牙齦卟啉單胞菌來源的外泌體對(duì)食管癌細(xì)胞增殖遷移作用的研究

王浩潔，史 浩，齊義軍，朱夢(mèng)璽，陳 攀，蘭子君，，張 灝，梁高峰，，高社干，

食管癌(esophageal cancer,EC)是常見的消化道腫瘤之一，全世界每年約有57.2萬人死于食管癌。中國是世界上食管癌高發(fā)地區(qū)之一，每年新增食管癌患者占全球一半以上，其中90%以上屬食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell cancer,ESCC)[1-2]。由于早期食管癌缺乏典型癥狀及食管癌高危預(yù)警標(biāo)志，5 a生存率較低(<25%)。研究表明：誘發(fā)食管癌的高危因素包括營養(yǎng)缺乏(經(jīng)濟(jì)貧困)、攝入霉變食物或含亞硝酸鹽腌菜等因素。然而，隨著經(jīng)濟(jì)和生活水平提高，我國食管癌的發(fā)病率依然較高，這提示其中還可能存在其它危險(xiǎn)因素。

研究發(fā)現(xiàn)：約20%的惡性腫瘤與感染性因素相關(guān)，如幽門螺桿菌(Helicobacterpylori,HP)與胃癌[3]、人乳頭瘤病毒(Human Papillomavirus,HPV)與宮頸癌[4]、具核梭桿菌(Fusobacteriumnucleatum)與結(jié)腸癌[5]。牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis,P.gingivalis)是口腔關(guān)鍵致病菌之一[6]，并且大量的文獻(xiàn)報(bào)道了P.gingivalis感染與口腔癌、胰腺癌、老年癡呆等疾病的發(fā)生有一定關(guān)系[7-9]。此外，本課題組在之前也發(fā)現(xiàn)牙齦卟啉單胞菌感染可能是食管癌發(fā)生的一個(gè)高危因素[10-12]。還發(fā)現(xiàn)：ESCC組織中P.gingivalis含量明顯高于癌旁組織和正常食管黏膜組織，P.gingivalis含量與ESCC分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期呈正相關(guān)，與ESCC患者總體生存期呈負(fù)相關(guān)[13]。因此，P.gingivalis可能是ESCC發(fā)生發(fā)展過程中的重要參與者。然而，目前對(duì)P.gingivalis促進(jìn)食管癌發(fā)生發(fā)展確切的分子機(jī)制尚不清楚。

越來越多的證據(jù)表明，腫瘤細(xì)胞來源的外泌體(exosome)被認(rèn)為是腫瘤多階段演進(jìn)中的關(guān)鍵因素[14-15]。作為一種直徑為30～150 nm的納米級(jí)別的胞外囊泡，外泌體通過攜帶多種生物活性成分介導(dǎo)細(xì)胞間的“物質(zhì)和信息的交流”[16]，進(jìn)而影響腫瘤進(jìn)展的許多階段，包括血管生成、侵襲轉(zhuǎn)移和耐藥[17-19]。因此，探究牙齦卟啉單胞菌來源的外泌體(P.gingivalis-Exo)對(duì)食管癌細(xì)胞的影響，對(duì)研究P.gingivalis促進(jìn)食管癌發(fā)生發(fā)展，揭示其確切的分子機(jī)制有著十分重要的意義。本研究通過MTT、Transwell、劃痕和Western blot等實(shí)驗(yàn)探究P.gingivalis-Exo如何通過TGF-β1/Smad2通路促進(jìn)食管癌細(xì)胞增殖遷移。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 儀器超速離心機(jī)(日立CP100WX，日本)；透射電鏡(JEM-2100，日本電子有限公司)；Zetasizer Nano(Malvern Panalytical，英國)；激光共聚焦顯微鏡(Nikon公司，日本)；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(BioTek公司，美國)；蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(Bio-Rad公司，美國)；全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Tanon 5200，上海天能科技有限公司)；微量臺(tái)式高速離心機(jī)(Beckman Coulter，美國)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo Fisher，美國)；厭氧培養(yǎng)箱(COY，美國)。

