群體感應(yīng)分子法尼醇對(duì)樺褐孔菌液體發(fā)酵過程中三萜及白樺脂酸含量的影響

李 豪 吳嘉南 陳啟和

（浙江大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)系 杭州 310058）

樺褐孔菌（Inonotus obliquus），亦稱白樺茸，是一種生長在白樺樹上的藥用真菌，屬于真菌門、擔(dān)子菌亞門、層菌綱、非褐菌目、多孔菌科、褐臥孔菌屬。主要分布于俄羅斯、芬蘭等北緯40°～50°的地區(qū)和我國的黑龍江大興安嶺、吉林長白山一帶[1]。從16世紀(jì)以來，俄羅斯、波蘭、芬蘭等國家的民間就廣泛使用樺褐孔菌來治療各種疑難雜癥，如各種癌癥、心臟病和糖尿病等[2]。

樺褐孔菌含有多糖、三萜等多種化合物。其中的三萜類化合物是由數(shù)個(gè)異戊二烯去掉羥基后首尾相連構(gòu)成的物質(zhì)。天然的三萜類化合物的前體主要是鯊烯，已發(fā)現(xiàn)約200多種結(jié)構(gòu)[3]。三萜的藥理研究表明：三萜具有抗癌，抗炎，抗病毒，免疫調(diào)節(jié)保肝等多種活性[4]。白樺脂酸（Betulinic acid，BA），又名樺木酸，是三萜中非常重要的一種。近年來的研究表明，白樺脂酸具有諸多的生物活性，如抗腫瘤、抗 HIV[5]、抗炎[6]、抗菌、抗瘧疾等[7]。大量試驗(yàn)表明白樺脂酸具有廣泛的抗腫瘤活性，其能誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡，包括白血病細(xì)胞[8]、腦瘤[9]、神經(jīng)外胚層瘤[10]、前列腺癌[11]、卵巢癌[12]、乳腺癌[13]、肺癌、結(jié)腸癌[14]以及宮頸癌[15]等細(xì)胞。白樺脂酸可以選擇性地殺死人類癌細(xì)胞而不殺傷健康細(xì)胞[16]，同時(shí)還具有作用機(jī)制特異、分子質(zhì)量小、低毒性等優(yōu)點(diǎn)，有廣泛的應(yīng)用開發(fā)前景，是一類很有潛力的藥物先導(dǎo)化合物。

目前，從高等真菌中直接提取三萜，已報(bào)道的有從靈芝、樟芝[17]中提取，也有報(bào)道從樺褐孔菌[18]中提取，而從高等真菌中提取白樺脂酸鮮有報(bào)道，已知的僅有通過黃綠蜜環(huán)菌進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化[19]。目前對(duì)樺褐孔菌的液體深層發(fā)酵主要集中在生物量、多糖和多酚的測(cè)定，對(duì)三萜及白樺脂酸的研究報(bào)道較少。之前從高等真菌中得到的三萜和白樺脂酸的產(chǎn)量非常低，希望找到一種更為高效的提高三萜和白樺脂酸產(chǎn)量的方法。

最近的研究表明，法尼醇作為一種群體感知分子，可以通過促進(jìn)多糖生物合成和調(diào)節(jié)菌絲體形態(tài)來顯著增加云芝中的胞外多糖產(chǎn)量[20]。然而，目前對(duì)于法尼醇的研究主要集中在白色念珠菌[21]，對(duì)樺褐孔菌發(fā)酵過程的研究目前還沒有報(bào)道。本試驗(yàn)將主要探討法尼醇對(duì)樺褐孔菌發(fā)酵過程中生物量、三萜和白樺脂酸產(chǎn)量的影響。

1 材料和方法

1.1 菌種、試劑

樺褐孔菌 （Inonotus obliquus） 菌株 （編號(hào)CFCC 83414），中國林業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

白樺脂酸，梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、馬鈴薯葡萄糖浸出液 （PDB），杭州微生物試劑有限公司；法尼醇（95%），Aladdin公司；香草醛（99%），Aladdin公司；DMSO，Sigma-Aldrich公司；乙酸乙酯、95%乙醇、正丁醇、冰醋酸、高氯酸（均為分析純）；乙腈、甲醇（均為色譜純）；麥麩，農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；甲酸（98%，色譜純），Aladdin公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Thermo Fisher Multiskan FC酶標(biāo)儀，美國；JY96-IIN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；離心機(jī)（DD-5M），湘儀離心機(jī)儀器有限公司；超聲波清洗器（JP-040S），深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司；恒溫?fù)u床，上海知楚儀器有限公司；超凈工作臺(tái)（SJ-CJ-2FDQ），蘇州蘇潔凈化設(shè)備公司；高效液相色譜（Agilent1100），安捷倫科技有限公司。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，邦西儀器科技有限公司；凍干機(jī)，美國Labconco。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基的制備

