小鼠局部淋巴結(jié)實驗在紅花注射液致敏性研究中的應(yīng)用

徐小玲，鄔姍，潘望平，呂曉君，吳森，何開勇

(湖北省藥品監(jiān)督檢驗研究院，武漢 430064)

隨著中藥注射劑在臨床的廣泛應(yīng)用，與其相關(guān)的變態(tài)反應(yīng)的報道也日益增多。紅花注射液是由中藥紅花經(jīng)提取制成的滅菌溶液，主要成分大多為相對分子質(zhì)量較小的化合物，主要含有色素、黃酮類化合物、酚酸、脂肪酸、揮發(fā)油及多炔等[1-2]，臨床上用于閉塞性腦血管、冠心病和脈管炎等疾病的治療。近年來，紅花注射液在臨床使用中引起的不良反應(yīng)特別是變態(tài)反應(yīng)日趨增多[3]，已逐漸引起人們的重視。目前國內(nèi)對藥物的致敏性評價主要通過主動過敏實驗、被動過敏實驗，以及應(yīng)用于Ⅵ型超敏反應(yīng)的豚鼠最大化實驗(guinea-pig maximization test，GPMT)和局部封閉涂皮實驗(buehler test，BT)[4-5]，而該類實驗主要針對的是大分子蛋白質(zhì)類引起的變態(tài)反應(yīng)，對小分子化合物容易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。對于小分子化學(xué)藥物，尤其是變態(tài)反應(yīng)居高不下的中藥注射劑，亟需要建立一種靈敏、特異、簡便和可靠的非臨床安全性實驗方法來評價其致敏潛在風(fēng)險。局部淋巴結(jié)實驗(local lymph node assay，LLNA)是目前惟一可靠的篩選和評價藥物超敏反應(yīng)的實驗方法，主要依據(jù)是腘窩淋巴結(jié)(popliteal lymph node，PLN)是足趾部注射外源化學(xué)物質(zhì)發(fā)生免疫應(yīng)答的第一部位和惟一引流淋巴結(jié)，因此，在足趾引入的致敏物質(zhì)勢必首先導(dǎo)致腘窩淋巴結(jié)及其相關(guān)免疫細(xì)胞的變化[6-9]。本研究旨在建立小鼠LLNA的方法，以替代傳統(tǒng)的豚鼠全身主動過敏實驗(active systemic anaphylaxis，ASA)檢測方法，對中藥紅花注射液的致敏性進(jìn)行檢測，探討紅花注射液引起變態(tài)反應(yīng)的可能機(jī)制，并與豚鼠全身主動過敏實驗進(jìn)行比較。

1 材料與方法

1.1試藥 供試品1～5：紅花注射液(批號：150411301，14091912，140914，141002020，10314122-32)；陰性對照：磷酸鹽緩沖液(PBS，pH值7.2)，氯化鈉注射液；陽性對照：鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)、2，4，6-三硝基苯磺酸(2，4，6-trinitrobenzene-sulfonic acid sol，TNBS)、D-青霉胺(D-penicillamine，D-PEN)。anti-mouse B220抗體、anti-mouse CD3抗體、anti-mouse CD4抗體、anti-mouse CD8抗體、anti-mouse CD69抗體(美國eBioscience公司和BD公司)。

1.2實驗動物 無特定病原體(SPF)級Balb/c小鼠，雌性，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，由武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(鄂) 2017-0013。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)l周后開始實驗。自由飲水?dāng)z食，溫度(23±1) ℃，相對濕度45%～55%，12 h明暗交替。豚鼠，健康合格，體質(zhì)量250～350 g，雌雄各半，由武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(鄂) 2017-0013，適應(yīng)性喂養(yǎng)l周后開始實驗。動物使用許可證號：SYXK(鄂) 2014-0009。

1.3儀器 Navios流式細(xì)胞儀(貝克曼庫爾特商貿(mào)有限公司)；TC20細(xì)胞計數(shù)儀(美國BIO-RAD公司)；高速冷凍離心機(jī)(貝克曼庫爾特公司)。

