脫細(xì)胞外基質(zhì)支架材料在骨再生中的應(yīng)用及研究進(jìn)展

張艷珉，姜治偉，楊國(guó)利，王慧明

腫瘤、創(chuàng)傷、發(fā)育畸形、感染等原因造成骨缺損的快速而功能性修復(fù)一直是臨床醫(yī)生們的追求。近年來(lái)，骨缺損修復(fù)材料不斷更新與發(fā)展，自體骨移植一直被視為“金標(biāo)準(zhǔn)”，開(kāi)辟第二術(shù)區(qū)和取骨量不足的問(wèn)題使得臨床的普及應(yīng)用受限制,異體骨因免疫排斥問(wèn)題臨床普及應(yīng)用也受限制；隨著生物材料學(xué)的不斷進(jìn)步，人工合成材料和生物活性材料的出現(xiàn)擴(kuò)大了骨缺損修復(fù)的應(yīng)用范圍，取得了良好的修復(fù)效果，代表性的材料有：生物活性玻璃材料、聚合支架材料、鈣磷為基礎(chǔ)的生物活性陶瓷支架材料、復(fù)合支架材料、金屬材料，但是這些材料也存在著一些問(wèn)題，如生物活性降低、生物相容性差、支架降解等、并不能提供骨再生過(guò)程中穩(wěn)定的微環(huán)境[1]。理想的骨缺損修復(fù)材料應(yīng)滿足以下關(guān)鍵因素：種子細(xì)胞的募集、緩釋生長(zhǎng)因子及提供一個(gè)穩(wěn)定的模擬微環(huán)境的生物活性支架。隨著組織工程的不斷發(fā)展，脫細(xì)胞外基質(zhì)(dECM)材料因促進(jìn)種子細(xì)胞的粘附、增殖、調(diào)控成骨分化、維持干性、挽救衰老干細(xì)胞活性、血管生成作用、富含豐富的生長(zhǎng)因子等優(yōu)點(diǎn)逐漸受到學(xué)者們研究和關(guān)注，脫細(xì)胞外基質(zhì)材料按照其來(lái)源可分為細(xì)胞來(lái)源的脫細(xì)胞外基質(zhì)材料和組織、器官來(lái)源的脫細(xì)胞外基質(zhì)材料，細(xì)胞來(lái)源的脫細(xì)胞外基質(zhì)因細(xì)胞來(lái)源廣泛，大量擴(kuò)增，種類豐富而備受學(xué)者們關(guān)注，本文僅圍繞細(xì)胞來(lái)源的脫細(xì)胞外基質(zhì)材料在骨再生中應(yīng)用及研究進(jìn)展做一綜述。

1 dECM的成分及制備原理

dECM材料不僅具有組織特異性，而且成分結(jié)構(gòu)處于動(dòng)態(tài)變化之中,是由多種蛋白成分、生長(zhǎng)因子、對(duì)細(xì)胞生理功能發(fā)揮重要作用的小分子物質(zhì)組成的錯(cuò)綜復(fù)雜的結(jié)構(gòu)[2]。蛋白成分主要由膠原、彈性蛋白、硫酸軟骨素等結(jié)構(gòu)蛋白以及纖連蛋白、層粘連蛋白、玻連蛋白和韌粘素等粘結(jié)蛋白組成,此外，還有豐富的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblastic growth factor , bFGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular epithelial growth factor,VEGF)和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor, HGF)等生長(zhǎng)因子[3-5]。

脫細(xì)胞處理最關(guān)鍵的是去除具有免疫源性細(xì)胞成分和細(xì)胞核成分的同時(shí)保持dECM結(jié)構(gòu)的完整性。目前，常用制備dECM的方法主要有三種：生物化學(xué)處理(Triton X-100、SDS等有機(jī)溶劑去除細(xì)胞成分,DNA酶和RNA酶等生物酶類去除細(xì)胞核成分)、物理方法處理(反復(fù)凍融、機(jī)械震蕩)、化學(xué)處理(SDS等有機(jī)溶劑去除細(xì)胞和細(xì)胞核[6-8])。應(yīng)根據(jù)特定細(xì)胞類型、細(xì)胞密度、細(xì)胞外基質(zhì)厚度和細(xì)胞厚度選擇有效的脫細(xì)胞方法[9]。目前有研究針對(duì)組織制定了脫細(xì)胞的參考標(biāo)準(zhǔn)：HE染色，DAPI染色觀察不到細(xì)胞核；每毫克干燥組織DNA定量少于50 ng；DNA 片段大小在200 bp以下[10]。但是針對(duì)細(xì)胞來(lái)源的dECM脫細(xì)胞尚無(wú)一致的標(biāo)準(zhǔn)。目前的大多數(shù)研究思路是脫細(xì)胞處理后通過(guò)細(xì)胞骨架染色、DAPI染色、DNA含量這三個(gè)參數(shù)評(píng)估脫細(xì)胞是否相對(duì)徹底,通過(guò)I型膠原定性定量評(píng)估dECM的結(jié)構(gòu)是否相對(duì)完整[11-12]。

