谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的結(jié)構(gòu)、功能及其在神經(jīng)精神疾病中的作用

代毅聰，陳鳳容，王昆華

（1）國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)毒品依賴和戒治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650032；2）昆明醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胃腸與疝外科，云南昆明 650032；3）云南省消化疾病防治工程技術(shù)研究所，云南昆明 650032；4）昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院科研實(shí)驗(yàn)中心，云南昆明 650032）

谷氨酸（glutamate，Glu）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)（Central nervous system，CNS）中主要的且最豐富的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，其在哺乳動(dòng)物體內(nèi)參與大多數(shù)興奮性突觸活動(dòng)，在神經(jīng)發(fā)育、突觸可塑性、學(xué)習(xí)與記憶[1]、感覺、心血管和神經(jīng)內(nèi)分泌控制及運(yùn)動(dòng)和其他生命功能活動(dòng)有重要作用[2]。目前已知谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體有兩種類型:高親和力轉(zhuǎn)運(yùn)體（即興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體，excitatory amino acid transporters，EAATs）和低親和力轉(zhuǎn)運(yùn)體（即囊泡谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體，vesicular glutamate transporters，VGLUTs）。儲(chǔ)存在囊泡中的Glu 通過低親和力轉(zhuǎn)運(yùn)體的攝取系統(tǒng)胞吐釋放，激活快速作用的興奮性，離子感受器和緩慢作用的變性感受器進(jìn)而介導(dǎo)神經(jīng)傳遞。位于神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞質(zhì)膜上的高親和力轉(zhuǎn)運(yùn)體可迅速終止谷氨酸的作用，并將其細(xì)胞外濃度維持在興奮毒性水平以下。形成神經(jīng)元與膠質(zhì)細(xì)胞之間的“谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)”，由此可以看出，谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體在機(jī)體生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用。越來越多證據(jù)表明：興奮性毒性與各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)，包括肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）、阿爾茨海默?。╝lzheimer's disease，AD）、帕金森?。╬arkinson's disease，PD）、錳中毒、精神分裂癥、癲癇和自閉癥等。本文在簡(jiǎn)要介紹兩種谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的基礎(chǔ)上，將重點(diǎn)闡述谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體與神經(jīng)精神疾?。òǔ砂a）方面的研究進(jìn)展。

1 谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體分類和功能

1.1 高親和力谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體

EAATs 是位于神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞膜上的糖蛋白。其一方面參與突觸興奮性信號(hào)的傳遞，另一方面在細(xì)胞外谷氨酸再攝取、保護(hù)神經(jīng)元免受興奮性毒性損害等方面發(fā)揮重要作用。早在1992 年至1997 年，學(xué)者[3]陸續(xù)發(fā)現(xiàn)5 種EAATs：GLAST（L-glutamate-L-aspartate transporter，或EAAT1）、GLT-1（glutamate transporter-1，或 EAAT2）、EAAC1（excitatory aminoacid carrier-1，或EAAT3）、EAAT4 和EAAT5。近些年，GLT-1 具有功能性的，但很少量的剪切變異體被發(fā)現(xiàn)GLT-1a、GLT-1b/GLT-1v 和GLT-1c。

SLC1A3 基因位于5 號(hào)染色體上編碼的GLAST/EAAT1 主要表達(dá)于小腦，在脊髓、前腦、內(nèi)耳及視網(wǎng)膜等處也有少量表達(dá)[4]，GLAST/EAAT1在發(fā)育階段高表達(dá)[5]。GLAST 在預(yù)防興奮性毒性神經(jīng)元方面起著關(guān)鍵作用。

GLT-1/EAAT2 由SLC1A2基因編碼，GLT-1/EAAT2 的mRNA 也僅在腦內(nèi)表達(dá)，分布較廣泛，在海馬、大腦皮層和紋狀體中均有較高表達(dá)，而在小腦表達(dá)量極微[6]。GLT-1/EAAT2 是成人大腦中突觸谷氨酸梯度的關(guān)鍵介質(zhì)，也是星形膠質(zhì)細(xì)胞主要的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其突觸中谷氨酸清除率90%以上[7]。GLT-1/EAAT2 水平與星形膠質(zhì)細(xì)胞中谷氨酸脫氫酶（Glutamate dehydrogenase，GDH）活性相關(guān)，表明GLT-1/EAAT2 在谷氨酸-谷氨酰胺突觸循環(huán)中起關(guān)鍵作用[5]。有報(bào)道稱，在海馬發(fā)育的體外模型中，星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1/EAAT2 表達(dá)與神經(jīng)元活動(dòng)密切相關(guān)[8]，表明神經(jīng)元與膠質(zhì)細(xì)胞之間的動(dòng)態(tài)相互作用參與了腦發(fā)育過程中突觸谷氨酸的穩(wěn)態(tài)維持。

