牙齦卟啉單胞菌促進(jìn)4NQO誘導(dǎo)C57BL/6鼠食管鱗癌發(fā)生

劉其偉，許海軍，焦葉林，阮豪杰，陳 攀，谷變利，齊義軍，高社干

中國每年新增食管癌患者占全球一半以上，組織學(xué)上，食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)占所有食管癌的90%以上[1]。由牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis,P.gingivalis)誘發(fā)的宿主口腔微生態(tài)失衡不僅是慢性牙周炎和牙齒脫落的主要原因之一[2-3]，還與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4-5]。由于缺乏特異、敏感的早期診斷手段及分子標(biāo)志物，目前中國確診的大部分食管癌(Esophageal cancer, EC)患者已發(fā)展至中晚期，導(dǎo)致預(yù)后極差[6]。近期研究表明口腔關(guān)鍵致病菌P.gingivalis、具核梭桿菌與ESCC分化、腫瘤轉(zhuǎn)移、化療耐藥、預(yù)后不良等臨床病理特征相關(guān)，但其詳盡的分子機(jī)制并不十分清楚[7-8]。本實(shí)驗(yàn)以4-硝基喹啉-1-氧化物(4-nitroquinoline 1-oxide，4NQO)誘導(dǎo)的C57BL/6鼠ESCC模型為基礎(chǔ)[9-10]，磨牙絲線結(jié)扎和P.gingivalis感染制備慢性牙周炎模型，明確P.gingivalis在ESCC模型鼠食管腫瘤發(fā)生過程中的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組120只6周齡C57BL/6雄鼠購自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，分為對照組、溶劑對照組、4NQO組和4NQO聯(lián)合P.gingivalis組等4組，每組各30只。120只鼠進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)1周后，飲水中抗生素(甲硝唑、新霉素、氨芐青霉素和萬古霉素)處理2周，4NQO組和4NQO聯(lián)合P.gingivalis組飲水中50 μg·mL-14NQO處理8周。8周后對照組、溶劑對照組、4NQO組正常喂養(yǎng)，4NQO聯(lián)合P.gingivalis組小鼠上頜第二磨牙絲線結(jié)扎，P.gingivalis持續(xù)感染。實(shí)驗(yàn)過程中，于22、26、30、34周等4個(gè)時(shí)間點(diǎn)分批處死小鼠，每次每組至少6只。

1.2 試劑使用及配制鼠飲水中甲硝唑、新霉素、氨芐青霉素濃度為0.2 g·L-1，萬古霉素濃度為0.1 g·L-1。4NQO試劑(Sigma，貨號N8141)，丙二醇(阿拉丁，貨號P103433)。0.5 g 4NQO粉劑溶于100 mL 1,2-丙二醇，配制溶度為5 mg·mL-1儲(chǔ)存液，4 ℃避光保存。小鼠飲水中4NQO終濃度為50 μg·mL-1。

1.3 C57BL/6小鼠牙周炎模型建立20%烏拉坦溶液(Sigma，貨號U2500-100G)，按小鼠體質(zhì)量6 μL·g-1給藥，于顯微鏡下分別對小鼠左右上頜第二磨牙進(jìn)行絲線結(jié)扎。取對數(shù)生長期P.gingivalis(OD 600吸光度1-1.7)，2 000 r·min-1離心10 min，2%羧甲基纖維素溶解P.gingivalis，濃度為2×1010·mL-1，取菌液50 μL涂抹于小鼠上頜磨牙區(qū)，隔天涂抹，連續(xù)涂抹2周后，每周涂抹2次。牙周炎建模完成后，分別于第14、18、24周連續(xù)對小鼠口腔進(jìn)行拭子取樣檢測P.gingivalis。

1.4 小鼠飼養(yǎng)及樣本采集實(shí)驗(yàn)過程中鼠房溫度為26 ℃，記錄小鼠進(jìn)食、飲水、糞便、毛發(fā)以及活動(dòng)度、精神狀態(tài)等，于22、26、30、34周對小鼠進(jìn)行稱重、記錄。于第22、26、30、34周等4個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別處死小鼠，每組至少6只，處死前對小鼠稱重、口腔拭子取樣，食管離體后沿縱軸剪開，觀察并記錄食管黏膜表面病變。實(shí)驗(yàn)各組小鼠食管組織一半放置于福爾馬林溶液固定后脫水、包埋、切片，HE染色，另一半-80 ℃保存。