2 dECM的生物學(xué)性能及作用

2.1 dECM維持種子細(xì)胞干性，調(diào)控成骨分化

有研究表明，人類骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞外基質(zhì)能維持大鼠脂肪干細(xì)胞的干性，包括自我更新多向分化潛能及細(xì)胞增殖能力,促進(jìn)脂肪干細(xì)胞的成骨分化[13-14]。細(xì)胞膜片經(jīng)脫細(xì)胞處理后形成dECM片層定植在鈦片上，該dECM片層與鈦片復(fù)合體能夠調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)的形態(tài)、增殖和成骨分化[15]。此外，年輕間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的dECM能夠挽救衰老干細(xì)胞的復(fù)制和成骨能力[16]。

2.2 dECM促進(jìn)種子細(xì)胞粘附、增殖

與I型膠原相比，接種在人類間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的生物活性dECM表面的種子細(xì)胞具有明顯的增殖、粘附、遷移和多向分化潛能[17]。更為重要的是，dECM中含有豐富的骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulin-like growth factor, IGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2(fibroblast growth factor-2, FGF-2)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular epithelial growth factor,VEGF)等內(nèi)源性生長(zhǎng)因子，尤其是BMP-2、IGF對(duì)成骨分化是極為有利的[18]。

2.3 dECM提供種子細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)與活力的微環(huán)境

dECM由于大量的Ⅰ型膠原成分在細(xì)胞凍存中保持種子細(xì)胞的生命活力發(fā)揮了重要生物功能[19]。值得關(guān)注的是，內(nèi)源性dECM不僅能顯著促進(jìn)3D細(xì)胞聚合體的形成，而且還能維持缺氧環(huán)境下3D細(xì)胞聚合體中細(xì)胞的活力、增殖與多向分化潛能[20]。骨缺損修復(fù)中血管化生成為骨再生提供了血供來(lái)源、運(yùn)輸營(yíng)養(yǎng)、排泄代謝物等微環(huán)境。血管化功能骨也因此倍受學(xué)者關(guān)注，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞來(lái)源的dECM不僅對(duì)影響人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的血管形態(tài)至關(guān)重要，而且還提供了一個(gè)促進(jìn)人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞血管生成的微環(huán)境[21]?；诖?，dECM作為一種具有生物活性的天然材料在骨再生中得到了廣泛應(yīng)用與研究。

3 dECM材料在骨再生中的應(yīng)用及優(yōu)缺點(diǎn)

3.1 dECM蛋白成分與合成支架材料涂層

dECM可以制備成均質(zhì)混勻的dECM溶液，然后涂層在生物支架材料表面例如PLGA/PLA網(wǎng)狀支架、BG/PLG復(fù)合支架，并進(jìn)行干燥滅菌處理，體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)均證明這種dECM蛋白分子涂層復(fù)合支架能促進(jìn)細(xì)胞粘附和成骨效應(yīng)[22-23]。盡管dECM蛋白成分與支架材料形成復(fù)合涂層具備良好的成骨效應(yīng)，但是dECM的三維微觀結(jié)構(gòu)會(huì)遭到破壞，而且并不能模擬天然細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)復(fù)雜的活性成分，僅僅是局限于某種生物活性成分發(fā)揮的成骨效應(yīng)，成骨效應(yīng)的潛能有待進(jìn)一步發(fā)掘。

3.2 將粘附在生物材料表面的細(xì)胞進(jìn)行脫細(xì)胞處理

有研究在3D打印PCL/PLGA支架表面接細(xì)胞，利用旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器進(jìn)行3D細(xì)胞培養(yǎng)形成有效的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)以促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的形成，最后脫細(xì)胞處理接種細(xì)胞的3D打印支架，形成一個(gè)ECM涂層的3D打印支架，體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)證明該支架具有良好的成骨能力[24]。盡管細(xì)胞來(lái)源的dECM涂層在支架材料上最大可能地模擬了骨組織再生的三維微環(huán)境，但是有研究認(rèn)為直接將細(xì)胞培養(yǎng)在特定材料表面并不適用于各種各樣的材料表面[15]，該方法在一定程度上限制了材料的應(yīng)用。最重要的是，脫細(xì)胞處理是否會(huì)影響外源性支架與dECM界面處的穩(wěn)定性，有待深入研究。