與其他EAAT 亞型相比，EAAC1/EAAT3 由SLC1A1基因編碼，在皮質(zhì)早期發(fā)育階段高表達(dá)[9]。盡管GLAST/EAAT1 和GLT-1/EAAT2 是主要的中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，EAAC1/EAAT3也稱為興奮性氨基酸載體，廣泛表達(dá)于海馬CA1-CA4 區(qū)和皮質(zhì)錐體細(xì)胞層，尤其是在突觸后膜上[10]。在成人大腦的膠質(zhì)細(xì)胞GLAST/EAAT1 和GLT-1/EAAT2 與神經(jīng)元EAAC1/EAAT3 之間目前尚未發(fā)現(xiàn)存在相互作用[11]。

研究表明[12]，人EAAT4 基因（SLC1A6）定位于19 號(hào)染色體，小鼠基因（SLC1A6）定位于10號(hào)染色體的中心體區(qū)域。而人EAAT5 基因（SLC1A7）定位于1號(hào)染色體，小鼠基因（SLC1A7）定位于4 號(hào)染色體。EAAT4 局限于小腦蒲肯野細(xì)胞表達(dá)[13]。EAAT5 則局限于視網(wǎng)膜的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞上，表達(dá)于光感受器、雙極細(xì)胞、無長(zhǎng)突細(xì)胞等[14]。

1.2 低親和力谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體

VGLUTs 分布于囊泡膜上，能夠特異地將突觸囊泡外的Glu 轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入并突觸囊泡內(nèi)，還能通過突觸囊泡和質(zhì)膜融合將谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)到突觸前囊泡中，在突觸活動(dòng)中啟動(dòng)胞吐[15]。

SLC17家族編碼三個(gè)VGLUTs 的基因分別位于人類不同的染色體上，SLC17A7編碼VGLUT1 定位于19q13，mRNA 表達(dá)在端腦、小腦顆粒層、小腦前核和內(nèi)側(cè)韁核[16]。SLC17A6編碼VGLUT2 定位于11p14.3，mRNA 表達(dá)主要集中在間腦和下腦干[17]。研究發(fā)現(xiàn)[17]，VGLUT1 和VGLUT2 可明確地標(biāo)記谷氨酸能神經(jīng)元，它們被認(rèn)為是谷氨酸能神經(jīng)元最可靠的標(biāo)記。通過軸突末端的多重免疫熒光或體細(xì)mRNA 的原位雜交確認(rèn)在這些區(qū)域中，VGLUT1和VGLUT2 的神經(jīng)元共表達(dá)很少見[18]，而互補(bǔ)分布模式在大腦中無所不在。VGLUT1 和VGLUT2 在大多數(shù)興奮性突觸上保證了谷氨酸的囊泡攝取。VGLUT3 亞型與其他兩種VGLUTs 具有相同的結(jié)構(gòu)和功能特征[19]。

SLC17A8編碼VGLUT3 定位于12q23.1，在非常有限的神經(jīng)元中表達(dá)，通常表現(xiàn)出雙重神經(jīng)遞質(zhì)特異性。其mRNA 表達(dá)分布主要于中縫背側(cè)核、松果體核、下丘腦、嗅結(jié)節(jié)[20]和耳蝸內(nèi)感覺毛細(xì)胞的谷氨酸能神經(jīng)元亞群中[21]。與VGLUT1 和VGLUT2 相比不同，VGLUT3 主要標(biāo)記、識(shí)別非谷氨酸能的神經(jīng)元，即5-羥色胺能、膽堿能或氨基乙二酸能。VGLUT3 出現(xiàn)在大鼠海馬和新皮質(zhì)GABA能抑制性突觸末端[22]，同時(shí)也在外周組織中出現(xiàn)。通過免疫電鏡顯示VGLUT3 存在于星形膠質(zhì)細(xì)胞中，在突觸周圍和毛細(xì)血管末端也有分布。因此，VGLUT3 同VGLUT1 和VGLUT2 具有轉(zhuǎn)運(yùn)Glu 進(jìn)入突觸囊泡的功能，但是由于VGLUT3 表達(dá)和分布的特性使得其不能成為谷氨酸能神經(jīng)元的標(biāo)志。

