用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建dXPR1的果蠅突變體品系

王睿龍，牛曉曉，金珊

(湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430062)

0 引言

人類原發(fā)型家族性腦鈣化(primary familial brain calcification，PFBC)是一種罕見的常染色體遺傳疾病.其定義為至少兩個(gè)大腦豆?fàn)詈耸艿解}化的影響.鈣化還可能會(huì)出現(xiàn)在小腦、尾狀核、腦白質(zhì)、皮質(zhì)溝、丘腦及齒狀核等地方[1].PFBC的臨床癥狀有許多，最常見的為精神病、運(yùn)動(dòng)障礙(movement disorders，MD)及認(rèn)知障礙等.目前發(fā)現(xiàn)有四個(gè)相關(guān)的致病基因，分別為SLC20A2、PDGFRB、PDGFB和XPR1.XPR1是唯一已知的人類磷酸鹽輸出蛋白[2-3].XPR1一個(gè)由696個(gè)氨基酸構(gòu)成的多重跨膜蛋白，此蛋白為小鼠異嗜性小鼠白血病病毒受體.果蠅作為一種科學(xué)研究中常用的模式生物，其基因背景已經(jīng)被研究清楚，使得運(yùn)用果蠅在模擬人類遺傳疾病方面更加方便與高效.據(jù)了解在果蠅中XPR1對(duì)應(yīng)的同源基因?yàn)镃G10483(dXPR1)，同源性高達(dá)55%.因此我們擬以果蠅為模型探究XPR1基因的功能.本實(shí)驗(yàn)室曾構(gòu)建過3株XPR1的移碼突變的果蠅，但突變果蠅在實(shí)驗(yàn)中表型相反，沒有說服力與可參考性.因此，我們擬用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，設(shè)計(jì)兩個(gè)sgRNA在dXPR1基因兩端切割，構(gòu)建出dXPR1大片段缺失的果蠅即dXPR1-，以確定XPR1基因的功能及對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的影響.

CRISPR/Cas9系統(tǒng)最初是人們?cè)诩?xì)菌防御系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的.其中短回文重復(fù)序列間隔的有規(guī)律聚合(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)基因于1987年在大腸桿菌中首次發(fā)現(xiàn).21世紀(jì)初，在原核生物中發(fā)現(xiàn)CRISPR相關(guān)蛋白(CRISPR-associated (Cas) proteins)[4-7].如今CRISPR/CAS9系統(tǒng)作為定向靶序列基因編輯技術(shù)廣泛應(yīng)用于生物各個(gè)領(lǐng)域.起初在該系統(tǒng)中，外源DNA與crRNA(CRISPR RNA)有20個(gè)配對(duì)的堿基對(duì)引導(dǎo)Cas9核酸內(nèi)切酶識(shí)別靶向序列，再與tracer RNA(trans-acting crRNA)結(jié)合引導(dǎo)Cas9核酸內(nèi)切酶進(jìn)行切割[8-10].現(xiàn)在，人們將過程簡(jiǎn)化，把crRNA和tracrRNA轉(zhuǎn)變?yōu)樵O(shè)計(jì)一條sgRNA(single guide RNA)引導(dǎo)Cas9酶切割.在設(shè)計(jì)sgRNA時(shí)sgRNA的5’端的20個(gè)堿基為引導(dǎo)序列，需要注意的是在其3’端要有一個(gè)PAM(protospacer adjacent motif)序列，Cas9酶可以識(shí)別PAM序列并在此序列上游第三個(gè)堿基的5’端切割.我們通常用的PAM序列為NGG，NAG或GAA也有研究證明可作為PAM序列[11-13].在Cas9內(nèi)切酶切割后會(huì)產(chǎn)生DSB(double strand break)，之后生物體會(huì)產(chǎn)生兩種DSB修復(fù)方式：NHEJ(nonhomologous end joining)和HDR(homology-directed)[14-15].生物體利用NHEJ修復(fù)方式可得到移碼突變與氨基酸缺失的品系，而利用HDR修復(fù)方式，同時(shí)提供供體序列(Donor)可用來構(gòu)建點(diǎn)突變果蠅，插入特定基因果蠅等轉(zhuǎn)基因品系果蠅.