1.1.2 菌株及細(xì)胞P.gingivalisATCC 33277購自美國模式生物培養(yǎng)庫(American type culture collection，ATCC)；人食管癌細(xì)胞系(KYSE-150/KYSE-30)購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.1.3 試劑Roswell Park Memorial Institute-1640培養(yǎng)基(RPMI-1640，Life Technologies公司，美國)；胎牛血清(FBS，Gibco公司，美國)；胰蛋白酶(南京維森特生物技術(shù)有限公司)；熒光染料DIR、DAPI(Sigma公司，美國)；四甲基偶氮唑鹽(MTT，Sigma公司，美國)；BCA蛋白濃度試劑盒(上海生工生物工程股份有限公司)；Transwell小室(Corning公司，美國)；PVDF膜(Millipore公司，美國)；ECL發(fā)光液(上海天能科技有限公司)；二甲基亞砜(DMSO)；一抗Smad2(CST公司，美國)；TGF-β1(Abcam公司，美國)；GAPDH(上海生工生物工程股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng)P.gingivalis菌株ATCC 33277在含5%羊血、1%氯化血紅素和0.1%維生素K的GAM肉湯液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，放置37 ℃厭氧培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)(85%N2、10%H2和5%CO2)。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)KYSE-150/KYSE-30在含有10%FBS，1%青鏈霉素的RPMI-1640中培養(yǎng)，放置于37 ℃、5%CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.3 外泌體提取收集P.gingivalis的培養(yǎng)上清液，加入50 mL離心管中，4 000×g離心30 min去除碎片。然后將上清液移入超離管中，超速離心100 000×g離心60 min，棄去上清液，最后用PBS緩沖液重懸沉淀，并用0.22 μm的針頭式過濾器進(jìn)行過濾，分裝置于-80 ℃冰箱備用。

1.2.4 電鏡鑒定P.gingivalis-Exo的結(jié)構(gòu)P.gingivalis-Exo經(jīng)無菌的PBS稀釋后，取20 μL的P.gingivalis-Exo懸液滴加于直徑2 mm載樣銅網(wǎng)上，濾紙吸去多余液體，室溫靜置3 min，于銅網(wǎng)上滴加3%磷鎢酸溶液約10 μL，負(fù)染5 min，在透射電子顯微鏡下觀察P.gingivalis-Exo并拍照。

1.2.5 Zetasizer Nano分析P.gingivalis-Exo粒徑使用Zetasizer Nano分析提取的P.gingivalis-Exo，將1 mL的P.gingivalis-Exo加入到比色皿中，上機(jī)，待其布朗運(yùn)動(dòng)1 min后，使用Zetasizer Nano軟件進(jìn)行分析后計(jì)算出納米粒子濃度和尺寸分布。

1.2.6 細(xì)胞攝取P.gingivalis-Exo將1 μL濃度為5 mg·mL-1的DIR溶液加入到PBS重懸的P.gingivalis-Exo溶液中，37 ℃避光孵育30 min，100 000×g超速離心60 min，棄去游離的DIR染料，所得產(chǎn)物用PBS稀釋。

1.2.7 MTT實(shí)驗(yàn)根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組，收集對(duì)數(shù)期的食管癌細(xì)胞消化、離心，用完全培養(yǎng)基重懸成單個(gè)細(xì)胞懸液，接種于96孔板中(每孔5×103細(xì)胞)，待其貼壁后加入P.gingivalis-Exo，每個(gè)樣設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，放置在5%CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中孵育，分別在12、24、48、72 h后每孔加入15 μL的MTT(5 mg·mL-1)，繼續(xù)孵育。4 h后終止反應(yīng)，棄上清液，加入150 μL DMSO，避光振蕩10 min。用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)量OD值，并繪制生長(zhǎng)曲線圖。

1.2.8 劃痕實(shí)驗(yàn)將5×105個(gè)細(xì)胞接種于六孔板中，放置在5%CO2、37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中孵育。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%，在每個(gè)孔中心用100 μL槍頭尖端刮擦細(xì)胞，PBS洗滌3遍，并加入無血清的培養(yǎng)基和P.gingivalis-Exo進(jìn)行共培養(yǎng)，然后分別在0、12、24 h進(jìn)行拍照。通過Image J軟件確定無細(xì)胞區(qū)域。

1.2.9 Transwell實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)前，先將50 mg·mL-1的基質(zhì)凝膠稀釋(50 mg·mL-1的基質(zhì)凝膠：PBS=1∶8)，并將其加入到24孔Transwell小室的上室，放置在5%CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中過夜使基質(zhì)膠充分干燥。收集對(duì)數(shù)期的食管癌細(xì)胞，在無血清培養(yǎng)基中重懸，均勻混合。在Transwell上室中加入1×104個(gè)細(xì)胞，待其完全貼壁后加入P.gingivalis-Exo。最后，將500 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基添加到下室。37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,棄去上、下室培養(yǎng)液，PBS洗滌，晾干，取出小室用4%多聚甲醛固定2 h，PBS洗3次，4 g·L-1結(jié)晶紫染色30 min，再用PBS清洗3次，Transwell小室在顯微鏡下觀察和拍攝。