2 谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體在疾病中的表現(xiàn)

2.1 神經(jīng)退行性疾病中高親和力谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的損傷

EAATs 與神經(jīng)退行性變的關(guān)系密切。研究顯示EAATs 失調(diào)與AD、PD、ALS、癲癇和錳中毒等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。

谷氨酸介導(dǎo)的興奮性毒性神經(jīng)元死亡與AD 病理相關(guān)，表明GLAST 和GLT-1 的失調(diào)影響AD 的發(fā)病機(jī)制。AD 患者的臨床研究顯示，GLT-1 的缺失與AD 的病理特征有關(guān)[23]。AD 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型表明，與野生型對(duì)照組相比，丟失GLT-1 等位基因的AD 小鼠模型表現(xiàn)出加速的認(rèn)知能力下降，而GLT-1 過表達(dá)在轉(zhuǎn)基因小鼠中減弱了AD 相關(guān)的認(rèn)知能力缺陷[23-24]。特異性激活劑對(duì)AD 小鼠GLT-1功能的藥理學(xué)恢復(fù)也減輕了認(rèn)知功能缺陷，提示GLT-1 在AD 的認(rèn)知功能和神經(jīng)保護(hù)中發(fā)揮重要作用[23]。

在帕金森病人群中發(fā)現(xiàn)PD 患者血小板中的谷氨酸攝取減少了50%[25]，其疾病嚴(yán)重程度和癥狀也與谷氨酸攝取減少有關(guān)。暴露于6-羥多巴胺的PD 大鼠模型，紋狀體GLT-1 表達(dá)降低[26]。在PD小鼠模型中，GLT-1 的異常泛素化導(dǎo)致GLT-1 表達(dá)降低和運(yùn)動(dòng)功能缺失，同時(shí)伴有DA 細(xì)胞丟失[27]。綜上所述，GLT-1 發(fā)現(xiàn)提示GLT-1 在PD 的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用。

ALS 的機(jī)制目前尚不清楚，但越來越多的證據(jù)表明，谷氨酸介導(dǎo)的興奮性毒性與ALS 的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[28]。對(duì)ALS 患者的尸檢證實(shí)了轉(zhuǎn)基因ALS 小鼠GLT-1 減少的結(jié)果[29]。ALS 小鼠模型中SOD1 的基因突變顯示GLT-1 的減少[30]。此外，β-內(nèi)酰胺類抗生素治療SOD1小鼠可緩解運(yùn)動(dòng)癥狀和延長(zhǎng)生存期[31]。這些結(jié)果提示GLT-1 的失調(diào)與ALS 的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。

在癲癇發(fā)作前，海馬細(xì)胞外谷氨酸水平顯著升高[32]。另有報(bào)道GLT-1 過表達(dá)可減輕毛果蕓香堿誘導(dǎo)的復(fù)發(fā)性癲癇，并阻止GLT-1 轉(zhuǎn)基因小鼠誘發(fā)的神經(jīng)元死亡[33]。表明GLT-1 在癲癇發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。此外，抗癲癇藥可逆轉(zhuǎn)GLAST/GLT-1 降低[34]。提示GLAST/GLT-1 可能是治療癲癇的靶點(diǎn)。

長(zhǎng)期過量接觸錳會(huì)導(dǎo)致一種被稱為錳中毒的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其病理特征與偶發(fā)性PD 相似[35]。錳可以誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)毒性，并伴有GLAST/GLT-1 功能障礙[34]。錳的神經(jīng)毒性也被認(rèn)為協(xié)助AD、PD、ALS、精神分裂癥和癲癇等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)展。

2.2 低親和力谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體異常與疾病相關(guān)