本實(shí)驗(yàn)室利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，擬構(gòu)建完全或大片段缺失的dXPR1-的果蠅品系.果蠅研究者Gratz等通過顯微注射，得到了表達(dá)Cas9酶的質(zhì)粒的果蠅[16-17].在前人研究的基礎(chǔ)上我們要構(gòu)建大片段缺失的果蠅品系，只需在距離dXPR1基因前600堿基序列與距離基因末端500堿基序列中分別設(shè)計(jì)兩條sgRNA，將設(shè)計(jì)并構(gòu)建好的sgRNA表達(dá)載體質(zhì)粒注射入表達(dá)Cas9酶的質(zhì)粒的果蠅卵中，引導(dǎo)Cas9內(nèi)切酶切割便可以得到dXPR1基因大片段缺失的果蠅品系dXPR1-.

1 材料與方法

1.1 果蠅品系表達(dá)Cas9內(nèi)切酶于果蠅生殖腺的果蠅品系BL54591(nos-Cas9)和常用balancer果蠅MKRS/TM6B.

1.2 載體在本實(shí)驗(yàn)中我們使用的sgRNA表達(dá)載體為pCDF-3.此質(zhì)粒來自Addgene公司，環(huán)狀，大小6 284 bp，帶有BbsⅠ酶切位點(diǎn).

1.3 抗體見表1.

表1 本研究所用抗體

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 sgRNA的設(shè)計(jì) 本實(shí)驗(yàn)預(yù)計(jì)在dXPR1基因的前600堿基與距離基因末端500堿基各設(shè)計(jì)一對(duì)sgRNA，兩對(duì)sgRNA的距離盡可能遠(yuǎn)，使目的基因缺失的片段更多，sgRNA序列的設(shè)計(jì)在CRISPR optimal target finder(http://tools.flycrispr.molbio.wisc.edu/targetFinder/)上設(shè)計(jì)完成，之后在設(shè)計(jì)好的sgRNA5’端加上BbsⅠ酶切位點(diǎn)，再交由生物公司合成兩對(duì)帶有BbsⅠ酶切位點(diǎn)的單鏈sgRNA.

1.4.2 sgRNA表達(dá)載體的構(gòu)建 用BbsⅠ內(nèi)切酶切割pCDF3質(zhì)粒，膠回收得到有BbsⅠ粘性末端的線性pCDF3.將合成的兩對(duì)sgRNA復(fù)性得到有BbsⅠ粘性末端的短片段雙鏈DNA，將之與切過的pCDF3酶聯(lián)，轉(zhuǎn)化接入大腸桿菌中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng).最后篩選得到連入有sgRNA的pCDF3質(zhì)粒，并質(zhì)粒中提得到高濃度sgRNA表達(dá)載體.

1.4.3 顯微注射 進(jìn)行顯微注射，方法參考Yu等[18].將兩對(duì) sgRNA表達(dá)載體混勻稀釋到注射濃度，將其注射入nos-Cas9果蠅的胚胎中(胚胎發(fā)育時(shí)間不要超過1 h).將注射得到的成蟲與MKRS/TM6B進(jìn)行單只雜交，然后PCR鑒定子代果蠅，將鑒定有轉(zhuǎn)基因果蠅的果蠅培育管中的所有子代果蠅再次與MKRS/TM6B進(jìn)行單只雜交，再次鑒定得到dXPR1-突變體果蠅(見圖一).

圖1 顯微注射流程

1.4.4 免疫印跡 取等量dXPR1-突變體與野生型成蟲頭，分別加入RIPA裂解液和一定量蛋白酶抑制劑放置于冰上進(jìn)行研磨，離心取上清，測(cè)蛋白濃度，配上樣液.在37 ℃水浴鍋中水浴30 min，然后上樣跑電泳，轉(zhuǎn)膜(將蛋白膜轉(zhuǎn)移到PVDF膜上)，接著用PBST配5% 的脫脂奶粉進(jìn)行封閉1 h，染一抗(Anti-CG10483)室溫?fù)u30 min在4 ℃過夜，洗一抗1 h每15 min用PBST洗一次，染二抗常溫2 h，洗二抗1 h，最后曝光.

2 結(jié)果

2.1 sgRNA表達(dá)載體的構(gòu)建本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了兩條sgRNA以確保造成dXPR1基因的大片段缺失，第一條sgRNA在dXPR1基因上匹配序列為從579位堿基到598位堿基，第二條sgRNA序列從3180位堿基到3199位堿基.將兩條sgRNA分別插入pCDF3表達(dá)載體中，測(cè)序(見圖2).