1.5 數(shù)據(jù)處理采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，腫瘤面積采用Adobe Photoshop圖像處理軟件圈定，依據(jù)直尺刻度、按像素?fù)Q算腫瘤面積大小，腫瘤病變面積比較采用t檢測，小鼠體質(zhì)量變化比較采用方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)過程中小鼠體質(zhì)量變化圖1顯示22、26、30、34周時(shí)各組小鼠處死時(shí)的體質(zhì)量，其中對照組和溶劑對照組在各時(shí)間點(diǎn)上平均體質(zhì)量變化不明顯，平均約30 g；26周時(shí)4NQO組和4NQO聯(lián)合P.gingivalis組體質(zhì)量開始下降，隨著實(shí)驗(yàn)進(jìn)展，這兩組小鼠體質(zhì)量逐漸降低，34周時(shí)降至最低；4組實(shí)驗(yàn)鼠中，4NQO聯(lián)合P.gingivalis組降低尤其顯著，體質(zhì)量最輕，實(shí)驗(yàn)結(jié)束平均體質(zhì)量為23.54 g。

圖1 22周、26周、30周和34周時(shí)各組實(shí)驗(yàn)鼠處死時(shí)小鼠體質(zhì)量

2.2 食管黏膜表面動(dòng)態(tài)變化于22周時(shí)，4NQO組和4NQO聯(lián)合P.gingivalis組小鼠食管黏膜上皮粉紅色、粗糙、不規(guī)則乳頭狀增生，灶性分布，隨著實(shí)驗(yàn)進(jìn)展，上述病變逐漸加重；4NQO聯(lián)合P.gingivalis組小鼠的病變較4NQO單純處理組嚴(yán)重，灶性分布的乳頭狀增生數(shù)目最多，實(shí)驗(yàn)結(jié)束34周時(shí)病變最明顯。對照組和溶劑對照組小鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，食管黏膜表面光滑、粉紅色、黏膜下血管紋理清晰，見圖2。

2.3 食管黏膜組織學(xué)動(dòng)態(tài)變化食管組織HE染色可見，22、26、30、34周等4個(gè)時(shí)間點(diǎn)對照組和溶劑對照組上皮完整，基底細(xì)胞大小均一、排列整齊，未見明顯細(xì)胞增生。22周時(shí)，4NQO組和4NQO聯(lián)合P.gingivalis組鼠食管黏膜上皮開始增厚，基底細(xì)胞開始出現(xiàn)彌漫性增生；26周時(shí)，4NQO聯(lián)合P.gingivalis組鼠基底細(xì)胞出現(xiàn)灶性不典型增生，細(xì)胞層次增多，排列紊亂，極性消失，黏膜表面角化層出現(xiàn)灶性缺失，隨著實(shí)驗(yàn)進(jìn)展，不典型增生細(xì)胞增生為乳頭狀，突出于黏膜表面，黏膜表面角化層灶性缺失范圍增大。4NQO聯(lián)合P.gingivalis組小鼠的上述各種病變均較4NQO單純處理組嚴(yán)重。實(shí)驗(yàn)36周結(jié)束時(shí)，4NQO聯(lián)合P.gingivalis組小鼠可見體積增大的癌細(xì)胞、排列不規(guī)則、異型性明顯，癌變細(xì)胞浸潤至肌層。

圖2 22周、26周、30周和34周時(shí)各組實(shí)驗(yàn)鼠食管黏膜表面變化

圖3 22周、26周、30周和34周時(shí)各組實(shí)驗(yàn)鼠食管組織學(xué)變化(HE, ×100)

2.4 食管黏膜病變面積和發(fā)病率實(shí)驗(yàn)各組小鼠食管拭子Q-PCR檢測P.gingivalis感染及豐度，發(fā)現(xiàn)4NQO聯(lián)合P.gingivalis組內(nèi)11只鼠，5只P.gingivalis陽性，鼠食管表面生物膜中P.gingivalis平均量為2.04×104。該組內(nèi)P.gingivalis陽性小鼠食管黏膜病變面積明顯大于陰性鼠(圖4A)，陽性鼠肉眼見發(fā)病率也明顯高于P.gingivalis陰性鼠(圖4B)；4NQO聯(lián)合P.gingivalis組中P.gingivalis陽性小鼠食管黏膜病變面積(圖4C)和病變發(fā)生率(圖4D)也顯著高于4NQO組鼠。

3 討論

流行病學(xué)研究證實(shí)，約15%～20%的腫瘤起源于感染相關(guān)的慢性炎癥。慢性炎癥病灶微環(huán)境含有大量的氧自由基、細(xì)胞因子和生長因子，刺激局部細(xì)胞增殖，誘發(fā)細(xì)胞基因組不穩(wěn)定，使正常細(xì)胞逐步發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。