1.2.10 Western Blot實(shí)驗(yàn)將5×106個(gè)細(xì)胞接種于直徑為6 cm的培養(yǎng)皿中，KYSE-150/KYSE-30細(xì)胞與P.gingivalis-Exo共培養(yǎng)，37 ℃、5%CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。24 h后，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次，在細(xì)胞中加入300 μL RIPA裂解液(含3 μL的PMSF)，冰上充分裂解，14 000 r·min-1、4 ℃離心15 min，收集上清液。BCA試劑盒測(cè)定樣品蛋白濃度后，調(diào)整至一定濃度，放置-80 ℃?zhèn)溆谩DS-PAGE電泳：取100 μL的細(xì)胞裂解液加入25 μL的5×Loading buffer，100 ℃沸水浴加熱10 min 以充分變性蛋白。冷卻至室溫后，將蛋白樣品加入10%SDS-PAGE膠的上樣孔內(nèi)，先80 V后120 V恒壓電泳，然后300 mA恒流轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜完畢后，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入一抗GAPDH(1∶1 000)、Smad2(1∶1 000)、TGF-β1(1∶1 000)，4 ℃搖床過夜，二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，ECL顯色并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1P.gingivalis-Exo的物理表征收集P.gingivalis的培養(yǎng)上清液，然后采用超速離心法提取外泌體。透射電子顯微鏡觀察P.gingivalis-Exo，如圖1所示，外泌體形狀如卵圓形或“碟形”的雙層的結(jié)構(gòu)，大小均勻，直徑在100 nm左右(圖1A)。納米粒度儀分析顯示外泌體的粒徑主要分布在130 nm左右(圖1B)。

A：電鏡下觀察P. gingivalis-Exo的形態(tài)；B：Zetasizer Nano分析P. gingivalis-Exo粒徑分布。圖1 P. gingivalis-Exo的物理表征

2.2P.gingivalis-Exo進(jìn)入食管癌細(xì)胞為進(jìn)一步研究P.gingivalis-Exo對(duì)食管癌細(xì)胞的影響，采用共聚焦顯微鏡觀察KYSE-150/KYSE-30細(xì)胞對(duì)P.gingivalis-Exo的攝取情況。P.gingivalis-Exo與食管癌細(xì)胞共培養(yǎng)4 h后，拍照觀察。紅色熒光表示被DIR染色的外泌體，藍(lán)色熒光表示被DAPI染色的細(xì)胞核，合并為明場(chǎng)、紅色熒光、藍(lán)色熒光的疊加圖。結(jié)果顯示，大部分紅色熒光定位在食管癌細(xì)胞胞質(zhì)中，說明P.gingivalis-Exo可以被食管癌細(xì)胞攝取。見圖2。

圖2 食管癌細(xì)胞對(duì)P. gingivalis-Exo的攝取

2.3P.gingivalis-Exo促進(jìn)食管癌的增殖、遷移和侵襲MTT實(shí)驗(yàn)常用于檢測(cè)細(xì)胞活力。MTT結(jié)果表明,與對(duì)照組相比，P.gingivalis-Exo共培養(yǎng)的食管癌細(xì)胞增殖能力顯著增加(P<0.05，圖3A)。采用Transwell法檢測(cè)P.gingivalis-Exo對(duì)食管癌細(xì)胞侵襲能力的影響。結(jié)果表明，與空白對(duì)照組相比，P.gingivalis-Exo共培養(yǎng)組侵襲數(shù)量較多(P<0.05，圖3B)。通過劃痕實(shí)驗(yàn)評(píng)估了P.gingivalis-Exo對(duì)食管癌細(xì)胞遷移能力的影響，從圖3C可以看出，P.gingivalis-Exo處理后，細(xì)胞愈合率明顯加快(P<0.05)，說明P.gingivalis-Exo顯著提高了細(xì)胞的遷移能力。以上結(jié)果表明，P.gingivalis-Exo對(duì)食管癌的增殖、遷移和侵襲具有明顯的促進(jìn)作用。

2.4P.gingivalis-Exo通過TGF-β1/Smad2通路調(diào)控食管癌的增殖、遷移Western blot結(jié)果如圖4所示，與空白對(duì)照組相比，P.gingivalis-Exo處理組的食管癌細(xì)胞TGF-β1、Smad2蛋白表達(dá)呈上升趨勢(shì)，這表明P.gingivalis-Exo對(duì)食管癌細(xì)胞惡性行為的調(diào)控可能與TGF-β1/Smad2通路有關(guān)。

