別為77.5%和72.5%，而正常食管黏膜全部表達(dá)S100A2蛋白及 mRNA，S100A2表達(dá)下調(diào)與腫瘤分化和淋巴轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)[15-16]。相比正常食管黏膜組織，Barrett’s食管癌中S100A2 蛋白表達(dá)量明顯增高[15-17]。本研究表明，P.gingivalis能夠誘導(dǎo)S100A2表達(dá)上調(diào)，ESCC組織中P.gingivalis豐度與S100A2表達(dá)呈正相關(guān)，且S100A2表達(dá)降低后，抑制了P.gingivalis誘導(dǎo)的ESCC細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力增加。

本研究結(jié)果表明，中國華北ESCC高發(fā)區(qū)P.gingivalis是重要的病因?qū)W因素之一，S100A2可能是P.gingivalis促進(jìn)ESCC演進(jìn)過程中的重要參與分子之一，是ESCC潛在分子治療靶點(diǎn)。