1.4豚鼠全身主動變態(tài)反應(yīng) 按《中華人民共和國藥典》2015年版四部進(jìn)行。豚鼠隨機(jī)分為6組，每組6只。第1組為氯化鈉注射液對照組，第2～6組為供試品1～5。各組動物分別腹腔注射氯化鈉注射液和供試品溶液0.5 mL，隔日致敏1次，共3次。在注射后第14，21 天，分別從耳靜脈注射氯化鈉注射液和供試品溶液1 mL，觀察激發(fā)后30 min內(nèi)豚鼠的反應(yīng)。

1.5小鼠局部淋巴結(jié)實驗

1.5.1劑量與分組 實驗設(shè)9個組別，隨機(jī)分為陰性對照組(PBS)、STZ組、TNBS組、D-PEN組、供試品組1～5，每組10只小鼠。將STZ溶于PBS。

1.5.2免疫動物 固定小鼠，以乙醇棉球消毒左后側(cè)(處理側(cè))足趾部，一次性無菌胰島素注射器皮下注射給藥，進(jìn)針方向由足跟指向足尖，各組給藥體積均為50 μL，對照組給予PBS，對側(cè)不做處理。

1.5.3PLN質(zhì)量指數(shù)和PLN細(xì)胞指數(shù)測定 注射7 d后，處死小鼠，將其雙側(cè)腘窩淋巴結(jié)與周圍組織分離取出，分別用分析天平稱質(zhì)量。計算 PLN質(zhì)量指數(shù)(WI)，PLN質(zhì)量指數(shù)=左側(cè)PLN質(zhì)量/右側(cè)PLN質(zhì)量。

PLN細(xì)胞指數(shù)測定，分別取小鼠雙側(cè)腘窩淋巴結(jié)，用載玻片壓碎，加入PBS溶液(pH 值7.4)2 mL，制成單細(xì)胞懸液，用細(xì)胞計數(shù)儀計數(shù)。計算PLN細(xì)胞指數(shù)(CI)，PLN細(xì)胞指數(shù)=左側(cè)PLN細(xì)胞數(shù)/右側(cè)PLN細(xì)胞數(shù)。

1.5.4淋巴細(xì)胞及早期活化指標(biāo)分析 用解剖鑷分離、摘取腘窩淋巴結(jié)(PLN)，常規(guī)制備單細(xì)胞懸液。用冷PBS洗滌細(xì)胞2次，細(xì)胞計數(shù)儀計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107·L-1。取上述各組淋巴細(xì)胞懸液100 μL(1×106個細(xì)胞)于流式管中，加入相應(yīng)抗小鼠抗體0.5 μg，混勻后，室溫避光孵育30 min。然后經(jīng)PBS洗滌2次(1400 r·min-1，r=18.5 cm，5 min)，棄上清液，加 PBS溶液0.4 mL重懸，過濾后流式細(xì)胞儀分析。

2 結(jié)果

2.1豚鼠全身主動變態(tài)反應(yīng) 結(jié)果顯示，供試品1～5組和氯化鈉注射液組均未出現(xiàn)明顯變態(tài)反應(yīng)癥狀。

2.2小鼠局部淋巴結(jié)實驗

2.2.1PLN質(zhì)量指數(shù)和PLN細(xì)胞指數(shù)測定 由表1可見，單次足趾部給予受試物后第7天，陽性對照組和供試品組2的PLN質(zhì)量指數(shù)與陰性對照組比較有所升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；陽性對照組和供試品組1～5的PLN細(xì)胞指數(shù)與陰性對照組比較，均有升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，即WI和CI未達(dá)到陽性標(biāo)準(zhǔn)。

表1 受試物對PLN質(zhì)量指數(shù)和細(xì)胞指數(shù)的影響

組別PLN質(zhì)量指數(shù)PLN細(xì)胞指數(shù)陰性對照組1.08±0.281.74±0.83TNBS組1.34±0.802.49±3.29STZ組1.99±0.945.23±4.36D-PEN組1.32±0.413.25±3.52供試品1組1.15±0.301.93±0.91供試品2組1.35±0.491.95±0.73供試品3組1.04±0.452.12±0.80供試品4組0.97±0.311.92±0.81供試品5組0.93±0.402.06±0.87

