HPLC法測定綠豆中牡荊素的含量

楊 君，王 濤，黃 建,3*，王金輝,3*

0 引言

綠豆[Vignaradiata(Linn.) Wilczek.]為豆科植物綠豆的干燥成熟種子，別名青小豆、菉豆、植豆等，為常用的藥食同源中藥。綠豆具有清熱解毒、消暑利水之功效，常用于治療暑熱煩渴、水腫、瀉利、丹毒、癰腫等癥[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，綠豆具有抗氧化[2-3]、抑菌、抗腫瘤[4]、降血脂、降血糖[5]等活性作用。很多中成方復(fù)方中均含有綠豆，如護(hù)肝片、消絡(luò)痛片和清寧丸等。綠豆中主要含有蛋白質(zhì)[6-7]、淀粉[8]、微量元素[9-10]、黃酮及黃酮苷類等化學(xué)成分[11-12]。為了控制綠豆的質(zhì)量，本文建立了綠豆中牡荊素的含量測定方法，并對收集到的不同產(chǎn)地的40批綠豆中牡荊素的含量進(jìn)行分析。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters高效液相色譜儀(HPLC Waters 2690 Separations ModuLe)，檢測器：Waters 2996 Photodiode Array Detector，色譜柱：Symmetry?C18(150 mm× 4.6 mm，5 μm，S/N：122BA80169)；KQ3200超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；SartoriusBS210S型電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)；粉碎機(jī)(型號：FW-80，功率：460W，轉(zhuǎn)速：24 000 r/min)等。

1.2 試劑和試藥 液相用甲醇為色譜純(J.T.Baker)，甲醇(分析純)、無水乙醇、二氯甲烷為天津市富宇精細(xì)化工有限公司生產(chǎn)，磷酸(色譜級)為天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所生產(chǎn)，水為娃哈哈純凈水。牡荊素(批號：111687-201704，純度大于98%)購于中國食品藥品檢定研究院，試驗(yàn)所用綠豆均由葵花藥業(yè)提供，經(jīng)沈陽藥科大學(xué)陸金才教授鑒定為豆科植物綠豆[Vignaradiata(Linn.) Wilczek.]的干燥成熟種子。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 本研究采用色譜柱Symmetry?C18(4.6 mm × 150 mm,5 μm)，以甲醇-0.3%磷酸溶液(35∶65)為流動相等度洗脫，流速：1 ml/min，檢測波長：260 nm，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量10 μl。

2.2 溶液制備方法

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取牡荊素約10 mg，用50%甲醇配制成濃度為22.22 μg/ml的對照品工作液，4 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取綠豆粉末約1 g，精密移取50%甲醇25 ml于具塞錐形瓶，稱重，超聲30 min，冷卻至室溫，補(bǔ)重，搖勻，取上清液12 000 r/min離心5 min，取上清液，稀釋2倍，用0.22 μm濾膜濾過，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗(yàn) 分別取空白溶劑、對照品溶液和樣品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，見圖1，樣品和對照品具有相同保留時間的色譜峰，空白溶劑在此峰位無吸收。且綠豆中牡荊素色譜峰與其他色譜峰分離度大于1.5，按牡荊素計(jì)算理論塔板數(shù)不少于3 000，說明該方法具有較好的分離效果。

圖1 綠豆含量測定專屬性色譜圖

2.3.2 線性關(guān)系考察 取濃度為22.22 μg/ml的對照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測定峰面積，進(jìn)樣體積分別為2、4、8、10、14、16、20 μl，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y=23 050X-11 511(r=0.999 9)，牡荊素在0.04～0.44 μg線性范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 取濃度為22.22 μg/ml的對照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，重復(fù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，計(jì)算峰面積RSD為0.42%，說明該儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品樣品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，在0、2、4、6、8、10、12、24 h分別進(jìn)樣分析，測定色譜峰面積，計(jì)算峰面積RSD為0.45%，說明綠豆中牡荊素在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品樣品溶液6份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測定色譜峰面積，計(jì)算得到綠豆中牡荊素平均含量為1.28 mg/g，RSD為1.57%，說明該方法重復(fù)性良好。

2.3.6 加樣回收率 精密稱取已知含量的綠豆藥材粉末6份，每份約0.5 g，分別加入適量對照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品樣品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測定色譜峰面積，結(jié)果見表1，計(jì)算得到加樣回收率為97.47%～101.46%，RSD為1.78%，說明該方法加樣回收率良好。

表1 綠豆中牡荊素含量測定的加樣回收率結(jié)果

2.4 綠豆中牡荊素的含量測定 取收集到的40批綠豆樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下制備供試品樣品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測定色譜峰面積，計(jì)算綠豆中牡荊素的含量見表2。

表2 綠豆中牡荊素含量測定結(jié)果

3 討論

供試品溶液制備過程中，分別對提取溶劑(二氯甲烷、50%甲醇、75%甲醇、甲醇、50%乙醇、80%乙醇、95%乙醇)、料液比(10倍量、25倍量、50倍量)、提取時間(15 min、30 min、60 min)等影響因素進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示，以25倍量50%甲醇為提取溶劑、超聲提取30 min制備供試品，綠豆中牡荊素的含量最高，故最終確定供試品的制備方法為：25倍量50%甲醇超聲提取30 min。

本文采用HPLC法測定了綠豆中牡荊素的含量，并對收集到的不同產(chǎn)地的40批綠豆中牡荊素的含量進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，不同產(chǎn)地綠豆中牡荊素含量范圍為1.04～1.71 mg/g，說明不同產(chǎn)地綠豆中牡荊素含量存在一定的差異，但差異不明顯，該方法準(zhǔn)確、可靠、重復(fù)性好，可用于綠豆的質(zhì)量控制。