低溫微生物及其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用研究進(jìn)展

王奕，宮春杰

（湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，湖北武漢430086）

寒冷脅迫在地球生態(tài)系統(tǒng)中普遍存在，90%的海洋溫度在5℃以下，如果包括陸地，約80%的地球生物圈處于永久性寒冷中[1]。微生物在這些寒冷環(huán)境中占據(jù)主體生態(tài)地位，特別是細(xì)菌，還有古生菌、酵母、藍(lán)藻和原核生物，此外，微藻類和病毒也很常見[2]。1887年，首次發(fā)現(xiàn)微生物在0 ℃下具備生長能力，科學(xué)家定義了和低溫微生物有關(guān)的概念，并將其分為嗜冷微生物和耐冷微生物兩大類：嗜冷微生物最適生長溫度≤15 ℃，最高生長溫度≤20 ℃，且生存于海洋、極地和冰川等永久性低溫環(huán)境中；耐冷微生物在接近冰點(diǎn)時生長良好，最高生長溫度可以超過20 ℃，與嗜冷微生物不同，耐冷菌廣泛分布于自然環(huán)境和食物中[3]。低溫微生物廣泛分布于農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中，在植物中發(fā)揮著固氮、促進(jìn)植物生長和減輕寒冷脅迫等功能，因其促進(jìn)植物生長和產(chǎn)活性酶的能力受到科學(xué)界廣泛關(guān)注，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[4]。

1 低溫微生物的適冷機(jī)制概述

溫度對微生物生存有很大影響，低溫會降低細(xì)胞膜流動性和代謝速率、降低核酸二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性而影響DNA復(fù)制和mRNA轉(zhuǎn)錄及翻譯，甚至導(dǎo)致死亡。低溫微生物能在低溫環(huán)境中生存和生長，主要因具有其他細(xì)菌不存在的生理機(jī)制，使得低溫微生物能很好地適應(yīng)低溫環(huán)境脅迫，這些機(jī)制包括：（1）增加細(xì)胞膜流動性；（2）降低細(xì)胞質(zhì)水相的凝固點(diǎn)和大分子的穩(wěn)定性；（3）通過冷休克蛋白和冷馴化蛋白降低細(xì)胞對溫度的反應(yīng)；（4）通過過氧化氫酶、過氧化物酶、超氧化物歧化酶和氧化還原酶保護(hù)細(xì)胞免受活性氧損傷，并保持低溫下較高的催化效率[5]。

2 低溫微生物在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的研究進(jìn)展

低溫微生物已被證明在食品、醫(yī)藥、環(huán)境保護(hù)、紡織等多個領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，可以通過應(yīng)用于各個領(lǐng)域提高人類的生活質(zhì)量等。同時，低溫微生物廣泛分布于農(nóng)畜牧業(yè)領(lǐng)域，引起了很多學(xué)者的興趣。

2.1 低溫微生物促進(jìn)植物生長

低溫影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，低溫下接種具有多種促進(jìn)植物生長的高效微生物可能成為促進(jìn)作物生產(chǎn)的方法之一。有研究表明，微生物具有緩解植物冷脅迫方面的作用[4]。這些微生物通過生長素、細(xì)胞分裂素等植物激素的合成，磷、鐵和鋅的增溶，鐵載體的合成，1-氨基環(huán)丙烷1-羧酸轉(zhuǎn)氨酶的活性和對抗有害微生物等途徑對植物生長產(chǎn)生影響。有報道表明[6]，接種某些微生物后，植物對非生物脅迫的耐受性基因上調(diào)。許多桿菌菌株表現(xiàn)出促植物生長（PGP）活性，并有大量被開發(fā)為生物特異性的植物生長促進(jìn)劑和殺菌劑。在冷適應(yīng)植物生長促進(jìn)菌株中，假單胞桿菌和微小桿菌具有明顯促生長功能，且均來自低溫環(huán)境。近年來，耐冷型植物生長促進(jìn)菌被用來改善植物低溫脅迫。從印度西北部喜馬拉雅山脈寒冷沙漠中分離出了低溫下具有PGP活性的菌株，有望為山地農(nóng)業(yè)開發(fā)有效的植物生長促進(jìn)劑。除此之外，這些菌株還表現(xiàn)出對低pH和高pH以及高鹽濃度的耐受性，說明能在酸性土壤和鹽堿土壤的丘陵山區(qū)作為微生物接種劑發(fā)揮作用[4]。

植物的非生物脅迫對世界各地的谷類作物生產(chǎn)造成了重大威脅，冷脅迫是導(dǎo)致小麥生長緩慢和產(chǎn)量下降的原因之一。科學(xué)家從青藏高原極端根際環(huán)境中分離到嗜冷的植物生長促進(jìn)菌：芽孢桿菌CJCL12和芽孢桿菌RJGP41，通過接種這種嗜冷的植物生長促進(jìn)菌來緩解植物的低溫脅迫。研究中發(fā)現(xiàn)，冷脅迫下接種菌對植物生長的促進(jìn)作用是緩解低溫脅迫、擁有促進(jìn)植物生長基因和調(diào)節(jié)重要植物激素表達(dá)的累積效應(yīng)[7]。