圖2 sgRNA的設(shè)計(jì)及表達(dá)載體的構(gòu)建

2.2 獲得dXPR1-突變體果蠅將中提得到的兩對(duì)高濃度sgRNA表達(dá)載體稀釋到一定量后混勻注射入nos-Cas9果蠅的卵中，注射產(chǎn)生的后代與MKRS/TM6B果蠅單只雜交產(chǎn)生F1代果蠅，dXPR1基因全長(zhǎng)為3 412 bp.在dXPR1基因前后兩端設(shè)計(jì)檢測(cè)引物PCR鑒定F1代果蠅，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組只有一條3 000 多bp大小的條帶，而F1代果蠅中PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)有條帶為500 bp左右，符合預(yù)期，經(jīng)測(cè)序確實(shí)為dXPR1基因的大片段缺失，其缺失片段從573位堿基到3201位堿基.再將F1代突變體果蠅管中的其他雄果蠅與MKRS/TM6B果蠅進(jìn)行單只雜交，再進(jìn)行第二次PCR篩選得到可遺傳的dXPR1-突變體果蠅品系(見圖3).

圖3 dXPR1-突變體的篩選與檢測(cè)

圖4 蛋白表達(dá)檢測(cè)tublin條帶為內(nèi)參，從左至右依次為野生型，純合dXPR1-的蛋白檢測(cè).

2.3 穩(wěn)定遺傳的dXPR1-突變體果蠅品系的鑒定得到的純合dXPR1-突變體果蠅需要通過Western blot檢測(cè)蛋白的表達(dá)水平，蛋白表達(dá)顯示結(jié)果與預(yù)期一致，WT對(duì)照組，純合dXPR1-突變體都能染出tublin的條帶，但是野生型還能染出dXPR1的條帶而純合dXPR1-突變體沒有染出對(duì)應(yīng)條帶，因此確定得到了穩(wěn)定遺傳的純合dXPR1-突變體果蠅(見圖4).

3 討論

本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建大片段缺失突變體dXPR1-所利用的基因編輯技術(shù)為CRISPR/Cas9系統(tǒng).其近年來被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域中.本實(shí)驗(yàn)注射了600個(gè)卵，在100只成活幼蟲中有53只成蟲存活，單只雜交后PCR檢測(cè)，有一管單雜后代有突變體產(chǎn)生，但相較于之前的P因子插入等基因編輯技術(shù)，用CRISPR/Cas9系統(tǒng)大大降低了實(shí)驗(yàn)工作量與實(shí)驗(yàn)時(shí)間，同時(shí)能更精確編輯得到想要的轉(zhuǎn)基因果蠅.這些技術(shù)的出現(xiàn)與成熟為我們的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)提供了巨大幫助，但在生物學(xué)中還有更多的新技術(shù)與方法需要我們?nèi)パ芯堪l(fā)現(xiàn).

PFBC病征通常表現(xiàn)為精神病征，運(yùn)動(dòng)障礙，認(rèn)知障礙等.XPR1是PFBC的致病基因之一，且是唯一的磷酸鹽輸出蛋白.因此XPR1在神經(jīng)系統(tǒng)中起到重要作用.目前在果蠅中與XPR1相關(guān)的基因，最新報(bào)道的有4個(gè)，分別為CG10483，CG7536，CG10481，CG2901.其中CG7536，CG10481主要在腸道干細(xì)胞中表達(dá)，CG2901則在毛原細(xì)胞中有表型，而CG10483(dXPR1)主要在大腦中表達(dá)，對(duì)腦神經(jīng)有影響.通過對(duì)比表達(dá)范圍與PFBC病征的臨床表現(xiàn)，我們認(rèn)為CG10483基因與XPR1基因具有高度一致性.我們已經(jīng)成功構(gòu)建了dXPR1-果蠅品系，可以利用dXPR1-果蠅進(jìn)行各項(xiàng)表型檢測(cè).目前初步的觀察發(fā)現(xiàn)純合的dXPR1-突變體并不致死，但發(fā)育成成蟲的時(shí)間有些許延長(zhǎng).由于XPR1控制了磷酸鹽的輸出，我們可以嘗試檢測(cè)dXPR1-突變體果蠅大腦中的磷離子含量的變化.同時(shí)考慮到XPR1對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育與對(duì)鈣離子調(diào)控的影響，后續(xù)我們也將探究突變體果蠅腦袋大小的變化，在果蠅大腦中能否觀察到鈣沉淀現(xiàn)象，同時(shí)我們將嘗試用GCamp這個(gè)功能原件來檢測(cè)果蠅大腦中的鈣離子濃度.