3.3 脫細(xì)胞膜片來(lái)源的dECM片層與生物相容性材料復(fù)合

有研究通過(guò)多巴胺化學(xué)技術(shù)使脫細(xì)胞膜片形成的dECM片層與鈦片復(fù)合，形成了在純鈦表面涂層細(xì)胞膜片來(lái)源的dECM片層，深度解析了表面微形貌、纖維排列和成分，體外研究發(fā)現(xiàn)，該涂層促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和成骨分化[15]。脫細(xì)胞膜片來(lái)源的dECM片層很大程度上保留了dECM的纖維排列結(jié)構(gòu)和微觀形貌及生物活性成分，尤其是保存dECM片層的結(jié)構(gòu)完整性和大約相當(dāng)于10%的新鮮細(xì)胞膜片生長(zhǎng)因子的含量[4]。但是與外源性支架的復(fù)合是否因?yàn)橥庠葱灾Ъ艿拇嬖诳赡苎谏w了成骨效應(yīng)的發(fā)揮有待進(jìn)一步深入研究。

3.4 無(wú)外源性支架材料dECM的應(yīng)用

有研究將成骨誘導(dǎo)后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞膜片經(jīng)脫細(xì)胞處理后形成成骨誘導(dǎo)后的脫細(xì)胞外基質(zhì)片層，含有大量的膠原成分及生長(zhǎng)因子(BMP-2, VFGFs, TGF-β1, bFGF),并且具有骨誘導(dǎo)和骨傳導(dǎo)特性，能顯著促進(jìn)大鼠股骨節(jié)段性骨缺損的修復(fù)[25]。最近一項(xiàng)研究將人類間充質(zhì)干細(xì)胞膜片來(lái)源的脫細(xì)胞外基質(zhì)接種軟骨細(xì)胞，體外研究發(fā)現(xiàn)該支架能明顯促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖和提高軟骨細(xì)胞表型。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，將其接上軟骨細(xì)胞后折疊形成3D結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)能顯著促進(jìn)軟骨再生[26]。盡管這種純粹生物活性dECM支架的應(yīng)用首先解決了外源性人工合成支架降解帶來(lái)的系列問(wèn)題，但是細(xì)胞來(lái)源的dECM支架可能存在著結(jié)構(gòu)的不足和形狀的不穩(wěn)等問(wèn)題?？傊?，不同應(yīng)用形式的dECM支架存在著不同程度的優(yōu)缺點(diǎn)，正是這些不同層面的缺陷推動(dòng)著科研人員的認(rèn)知不斷進(jìn)步，伴隨著材料學(xué)、生物力學(xué)等學(xué)科的不斷進(jìn)步與發(fā)展，dECM在骨再生中應(yīng)用中相關(guān)機(jī)理和應(yīng)用形式有待深入研究與改進(jìn)。

4 dECM在骨再生中的作用機(jī)理

4.1 生物活性成分發(fā)揮了重要的骨再生效應(yīng)

生物活性成分例如纖連蛋白(fibronectin, FN)、Ⅰ型膠原(collagen-Ⅰ, Col-Ⅰ)、硫酸軟骨素糖胺聚糖(Sulfated GAGs)發(fā)揮了舉足輕重的骨再生效應(yīng) dECM的一個(gè)主要生物活性分子FN具有抑制破骨效應(yīng)，可能的機(jī)理與抑制NF- κB信號(hào)通路和降低細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)有關(guān)[27]，此外，dECM尤其是Ⅰ型膠原可以提高間充質(zhì)細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶水平，通過(guò)激活SIRT1依賴的信號(hào)通路提高間充質(zhì)干細(xì)胞抵抗對(duì)氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞早衰[28]。在炎癥狀態(tài)中，Ⅰ型膠原可通過(guò)OSCAR介導(dǎo)的信號(hào)通路促進(jìn)單核細(xì)胞來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟[29]。硫酸軟骨素糖胺聚糖(Sulfated GAGs)在促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的同時(shí)通過(guò)上調(diào)OPG的表達(dá)來(lái)抑制破骨細(xì)胞分化[30]。dECM還可以通過(guò)ROCK Ⅱ通路增加肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的張力來(lái)延續(xù)已分化間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨表型[31]。