除應(yīng)用于促進(jìn)植物生長的細(xì)菌，科學(xué)家從墨西哥西南特卡特爾火山根際土壤中分離到8株酵母菌，首次使用嗜冷/耐冷酵母作為植物生長促進(jìn)微生物的進(jìn)行研究，并用番茄作為實(shí)驗(yàn)對象，接種這些酵母菌株。結(jié)果表明，在15℃的培養(yǎng)條件下，有些接種菌的番茄植株比未接種的植株表現(xiàn)得更好，這為冷環(huán)境中以植物生長促進(jìn)菌作為添加劑提供了新的可能性[8]。

2.2 低溫微生物與病害防治

低溫微生物除了能通過各種途徑緩解植物的低溫脅迫等非生物脅迫，還能緩解植物的生物脅迫，如對抗病原菌。在秘魯喀喀湖附近的兩個海拔超過3 900 m地區(qū)，芽孢桿菌在當(dāng)?shù)伛R鈴薯的根際定植，并抑制真菌類植物病原體（水稻紋枯病菌和茄腐鐮刀菌）的生長；從秘魯和玻利維亞的安第斯山脈中部高地不同海拔高度的土豆根際分離到的芽孢桿菌，既能促進(jìn)馬鈴薯的離體生長和發(fā)育，又能夠保護(hù)植株免受水稻紋枯病菌感染。從低溫環(huán)境中分離出木霉菌的拮抗菌株，發(fā)現(xiàn)木霉菌也可以提高植物對病原菌的抗性[9]。

有些低溫微生物被發(fā)現(xiàn)是對植物生長有益的，也有對植物生長產(chǎn)生有害作用的，如病原菌。北方菌核真菌是一種寄主范圍廣、環(huán)境持久性的壞死性植物病原真菌，最適生長溫度在4～10 ℃，在積雪覆蓋的情況下感染植物，引起植物雪霉病。Mardanov等[10]對一株菌核病原菌和兩株灰霉病菌進(jìn)行了基因序列分析，發(fā)現(xiàn)其中有與植物細(xì)胞壁降解有關(guān)的基因。因此，研究引起植物生物脅迫的低溫病原菌并發(fā)現(xiàn)其致病機(jī)制，有益于發(fā)現(xiàn)新的生物防治方法。

2.3 對農(nóng)畜牧產(chǎn)品生產(chǎn)的影響

20世紀(jì)以來，人們開始研究乳制品中腐敗微生物。1960年，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)一株嗜冷的名為色素細(xì)菌的革蘭氏陰性菌，這種菌是引起冷藏、巴氏殺菌零售牛奶和奶制品中發(fā)生紫色變色的病原菌，且被分離出來的色素細(xì)菌在56℃下暴露5 min即可被殺死，說明來自該色素細(xì)菌的污染是在巴氏殺菌之后產(chǎn)生的[11]。

生牛奶營養(yǎng)豐富，酸堿中性，為微生物生長提供了理想條件。原料奶通常貯存在低溫環(huán)境下，以減緩或遏止細(xì)菌的生長，但嗜冷菌能夠在低溫環(huán)境下繁殖，令超高溫處理的奶類及其他奶制品變質(zhì)。嗜冷菌的存在對乳制品工業(yè)形成了極大挑戰(zhàn)。有些嗜冷菌能產(chǎn)生肽酶和脂肪酶等胞外耐熱酶，大多數(shù)嗜冷菌能在各種牛奶貯存和加工設(shè)備上形成生物膜，保護(hù)自身免受乳制品加工環(huán)境中消毒等應(yīng)激條件的影響。低溫有利于胞外多糖的產(chǎn)生，增加生物膜形成的可能性。生物膜可能導(dǎo)致設(shè)備損壞、產(chǎn)品腐敗，從而增加能源成本，甚至可能導(dǎo)致交叉污染和人體食源性疾病感染。原料奶中的嗜冷細(xì)菌，一般包括假單胞菌屬、不動桿菌屬、沙雷氏菌屬、芽孢桿菌屬、乳球菌屬和葡萄球菌屬。其中，假單胞菌是從冷牛奶中分離出來的最常見的污染菌[12]。

真空包裝冷卻肉也是畜牧產(chǎn)品中重要的一大類。真空包裝冷卻肉中微生物發(fā)酵產(chǎn)生的氣體導(dǎo)致包裝膨脹，通常被稱為吹制包裝，這種特征在一些耐冷和嗜冷的梭狀芽孢桿菌中也被證明。一些能產(chǎn)生CO2的菌種，如大腸桿菌、沙雷氏菌、哈夫尼亞菌和蘭氏菌也可能起作用，這類型微生物產(chǎn)生的惡劣影響在許多國家都有報道[13]。

