高效液相色譜法測定漢源金絲皇菊中3個活性成分的含量

李含春 祁 娟 全維明

（雅安市食品藥品檢驗所，四川 雅安 625000）

菊花為菊科，植物菊的干燥頭狀花序[1]，是我國傳統(tǒng)的常用中藥材之一。根據(jù)中醫(yī)藥理論，結(jié)合現(xiàn)代科學(xué)研究，其中綠原酸、木犀草苷和3，5-O-二咖啡?；鼘幩釣橹饕钚猿煞?，具有散風(fēng)清熱，平肝明目，清熱解毒的功效，常用于風(fēng)熱感冒、頭痛眩暈、目赤腫痛、眼目昏花、瘡癰腫毒等?；示罩械慕鸾z皇菊因其富含綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸和其他人體有益物質(zhì)，具有香、甜、潤三大特點(diǎn)，受到廣泛關(guān)注。金絲皇菊以江西、安徽、青海等為主要產(chǎn)地，其中安徽金絲皇菊尤為出名，以口感好、花片厚為特色，為此，雅安市漢源縣從安微歙縣引種金絲皇菊。目前，菊花中亳菊、滁菊、貢菊、杭菊、懷菊都有規(guī)范的檢驗標(biāo)準(zhǔn)，而金絲皇菊無正式的產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)及檢驗標(biāo)準(zhǔn)，為考察金絲皇菊的藥用價值，對金絲皇菊進(jìn)行了研究，建立了同時測定金絲皇菊中3個活性成分的高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）測定方法，作為質(zhì)量控制方法之一。

1 儀器與試藥

1.1 儀器：1260 Infinity Ⅱ型高效液相色譜儀（Agilent公司）；XS205 DualRange電子天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；SCQ-雙頻普通超聲波清洗機(jī)（上海聲彥超聲波儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑：金絲皇菊（水分含量為10.2%）產(chǎn)地為漢源；綠原酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110753-201817 含量：96.8%）；木犀草苷對照品（Stanford Chemicals-Stanford Analytical Chemicals Inc，批號：CRS-742884，含量：98.85%）；3，5-O-雙咖啡?；鼘幩釋φ掌罚⊿tanford Chemicals-Stanford Analytical Chemicals Inc，批號：DFA-222038，含量：98.78%）；甲醇（成都市科隆化學(xué)品有限公司，色譜純）、乙腈（成都市科隆化學(xué)品有限公司，色譜純），磷酸（成都市科龍化工試劑廠，優(yōu)級純），水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件。色譜柱：采用Agilent Poroshell 120 EC-C18（4.6 mm×150 mm，4 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），（梯度洗脫0～11 min，10%～18% A；11～30 min，18%～20% A；30～40 min，20% A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：348 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液。精密稱取綠原酸對照品15.12 mg、木犀草苷對照品9.64 mg、3，5-O-雙咖啡?；鼘幩釋φ掌?2.45 mg，置于100 mL棕色量瓶中，加70%甲醇溶液溶解并定容至刻度，搖勻，作為混合對照品溶液Ⅰ（含綠原酸、木犀草苷、3，5-O-雙咖啡?；鼘幩岬馁|(zhì)量濃度分別為146.36 μg/mL、95.29 μg/mL、320.54 μg/mL），置10 ℃以下保存?zhèn)溆?。精密量取混合對照品溶液?5 mL于100 mL棕色量瓶中，加70%甲醇溶液至刻度，搖勻，作為混合對照品溶液Ⅱ（含綠原酸、木犀草苷、3，5-O-雙咖啡?；鼘幩岬馁|(zhì)量濃度分別為36.59 μg/mL、23.82 μg/mL、80.14 μg/mL），置10 ℃以下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 供試品溶液。稱取金絲皇菊粉末（過一號篩）約0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇溶液25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率300 W，頻率45 kHz）40 min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液，置10 ℃以下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 系統(tǒng)適用性。精密量取“2.2.1”項配制的混合對照品溶液Ⅱ和供試品溶液各5 μL，按照“2.1”項下條件進(jìn)樣，結(jié)果見圖1。3個化合物均能完全分離，供試品溶液的雜質(zhì)對綠原酸、木犀草苷、3，5-O-雙咖啡?；鼘幩岬纳V峰不構(gòu)成干擾，該方法專屬性良好。