3 討論

中藥注射劑臨床應(yīng)用廣泛，但近年來不良反應(yīng)頻發(fā)，其中變態(tài)反應(yīng)占75%，中藥注射劑中的某些成分、制劑輔料以及體內(nèi)代謝產(chǎn)物可能為致敏原，引起I型超敏反應(yīng)[10-12]。目前，大多數(shù)過敏實驗方法如ASA都是根據(jù)I型變態(tài)反應(yīng)發(fā)病機(jī)制的設(shè)計建立的。本研究采用ASA法檢查5批中藥注射劑，結(jié)果均未出現(xiàn)明顯變態(tài)反應(yīng)。但是，ASA的缺點是要采用較多動物，需要激發(fā)后進(jìn)行觀察，主觀性較強(qiáng)，且給動物帶來了痛苦，不符合“3R原則”。

圖1 T、B細(xì)胞比例及其早期活化分子的流式分析圖

表2 陽性對照對T、B細(xì)胞比例及早期活化分子的影響

組別CD3CD3CD4CD3CD8B220CD3CD69CD4CD69CD8CD69B220CD69陰性對照組85.60±5.5047.30±4.1035.00±3.2016.60±4.102.13±0.302.68±0.460.02±0.040.11±0.07TNBS組80.20±11.5049.50±7.6027.90±6.40①21.90±12.002.83±0.82①3.20±0.830.02±0.020.15±0.04STZ組87.10±6.9048.40±3.5037.20±6.4015.20±6.501.58±0.491.81±0.43②0.02±0.020.05±0.04D-PEN組80.90±4.7043.80±4.7033.90±1.9019.50±5.001.44±0.24①2.00±0.280.03±0.040.16±0.07

①與陰性對照組比較，P<0.05；②與陰性對照組比較，P<0.01。

①Compared with negative control group,P<0.05；②Compared with negative control group，P<0.01.

表3 紅花注射液對T、B細(xì)胞比例及早期活化分子的影響

組別CD3CD3CD4CD3CD8B220CD3CD69CD4CD69CD8CD69B220CD69陰性對照組85.30±10.3055.20±8.3029.50±7.2014.30±2.602.33±0.402.79±0.470.02±0.030.63±0.34供試品1組91.40±1.2055.40±7.5025.90±4.9012.60±4.101.74±0.432.69±0.330.02±0.030.76±0.55供試品2組92.80±0.80①56.90±7.5022.80±6.0011.90±2.202.55±0.622.71±0.590.01±0.020.94±0.53供試品3組88.80±5.4057.10±9.7030.50±6.1013.40±3.502.59±0.523.01±0.950.02±0.020.78±0.51供試品4組86.90±2.5054.30±7.5026.80±4.7013.80±4.102.04±0.691.75±0.410.01±0.020.69±0.55供試品5組90.20±3.3053.90±6.4028.60±7.0012.90±2.801.97±0.532.82±0.560.03±0.040.80±0.63

①與陰性對照組比較，P<0.05。

①Compared with negative control group,P<0.05.

本研究通過已知的具有致敏性的幾種陽性藥對免疫細(xì)胞表面分子的表達(dá)影響的檢測，建立小鼠PLNA的檢測平臺。應(yīng)用這些與陽性藥致敏性密切相關(guān)的指標(biāo)來評價中藥注射劑的致敏性。PLNA結(jié)果顯示5批中藥注射劑中，僅有1批WI有增加的趨勢，且T淋巴細(xì)胞比例升高，提示這批樣品引起了淋巴結(jié)的增大和T淋巴細(xì)胞的增殖，具有一定的致敏潛在風(fēng)險，而其他批次供試品指標(biāo)的變化均差異無統(tǒng)計學(xué)意義，與ASA的結(jié)果基本一致，但PLNA的方法比傳統(tǒng)的ASA靈敏度更高。

小鼠PLNA可以更早期地對藥物致敏性給予預(yù)測和評價，該檢測手段不但靈敏度高，而且簡便、快速。通過致敏指標(biāo)的檢測可以對致敏的原因和類型進(jìn)行診斷，減少傳統(tǒng)過敏實驗中激發(fā)實驗給動物帶來的安全風(fēng)險和痛苦。