3 討論

P.gingivalis是口腔關(guān)鍵致病菌之一，其含量異常增加能夠?qū)е驴谇晃⑸鷳B(tài)失衡[6]。口腔微生態(tài)失衡不僅能夠引起口腔部分組織破壞，還能夠通過異常免疫反應(yīng)損傷遠(yuǎn)處組織，造成人體多種疾病的發(fā)生和發(fā)展，如慢性牙周炎、呼吸系統(tǒng)疾病、心血管疾病、糖尿病及多種腫瘤等[20-21]。最近的研究表明，P.gingivalis與食管癌的發(fā)生有著密切的關(guān)系[22]。牙齦卟啉單胞菌存在于61%的食管鱗狀細(xì)胞癌組織中，其在癌旁組織中只有12%的患者能夠被檢測(cè)，但在正常人的食管組織中尚未發(fā)現(xiàn)[13]。這說明P.gingivalis在食管癌發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色。然而，目前對(duì)P.gingivalis促進(jìn)食管癌發(fā)生發(fā)展確切的分子機(jī)制尚不清楚。

A：MTT實(shí)驗(yàn)；B：細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)；C：細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。①P<0.05；②P<0.01。圖3 P. gingivalis-Exo對(duì)食管癌惡性生物學(xué)行為的影響

圖4 P. gingivalis-Exo通過TGF-β1/Smad2通路調(diào)控食管癌的增殖、遷移

腫瘤-微環(huán)境在腫瘤進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和治療耐藥中發(fā)揮重要作用。外泌體是一種能被大多數(shù)細(xì)胞分泌的直徑大約為30～150 nm的具有脂質(zhì)雙層膜的微小膜泡。它在體內(nèi)的傳遞具有廣泛性，是細(xì)胞與細(xì)胞間通訊的重要分子，能夠攜帶RNA、DNA、蛋白質(zhì)以及其他信號(hào)分子參與細(xì)胞間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。有研究表明，結(jié)核桿菌分泌的外泌體能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放的促炎因子TNF-α、IL-10、IL-6表達(dá)上升，從而影響巨噬細(xì)胞的免疫功能[23]。在2017年，Jessica探究了P.gingivalis-OMV在炎性免疫細(xì)胞中的作用，發(fā)現(xiàn)P.gingivalis-OMV在體內(nèi)可以募集免疫細(xì)胞，引發(fā)巨噬細(xì)胞中的TNFα、IL-1β和IL-8分泌，從而產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生[24]。本研究通過電鏡、粒徑等物理表征證明成功提取了牙齦卟啉單胞菌來源的外泌體，粒徑約為130 nm，形狀如典型的外泌體“圓碟”狀，這兩種儀器測(cè)得的粒徑差異可能是由于納米粒度儀測(cè)的是外泌體納米粒的水動(dòng)力直徑，略大于電鏡的結(jié)果。采用共聚焦顯微鏡觀察到了DIR標(biāo)記的外泌體可以進(jìn)入細(xì)胞并通過MTT、Transwell、劃痕等體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了P.gingivalis-Exo對(duì)食管癌細(xì)胞的增殖、遷移具有顯著的促進(jìn)作用。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β (TGF-β) 信號(hào)通路在生物體和胚胎發(fā)育過程中起著至關(guān)重要的作用。它們協(xié)調(diào)著許多細(xì)胞過程，包括細(xì)胞增殖、分化、遷移和侵襲等[25-26]。大量的文獻(xiàn)報(bào)道了TGF-β與腫瘤的發(fā)生進(jìn)展有一定的關(guān)系，可以促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[27-29]。其中TGF-β1/Smad信號(hào)通路是TGF發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的主要通路。Smads蛋白是目前所知的唯一的TGF-β受體的胞內(nèi)激酶底物。研究已經(jīng)證實(shí)Smad2是TGF-β/Smads通路中一個(gè)關(guān)鍵的分子[30-31]。為了進(jìn)一步探究P.gingivalis-Exo對(duì)食管癌的作用機(jī)制，通過Western Blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組相比，P.gingivalis-Exo處理后TGF-β1、Smad2蛋白表達(dá)明顯上升，這說明P.gingivalis-Exo可能通過調(diào)控TGF-β1/Smad2通路來促進(jìn)食管癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，本文首次以P.gingivalis-Exo為對(duì)象，探討了P.gingivalis-Exo對(duì)食管癌細(xì)胞惡性行為的調(diào)控。通過MTT、Transwell、劃痕和Western blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了P.gingivalis-Exo在體外促進(jìn)食管癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并初步探究了P.gingivalis-Exo對(duì)食管癌的影響機(jī)制，這些發(fā)現(xiàn)為治療食管癌提供了一個(gè)新的思路，但是P.gingivalis-Exo對(duì)食管癌調(diào)控的具體分子機(jī)制還有待深入研究。