1.3.1.1 固體培養(yǎng)基 將麩皮按照質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%加入水中，熬制0.5 h后用8層紗布過濾除去大顆粒，得到麩皮水浸提液；然后，加入PDA合成培養(yǎng)基（市售），混合均勻后，將其煮沸后分裝在玻璃管中，每管10 mL，之后在121℃下滅菌20 min。滅菌后擺斜面至斜面凝固。

1.3.1.2 液體培養(yǎng)基 將麩皮按照5%（以水的體積計(jì)）的比例加入水中，并且熬制半個(gè)小時(shí)后用8層紗布過濾除去大顆粒，得到麩皮水浸提液；然后加入PDB合成培養(yǎng)基（市售），混合均勻后，分裝在500 mL錐形瓶中，每瓶分裝100 mL，在121℃下滅菌20 min。

1.3.2 菌種的活化與保藏 將樺褐孔菌CFCC 83414接種到斜面上，在25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 d左右，待其長滿整個(gè)斜面。每個(gè)月更新1次斜面。

1.3.3 接種和發(fā)酵 每個(gè)搖瓶接種1塊1 cm2的樺褐孔菌。在25℃溫度下培養(yǎng)，先靜置2～3 d，然后以100 r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)2～3 d，之后以180 r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)。

1.3.4 法尼醇的加入 法尼醇配制：先配制成1 mol/L的儲(chǔ)備液，然后稀釋成50 mmol/L的工作濃度。稱取0.22236 g法尼醇，溶于1 mL的DMSO中，得到1 mol/L的儲(chǔ)備液，用0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌，然后稀釋20倍，得到50 mmol/L的工作液。在發(fā)酵液中分別添加0.1，0.2，0.3，0.6 mL的50 mmol/L的工作液，使發(fā)酵液中法尼醇的終濃度為 50，100，150，300 μmol/L。同時(shí)加入 1.2%的DMSO作為空白對(duì)照組。法尼醇或1.2%的DMSO均在正常發(fā)酵過程中的第6天加入。

1.3.5 三萜的測(cè)定 胞內(nèi) （Intracellular triterpenoids，IT）三萜：樺褐孔菌菌絲經(jīng)去離子水洗滌、離心、收集，凍干至恒重，取適量菌絲按1g/50 mL，每個(gè)約0.4 g，加入體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇，用細(xì)胞破碎儀破碎，于60℃，400 W下提取1 h，并重復(fù)1次，合并上清液，定容后待測(cè)。其三萜含量（mg/g）采用香草醛-高氯酸法。

總 IT 含量（mg/100 mL）=IT 含量（mg/g）×菌絲生物量（g/100 mL）

胞外三萜 （Extracellular triterpenoids，ET）測(cè)定：將各菌株發(fā)酵液3 500 r/min離心20 min，收集上清液并定容100 mL（記為A溶液）。取一定體積A溶液 （V1mL），用3倍體積的水飽和正丁醇萃取2次，合并萃取液并減壓濃縮蒸干，用甲醇復(fù)溶并定容 5 mL，記為溶液B，其ET含量（mg/mL）采用香草醒－高氯酸方法測(cè)定。

總ET含量 （mg/100 mL）=B溶液中ET含量（mg/mL）×100 mL/V1

香草醛-高氯酸測(cè)定方法：取待測(cè)樣品溶液或樣品稀釋液0.1 mL于試管中，70℃加熱揮干溶劑，加5%香草醛冰醋酸溶液0.2 mL，高氯酸0.5 mL，混勻后于60℃水浴中20 min，取出，置于冷水中15 min，最后加入冰醋酸5 mL，混勻，吸取200 μL于波長550 nm處測(cè)定吸光值。每個(gè)設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

三萜標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定 （以白樺脂醇為對(duì)照）：稱5 mg白樺脂醇于離心管中，加10 mL無水乙醇，配成500 μg/mL的儲(chǔ)備液。用無水乙醇稀釋成200 μg/mL的工作液。取 200 μg/mL的白樺脂醇工作 液 0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mL 于 試 管 中（對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度 10，20，40，60，80，100，120 μg/mL），之后按照香草醛-冰醋酸法測(cè)量。

1.3.6 白樺脂酸含量的測(cè)定 胞內(nèi)BA：將得到的菌體超聲破碎儀破碎5次，每次1 min，加入等量的乙酸乙酯萃取，60℃，400 W下提取1 h，萃取2次。合并上層有機(jī)相，3 500 r/min離心20 min，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，然后用色譜純的甲醇溶解，0.22 μm的有機(jī)相微孔濾膜過濾，RP-HPLC法檢測(cè)。

胞外 BA：取 1.3.5 節(jié)中一定的體積 C（V3），加入等量的乙酸乙酯萃取，60℃，400 W下提取1 h。萃取2次，合并上層有機(jī)相，3 500 r/min離心20 min，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，然后用色譜純的甲醇溶解，0.22 μm的有機(jī)相微孔濾膜過濾，RP-HPLC法檢測(cè)。

采用反相液相色譜法（RP-HPLC），色譜檢測(cè)條件：色譜柱 Cosmosil （4.6 ID×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈/0.1%甲酸（體積比91/9）；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長210 nm；柱溫 35℃；進(jìn)樣量20 μL；跑樣時(shí)間25 min，梯度洗脫。