目前觀點(diǎn)認(rèn)為，人體各組織器官微生物群體，即微生態(tài)，是機(jī)體罹患疾病的重要原因之一[11]。人體消化道微生態(tài)紊亂不僅能夠引起口腔局部組織的破壞，還能夠調(diào)控免疫反應(yīng)損傷遠(yuǎn)處組織，誘發(fā)多種疾病的發(fā)生和進(jìn)展，如慢性牙周炎、心血管疾病、多種腫瘤[12]。正常食管微生物組由鏈球菌等革蘭氏陽性菌為主的菌群構(gòu)成，而Barrett’s食管和食管炎組織的微生物組轉(zhuǎn)變?yōu)楦锾m氏陰性菌為主[13]。口腔微生態(tài)中有超過700種不同的細(xì)菌，ESCC患者口腔唾液中微生物多樣性降低，Prevotella、Streptococcus和Porphyromonas屬細(xì)菌豐度明顯增高[14]。另一項(xiàng)前瞻性研究表明，口腔唾液中P.gingivalis高豐度與ESCC患病風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)[15]。中國食管癌高發(fā)區(qū)ESCC組織中P.gingivalis豐度明顯高于癌旁組織，并且與癌細(xì)胞分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期和ESCC 患者生存期縮短顯著正相關(guān)[12]。上述研究表明：P.gingivalis可能是 ESCC發(fā)生發(fā)展的重要致病因素之一。

4NQO誘使DNA形成加合物，導(dǎo)致腺嘌呤和鳥嘌呤堿基替換。通過飲水給予模型鼠不同濃度4NQO，28周后能夠成功誘導(dǎo)大鼠和小鼠口腔及食管發(fā)生癌變，該模型已成功用于EC化學(xué)預(yù)防藥物的研究。50 μg·mL-14NQO飲水喂飼C57BL/6鼠8周，100%口腔和33%食管黏膜組織發(fā)生病變，100 μg·mL-14NQO飲水喂飼16周，100%口腔和食管均發(fā)生病變[16]。在此基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用50 μg·mL-14NQO飲水喂飼C57BL/6鼠8周后，磨牙絲線結(jié)扎制備慢性牙周炎模型，并給予P.gingivalis口腔局部涂抹，模擬人口腔P.gingivalis慢性持續(xù)感染。通過Q-PCR檢測食管黏膜生物膜中P.gingivalis感染，發(fā)現(xiàn)4NQO聯(lián)合P.gingivalis組中小鼠P.gingivalis感染率約為45.5%，證實(shí)口腔P.gingivalis可經(jīng)吞咽至食管。22周時(shí)，4NQO組和4NQO聯(lián)合P.gingivalis組鼠食管黏膜病變開始逐步形成，隨著P.gingivalis持續(xù)作用，病變逐漸加重；36周實(shí)驗(yàn)終止時(shí)，4NQO聯(lián)合P.gingivalis組3只小鼠發(fā)生癌變。實(shí)驗(yàn)過程中各時(shí)間點(diǎn)，4NQO聯(lián)合P.gingivalis組小鼠食管黏膜病變面積和發(fā)病率均高于單純4NQO處理組，表明P.gingivalis能夠促進(jìn)4NQO誘導(dǎo)的食管黏膜增生及癌變。與本實(shí)驗(yàn)類似，4NQO(8周)聯(lián)合P.gingivalis和具核梭桿菌(18周)處理Balb/c雄鼠，發(fā)現(xiàn)P.gingivalis和具核梭桿菌顯著增加口腔舌黏膜病變嚴(yán)重程度和舌鱗癌發(fā)生率，并闡明這兩種細(xì)菌激活的IL-6/STAT3信號通路參與了舌鱗癌的發(fā)生發(fā)展過程[17]。

圖4 4NQO組和4NQO聯(lián)合P. gingivalis組內(nèi)(A、B)及組間(C、D)P. gingivalis陽性和陰性鼠食管黏膜病變面積(A、C)及發(fā)病率(B、D)

本研究在4NQO誘導(dǎo)食管黏膜病變的基礎(chǔ)上，通過上頜磨牙絲線結(jié)扎和P.gingivalis感染制備慢性牙周炎模型，證實(shí)P.gingivalis能夠促進(jìn)4NQO誘發(fā)的病變進(jìn)展至癌變，為深入探討P.gingivalis促進(jìn)ESCC發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制和分子治療靶點(diǎn)提供了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。