圖1 混合對照品（A）和供試品（B）的HPLC圖

2.3.2 線性關(guān)系考察。精密量取“2.2.1”項配制的混合對照品溶液Ⅰ1、2、5、10、20 mL，分別置于20 mL棕色量瓶中，用70%甲醇溶液稀釋至刻度，組成5個不同濃度梯度系列。按照“2.1”項下條件進(jìn)樣5 μL，以對照品質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程（表1）。結(jié)果在規(guī)定的進(jìn)樣濃度范圍內(nèi)，各化合物均呈良好的線性關(guān)系。分別以信噪比（S/N）為10∶1和3∶1時，確定其定量下限和檢測下限，結(jié)果見表1。

表1 3個活性成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍、定量下限和檢測下限

2.3.3 精密度試驗。精密量取“2.2.1”項配制的混合對照品溶液Ⅱ5 μL，按“2.1”項下條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄各成分的峰面積，結(jié)果綠原酸、木犀草苷、3，5-O-雙咖啡酰基奎寧酸峰面積的RSD分別為0.2%、0.4%、0.2%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗。取金絲皇菊粉末（過一號篩）約0.25 g，精密稱定，按照“2.2.2”項下條件處理后，按“2.1”項下條件分別于0、2、4、6、8、12、16、24 h時間點(diǎn)進(jìn)樣測定，記錄各成分的峰面積。結(jié)果綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡?；鼘幩岬钠骄迕娣e分別為321.31、311.92、658.79，RSD分別為0.13%、0.15%、0.09%。結(jié)果表明供試品溶液在室溫條件下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 重復(fù)性試驗。按“2.2.2”項下方法，制備供試品溶液4份，按“2.1”項下條件進(jìn)樣測定，計算各組分的含量。結(jié)果測定得四份供試品中綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡?；鼘幩岬暮堪俜直绕骄担╪=4）分別為0.4213%、0.2643%、0.7600%，RSD均為0.4%。表明該方法的重復(fù)性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗。稱取3份金絲皇菊粉末（過一號篩）約0.1 g，精密稱定，分別精密加入“2.2.1”項配制的混合對照品溶液Ⅰ2.5 mL，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測定，并記錄峰面積，計算回收率，結(jié)果見表2。

表2 金絲皇菊中3個活性成分的加樣回收率

2.4 樣品測定。取金絲皇菊粉末（過一號篩）約0.25 g，精密稱定4份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，精密量取“2.2.1”中配制的混合對照品溶液Ⅱ和供試品溶液各5 μL，按“2.1”項下條件進(jìn)樣測定，計算得金絲皇菊中綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸的含量，結(jié)果見表3。

表3 金絲皇菊樣品測定結(jié)果

3 討 論

3.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗中，3，5-O-雙咖啡?；鼘幩釋φ掌返睦碚撍鍞?shù)在50000以上；綠原酸色譜峰與木犀草苷、3，5-O-二咖啡?；鼘幩嵘V峰的分離度分別為49.05、14.68，＞1.5，表明三個待測物質(zhì)色譜峰完全分離；各峰的拖尾因子分別為1.021、1.034、1.041，且供試品溶液的雜質(zhì)對所測成分的色譜峰不構(gòu)成干擾，本方法能同時測定金絲皇菊中綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸的含量。

3.2 樣品測定得漢源金絲皇菊的平均含量分別為0.4213%、0.2643%、0.7600%，含量均高于藥典規(guī)定，而據(jù)呂紫璇等文獻(xiàn)測定得昆侖雪菊、白菊花、野菊花等10種菊花中綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡?；鼘幩岬暮糠謩e在0.131～0.805%、0.092～3.753%、0.284～1.594%[2]，比較這幾種菊花中三種有效物質(zhì)的含量，漢源金絲皇菊中綠原酸的含量高于雪菊，木犀草苷的含量高于白菊花和野菊花，3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸的含量高于雪菊和野菊花，表明漢源金絲皇菊中含有豐富的有效物質(zhì)，有益于人體健康。

4 小 結(jié)

采用高效液相色譜法對金絲皇菊的主要活性成分進(jìn)行含量分析，選擇性好，檢測靈敏度高，分離效果好?？蔀榻鸾z皇菊的含量分析及漢源金絲皇菊的開發(fā)利用提供一定的參考依據(jù)，有助于建立金絲皇菊檢驗標(biāo)準(zhǔn)，對控制皇菊產(chǎn)品質(zhì)量，保障產(chǎn)品安全，具有重要的作用。