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：取1 mL標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣，在色譜檢測(cè)條件下測(cè)定對(duì)應(yīng)的峰面積值（A），以峰面積值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，白樺脂酸的濃度C為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

試驗(yàn)組在發(fā)酵中期時(shí)加入法尼醇，對(duì)照組加入同樣濃度的DMSO。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 法尼醇對(duì)樺褐孔菌菌體生物量的影響

法尼醇對(duì)樺褐孔菌生物量的影響如圖1所示。對(duì)照組菌體生物量最大，當(dāng)法尼醇的添加量從50 μmol/L 遞增到 300 μmol/L 時(shí)，菌體的生物量呈遞減趨勢(shì)。150 μmol/L和300 μmol/L兩個(gè)濃度的法尼醇對(duì)菌絲的生物量的抑制效果相當(dāng)。加入法尼醇可抑制樺褐孔菌的生長，并呈濃度依賴關(guān)系。

2.2 法尼醇對(duì)胞內(nèi)三萜的影響

三萜是樺褐孔菌非常重要的一類次生代謝產(chǎn)物。法尼醇的濃度對(duì)胞內(nèi)三萜的影響如圖2所示。100 μmol/L和150 μmol/L法尼醇的添加量對(duì)應(yīng)的菌體中三萜的含量分別為14.95 mg/g和15.55 mg/g，與對(duì)照相比，各提高了11.2%和16.0%。50 μmol/L和 300 μmol/L的添加量對(duì)菌體中三萜含量的影響不大。從圖2可看出，隨著法尼醇濃度的增大，胞內(nèi)三萜呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，150 μmol/L的法尼醇對(duì)菌體中三萜的促進(jìn)作用最大。

圖1 法尼醇濃度對(duì)菌體生物量的影響Fig.1 Effect of the concentration of farnesol on the mycelia’s biomass

圖2 法尼醇濃度對(duì)胞內(nèi)三萜的影響Fig.2 Effect of the concentration of farnesol on intercellular triterpenoids

2.3 法尼醇對(duì)胞外三萜的影響

樺褐孔菌胞外的三萜含量研究較少。圖3為法尼醇濃度對(duì)胞外總?cè)坪康挠绊?。隨著法尼醇濃度的增大，胞外三萜呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，50 μmol/L的法尼醇對(duì)胞外三萜的促進(jìn)作用達(dá)到最大值，與對(duì)照相比，含量提高了約1倍。結(jié)合圖2 可知，添加 100 μmol/L和 150 μmol/L 法尼醇時(shí)，三萜更多地保存在了胞內(nèi)，胞外三萜的含量不是很高。

2.4 法尼醇對(duì)胞內(nèi)BA的影響

法尼醇濃度對(duì)菌體中BA含量的影響如圖4所示。法尼醇的添加量較低時(shí)，對(duì)菌體中BA含量的提高作用不明顯。當(dāng)法尼醇的添加量增到150 μmol/L時(shí)，菌體中BA的含量急劇增加，與對(duì)照相

圖3 法尼醇濃度對(duì)胞外三萜的影響Fig.3 Effect of the concentration of farnesol on extracellular triterpenoids

2.5 法尼醇對(duì)胞外BA的影響

圖5所示為法尼醇的濃度對(duì)發(fā)酵液中BA濃度的影響。隨著法尼醇濃度的增大，發(fā)酵液中BA的濃度呈先上升后下降的趨勢(shì)。在法尼醇添加量為 100 μmol/L，發(fā)酵液中 BA的質(zhì)量濃度最大，0.1395 μg/mL，與對(duì)照 0.0351 μg/mL 相比，提高了3倍。在法尼醇添加量為50，150，300 μmol/L時(shí)，發(fā)酵液中BA的含量也有所提高，分別提高了21.6%，70.6%，14.8%。比，提高了4倍。當(dāng)法尼醇的添加量為300 μmol/L時(shí)，菌體中BA的含量為41.0 μg/g，是對(duì)照的10倍。菌體中BA的含量隨法尼醇添加量的增加而增加。

圖4 法尼醇濃度對(duì)菌體中BA含量的影響Fig.4 Effect of the concentration of farnesol on the content of BA in mycelia

圖5 法尼醇濃度對(duì)發(fā)酵液中BA濃度的影響Fig.5 Effect of the concentration of farnesol on the concentration of BA in fermentation broth

3 討論

本研究結(jié)果表明，在樺褐孔菌發(fā)酵過程中，隨著法尼醇添加量的增加，菌體的生物量逐漸下降，即法尼醇的加入抑制菌體的生長。菌體中的三萜，發(fā)酵液中的三萜和BA隨著法尼醇添加量的增加，都呈先增后降的趨勢(shì)，且對(duì)于這3個(gè)指標(biāo)，法尼醇的最佳添加量分別為 150，50，100 μmol/L。而菌體中BA的含量隨著法尼醇添加量的增加而增加。