2.4 在生物技術(shù)研究領(lǐng)域的應(yīng)用潛力

低溫微生物在生物技術(shù)研究中也有廣泛的應(yīng)用潛力?？茖W(xué)家將嗜冷微生物（Psychromonasingrahamii）的絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶在大腸桿菌中異源表達(dá)并純化，發(fā)現(xiàn)其在低溫下具有較高的特異活性，是一種更有效的生物催化劑。羥甲基氨基酸是藥物、農(nóng)藥和食品添加劑合成中的重要化合物，表明該種嗜冷微生物可能是一種具有生物技術(shù)應(yīng)用潛力的酶來源[14]。嗜冷酵母也是其作為冷活性酶的重要來源，還有用于生物修復(fù)的潛力[15]。Lin等[16]分離到一株耐冷石油降解菌，該菌可能優(yōu)先代謝短鏈烷烴，并能以混合油或減壓油作為唯一碳源和能源，特別是在寒冷污染環(huán)境中具有潛在的生物技術(shù)的開發(fā)利用價值，在污染農(nóng)田的生物修復(fù)領(lǐng)域具有一定應(yīng)用潛力。Silva等[13]從3種來自南極大陸的色素細(xì)菌中提取并測試了色素，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)色素在紫外光照射下具有很高的抗氧化活性和良好的穩(wěn)定性，該項(xiàng)工作中鑒定出的類胡蘿卜素，為探索具有高活性、低毒性、無殘留、無環(huán)境風(fēng)險和易分解的天然色素及其應(yīng)用提供了機(jī)會。

3 展望

極端環(huán)境蘊(yùn)藏的微生物具有多樣性特征，可能是全球遺傳資源維護(hù)和保存的基礎(chǔ)。在低溫環(huán)境中就有各類適應(yīng)低溫生長的菌株被發(fā)現(xiàn)和研究。

（1）具有耐冷特性并促進(jìn)植物生長的微生物，在丘陵和山地等高海拔土壤農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中的應(yīng)用前景巨大。使用這種微生物接種劑既能減少使用能源密集型化學(xué)肥料，又能使植物對低溫脅迫的耐受性變得更加顯著，從而減少作物損失。相較于農(nóng)用化學(xué)品，這種微生物接種劑對環(huán)境更為友好[8]。在探索基于微生物培養(yǎng)的新技術(shù)以提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中，促進(jìn)植物生長的微生物的生態(tài)適應(yīng)性等因素很重要。已有研究表明，微生物菌株促進(jìn)植物生長的能力大小受植物種類、土壤特性、氣候條件、其他微生物的捕食行為以及與更適應(yīng)環(huán)境的本地微生物的競爭行為等多種因素影響[9]。所以，為了更好地應(yīng)用這些環(huán)境友好型生物產(chǎn)品，還需要進(jìn)行更多的有關(guān)方面研究。

（2）具有病原對抗性的低溫微生物，可以對其進(jìn)行研究并將其應(yīng)用為低溫環(huán)境下作物對抗病原菌的生物防治劑。對于耐冷致病菌，特別是目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的致病菌，對其致病機(jī)制的研究有利于提出好的防治措施等。

（3）腐敗會對肉類工業(yè)和乳制品工業(yè)造成損害。原料奶中細(xì)菌污染來源的多樣性使得控制原料奶的污染和產(chǎn)生的酶變得極為困難。一旦嗜冷菌耐熱水解酶形成，通過加熱來降低其活性是非常困難的，降低酶活并限制其分泌仍是一個巨大的挑戰(zhàn)。另一種控制腐敗的方法是通過限制嗜冷細(xì)菌在生牛奶中的生長來防止耐熱酶的產(chǎn)生。目前，關(guān)于這些微生物中肽酶和脂肪酶的產(chǎn)生和活性控制還沒有具體的解決辦法。在擠奶和牛奶加工過程中實(shí)施良好的衛(wèi)生措施仍然是避免嗜冷菌交叉污染的最佳途徑。對真空包裝冷卻肉來說，控制包裝肉的酸堿度，并準(zhǔn)確保持理想的貯存溫度，可使變質(zhì)問題減至最低[15]。為了更好地解決這些問題，畜牧產(chǎn)品中低溫微生物引起的腐敗問題需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié)語

低溫微生物在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、食品制造等方面具有巨大的應(yīng)用潛力。利用好低溫微生物的特殊產(chǎn)物和功能是人們應(yīng)該思考的問題。低溫微生物在低溫條件下的長期進(jìn)化不僅能為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來益處，也會在醫(yī)藥、環(huán)保、科研等領(lǐng)域?yàn)槿祟惿鐣陌l(fā)展作出貢獻(xiàn)。