VGLUTs 是減弱谷氨酸神經(jīng)傳遞的理想靶點(diǎn)，降低其活性會(huì)減少谷氨酸在突觸囊泡中的儲(chǔ)存及其隨后的釋放，可能有助于治療神經(jīng)退行性疾病，如ALS、AD 和亨廷頓病，以及癲癇和疼痛的治療。一些化合物可以阻止突觸囊泡對(duì)谷氨酸的攝取，但其功效可能受到中樞神經(jīng)系統(tǒng)和突觸囊泡的限制。動(dòng)物模型證明VGLUTs 是囊泡積累和谷氨酸突觸釋放所必需的。SLC17A7 基因敲除小鼠通常只能活到斷奶，而通過積極的照顧，存活下來的動(dòng)物是盲的[36]。SLC17A6 敲除小鼠在出生時(shí)即死亡，但是對(duì)野生型和條件性SLC17A6 敲除的研究表明VGLUT2 在記憶、疼痛、瘙癢和獎(jiǎng)賞方面的作用[37]。SLC17A8 基因敲除小鼠失聰，并有癲癇發(fā)作和痛覺改變。在人類疾病方面，SLC17A8 的突變與DFNA25 位點(diǎn)的非綜合征性耳聾有關(guān)[38]。該疾病是一種常染色體顯性遺傳，SLC17A8 基因缺失的小鼠聽力正常，表明該突變表現(xiàn)為顯性負(fù)性[21，38]。

3 谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體功能障礙與精神疾病的關(guān)系

谷氨酸在關(guān)鍵神經(jīng)回路中的傳遞在成癮相關(guān)行為（包括運(yùn)動(dòng)敏化和藥物尋求）的啟動(dòng)和表達(dá)中起著關(guān)鍵作用。在甲基苯丙胺[39]、酒精和海洛因[40]給藥后，谷氨酸受體包括蛋白質(zhì)和基因表達(dá)的改變也有報(bào)道。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，甲基苯丙胺[41]、可卡因[42]均可使細(xì)胞外谷氨酸水平升高。上述表明攝入精神刺激劑與大腦的谷氨酸釋放增強(qiáng)有關(guān)[43]。此外，藥物誘導(dǎo)的神經(jīng)可塑性通過長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)[1]參與成癮藥物戒斷后恢復(fù)覓藥行為，即復(fù)吸[44]。綜上所述，細(xì)胞外谷氨酸受大腦不同區(qū)域谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的調(diào)控，谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體在調(diào)節(jié)谷氨酸水平方面發(fā)揮重要作用。

3.1 谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體功能紊亂在酒精成癮的機(jī)制

研究指出[45]，急性酒精暴露會(huì)降低細(xì)胞外谷氨酸濃度，而慢性酒精暴露則會(huì)增加細(xì)胞外谷氨酸濃度。長(zhǎng)期接觸酒精導(dǎo)致谷氨酸輸出功能增加，而且還可導(dǎo)致谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)能力受損。研究表明，大鼠長(zhǎng)期暴露于酒精，大腦皮層谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)減少[46]。而酗酒者尸檢的基底外側(cè)杏仁核中GLAST 和GLT-1 水平顯著下降[47]。長(zhǎng)期暴露于高劑量的酒精會(huì)降低EAAT3 和EAAT4 的活性[48]。然而，大鼠慢性攝入酒精EAAT1 和EAAT3 在頂葉皮層的表達(dá)沒有變化，EAAT2 在高劑量酒精喂養(yǎng)的大鼠中表達(dá)下調(diào)[48]。在尸體前額葉皮層樣本中，EAAT1 的表達(dá)在酗酒者中顯著升高，這表明神經(jīng)適應(yīng)可能發(fā)生，從而逆轉(zhuǎn)細(xì)胞外谷氨酸水平的升高[49]。

酗酒還會(huì)改變VGLUTs 在大腦中央獎(jiǎng)賞區(qū)域的表達(dá)，尤其是在伏隔核。在反復(fù)剝奪酒精后[50]，大鼠伏隔核區(qū)VGLUT2 選擇性升高，但作為大腦認(rèn)知回路一部分的VGLUT1 水平的表達(dá)保持不變。這表明攜帶谷氨酸的VGLUT2 神經(jīng)元數(shù)量的增加與伏隔核中多巴胺與谷氨酸比例的顯著變化有關(guān)。