4.2 生物活性分子的物理排列與表面微形貌對(duì)干細(xì)胞行為調(diào)控促進(jìn)骨再生

亦有研究通過(guò)表征方面分析不同細(xì)胞來(lái)源的dECM的特殊蛋白的物理排列來(lái)解釋不同的生物學(xué)效應(yīng)[5]。表征分析研究發(fā)現(xiàn)：與軟骨細(xì)胞來(lái)源的dECM相比，成纖維細(xì)胞來(lái)源的dECM中FN呈現(xiàn)空間緊密而又有序的排列，這種特定蛋白有序的物理排列，使得成纖維細(xì)胞來(lái)源的dECM能夠明顯上調(diào)成骨相關(guān)蛋白：堿性磷酸酶(alkaline phosphatase ,ALP),骨橋蛋白(osteopontin , OPN),骨鈣素(osteocalcin, OCN)和Col-I，從而發(fā)揮dECM成骨生物學(xué)效應(yīng)。改變dECM彈性模量和表面形貌通過(guò)激活FAK/RhoA/ROCK/MAPK信號(hào)軸調(diào)控干細(xì)胞行為[32]。dECM表面微形貌調(diào)控成骨分化的復(fù)雜機(jī)理也可能涉及Hippo信號(hào)通路中的兩個(gè)蛋白成員：YAP和TAZ，細(xì)胞對(duì)dECM納米拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的反應(yīng)跟YAP和TAZ有關(guān)[33]。TAP和TAZ通過(guò)調(diào)控骨形成、改建和骨基質(zhì)的機(jī)械屬性發(fā)揮聯(lián)合效應(yīng)促進(jìn)成骨[34]。目前關(guān)于dECM與TAP/TAZ之間的聯(lián)系鮮有報(bào)道，相關(guān)機(jī)理需進(jìn)一步深入研究。

4.3 dECM含有大量?jī)?nèi)源性生長(zhǎng)因子

dECM為骨再生提供了含有豐富內(nèi)源性生長(zhǎng)因子的微環(huán)境，并且持續(xù)緩慢釋放IGF-1等生長(zhǎng)因子促進(jìn)種子細(xì)胞的增殖和成骨分化[18]；而且由生物活性分子組成的三維空間結(jié)構(gòu)的dECM可能又會(huì)更多的募集籠絡(luò)緩釋大量生長(zhǎng)因子。

4.4 整合素介導(dǎo)的細(xì)胞與dECM之間的信息傳遞調(diào)控細(xì)胞的行為

整合素介導(dǎo)細(xì)胞在dECM上的粘附和遷移，整合素還能感知張力、空間構(gòu)像及ECM組成的變化，在細(xì)胞與ECM之間起到雙向信息傳遞作用，這種信息轉(zhuǎn)換取決于整合素相關(guān)因子包括整合素類型、集群等[35]；不僅如此，整合素對(duì)細(xì)胞最初粘附到生物材料表面也起到重要作用[36]。有研究[37]發(fā)現(xiàn)預(yù)處理脫細(xì)胞支架表面，使支架表面含有特定粘附蛋白，能顯著提高表達(dá)整合素α3β1，α6β1和α5β1的細(xì)胞對(duì)支架的再粘附能力，闡明了細(xì)胞表面整合素與dECM特定蛋白匹配對(duì)放大細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的重要作用。此外，整合素可通過(guò)Wnt信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞的分化，Wnt5a 提高整合素mRNA和蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化[38]。ECM也可通過(guò)integrinα5、Akt、GSK-3β通路調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化[39]?？傊?，dECM在骨再生中涉及到的機(jī)理極其復(fù)雜多樣，不斷深層次挖掘和認(rèn)識(shí)dECM在骨再生中的機(jī)理，進(jìn)一步優(yōu)化dECM生物相容性材料，才能實(shí)現(xiàn)由基礎(chǔ)研究到臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化。

5 細(xì)胞來(lái)源dECM的未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)

細(xì)胞來(lái)源的dECM材料在骨組織工程中的應(yīng)用不僅實(shí)現(xiàn)了干細(xì)胞的“回收利用”，而且還制備了一種新型具有生物活性天然支架材料的雛形。但是，有研究報(bào)道徹底的脫細(xì)胞與相對(duì)不完全脫細(xì)胞處理，dECM生物活性并沒(méi)有明顯區(qū)別，過(guò)度脫細(xì)胞處理會(huì)削弱ECM的生物學(xué)功能[40]。因此針對(duì)更為有效和微創(chuàng)的脫細(xì)胞方法可能是未來(lái)的一個(gè)研究趨勢(shì)。細(xì)胞來(lái)源的dECM結(jié)構(gòu)纖維薄而脆弱，在不依賴外源性支架材料直接組裝形成3D微結(jié)構(gòu)的同時(shí)，膠原纖維結(jié)構(gòu)容易破壞，因此，針對(duì)提升dECM膠原纖維結(jié)構(gòu)強(qiáng)度的研究可能是未來(lái)的一個(gè)趨勢(shì)。常規(guī)制備dECM生物活性材料無(wú)法實(shí)現(xiàn)個(gè)性化與精準(zhǔn)化骨缺損修復(fù)，3D打印技術(shù)在生物材料中的應(yīng)用實(shí)現(xiàn)了個(gè)性化與精準(zhǔn)化的需求，因此，利用3D打印技術(shù)實(shí)現(xiàn)個(gè)性化與精準(zhǔn)化dECM材料的制備有可能是未來(lái)骨缺損修復(fù)材料發(fā)展的趨勢(shì)。