3.2 谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體功能紊亂在藥物成癮的機(jī)制

在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中，甲基苯丙胺給藥后海馬內(nèi)的神經(jīng)元轉(zhuǎn)運(yùn)體EAAT3 增加。大鼠大腦皮層VGLUT1和紋狀體VGLUT2 基因表達(dá)增加[51]。使用頭孢曲松可抑制與甲基苯丙胺有關(guān)的亢奮，還可抑制安非他明誘導(dǎo)的大鼠行為敏化[52]。

另有報(bào)道[53]，嗎啡急性處理時(shí)VGLUT1 下調(diào)；慢性處理時(shí)EAAT2 的表達(dá)下調(diào)，而VGLUT1 的表達(dá)上調(diào)。EAAT2 是調(diào)節(jié)線索誘導(dǎo)的可卡因覓藥行為的關(guān)鍵因素，這意味著EAAT2 基因參與藥物依賴及其相關(guān)精神病提供了證據(jù)。

3.3 谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體功能障礙對(duì)行為認(rèn)知的影響

研究表明[54-55]，谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體功能障礙是導(dǎo)致抑郁癥的病理生理學(xué)基礎(chǔ)。腦室內(nèi)灌注星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸再攝取抑制劑二氫紅藻氨酸可使大鼠產(chǎn)生抑郁行為[56]，提示谷氨酸攝取功能紊亂在抑郁癥的病理生理中起重要作用。

Zink 等[57]研究發(fā)現(xiàn)，海馬和大腦皮層膠質(zhì)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白EAAT2 的表達(dá)明顯受到抑制。EAAT4和VGLUT1 的表達(dá)水平降低，但GLAST 和EAAT3的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有明顯變化。有報(bào)道[42]，慢性不可預(yù)知性應(yīng)激（chronic unpredictable stress，CUS）可降低大鼠海馬的GLT-1 水平。而慢性給藥GEBR-7b可逆轉(zhuǎn)CUS 誘導(dǎo)的GLT-1 的下調(diào)，其抑郁樣行為改善，在一定程度上是通過調(diào)節(jié)大鼠海馬內(nèi)GLT-1 的水平來實(shí)現(xiàn)的。

EAATs 失調(diào)與精神分裂癥有關(guān)。精神分裂癥患者EAAT1 表達(dá)降低[58]，EAAT2 基因變異與精神分裂癥的嚴(yán)重程度相關(guān)[59]。在轉(zhuǎn)錄水平上，精神分裂癥患者大腦中EAAT2 的N-糖基化水平降低[60]?？傊珽AAT1/2 可能參與了精神分裂癥的發(fā)病機(jī)制。

GLT-1 表達(dá)失調(diào)改變了谷氨酸從突觸間隙清除能力，導(dǎo)致自閉癥動(dòng)物模型的發(fā)病機(jī)制[61]。GLT-1 的缺失導(dǎo)致小鼠突觸過度興奮和病理重復(fù)性行為，提示GLT-1 在調(diào)節(jié)皮質(zhì)突觸中發(fā)揮重要作用[62]，且可能存在聯(lián)系，這值得進(jìn)一步探索。

4 小結(jié)

EAATs 的發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)科學(xué)的研究中對(duì)谷氨酸的傳遞深入研究獲得了突飛猛進(jìn)的進(jìn)展。本課題組在前期研究結(jié)果提示通過調(diào)節(jié)GLT-1 改善甲基苯丙胺戒斷期焦慮癥狀，在后續(xù)研究中我們以谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白為靶點(diǎn)，更好地治療藥物依賴和復(fù)發(fā)。隨著VGLUTs 的深入研究，對(duì)CNS 中谷氨酸的精細(xì)調(diào)控的理解更進(jìn)一步，同時(shí)它們作為標(biāo)志物的特性則為探索CNS 重要高級(jí)功能，如認(rèn)知功能、情緒和藥物依賴等提供了準(zhǔn)確和有力的工具。在疾病模型中觀察到的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能失調(diào)的具體途徑，從而導(dǎo)致對(duì)疾病的發(fā)病機(jī)制有更好的理解。谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的藥物靶向化是一個(gè)開闊的探索方向，它將擴(kuò)展筆者對(duì)高級(jí)功能障礙的理解，并有助于識(shí)別潛在的治療靶點(diǎn)，尤其是作為藥物靶標(biāo)用于開發(fā)治療谷氨酸能系統(tǒng)相關(guān)疾病的藥物具有重要價(jià)值。