噴霧干燥法制備植物乳桿菌ZJ316細(xì)菌素

周青青 王月姣 顧 青 酈 萍

（浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 浙江省食品微生物技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 杭州 310018）

近年來，隨著廣譜抗生素的過度使用引起的環(huán)境污染、抗生素耐藥性增強(qiáng)等問題日趨嚴(yán)重。禁用抗生素的呼聲響徹世界各地。歐盟等發(fā)達(dá)國(guó)家限制使用抗生素，并對(duì)產(chǎn)品中使用抗生素的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)逐步提高。減少抗生素的濫用，創(chuàng)制安全、綠色、無毒、高效的新抗菌劑迫在眉睫[1]。

細(xì)菌素（Bacteriocins）是一類由細(xì)菌核糖體合成，通過在靶細(xì)菌細(xì)胞膜上形成通道或直接抑制靶細(xì)菌細(xì)胞某些功能而高效發(fā)揮殺菌作用的抗菌肽[2-3]。與傳統(tǒng)抗生素相比，細(xì)菌素抗菌活性強(qiáng)，不易產(chǎn)生耐藥性，無毒副作用，無污染[4]。研究表明，細(xì)菌素對(duì)多種抗生素耐藥性致病菌有顯著抑殺效果。細(xì)菌素Lacticin3147[5]能有效抑制抗二甲氧基芐青霉素的“超級(jí)細(xì)菌”耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA，methicillin-resistant S.aureus）、抗萬古霉素的糞腸球菌VRE（vancomycin-resistant Enterococcus）；羊毛硫細(xì)菌素MutacinB-Ny266能抑制MRSA、奈瑟氏球菌等多重耐藥菌的生長(zhǎng)[6]。細(xì)菌素有望成為替代抗生素的新一代綠色安全抗菌劑，近年來逐漸成為全球關(guān)注的熱點(diǎn)。

細(xì)菌素產(chǎn)量低、生產(chǎn)成本高，是限制當(dāng)前大部分細(xì)菌素開發(fā)和產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的重要原因。為提高細(xì)菌素生產(chǎn)效率，現(xiàn)已出現(xiàn)一些工業(yè)生產(chǎn)的方法，如過濾法[7]、噴霧干燥法[8]、吸附法[9]等。過濾法簡(jiǎn)單、快速、成本低，得到的細(xì)菌素產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，活性較好。噴霧干燥法制備細(xì)菌素時(shí)，通過調(diào)整輔料、進(jìn)口溫度等參數(shù)來提高細(xì)菌素產(chǎn)品的質(zhì)量。利用pH吸附法可獲取大量的細(xì)菌素[10-11]，此方法操作簡(jiǎn)單，產(chǎn)品得率較高，然而試驗(yàn)用的有機(jī)試劑會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染。

本實(shí)驗(yàn)室研究人員從健康新生嬰兒糞便中分離篩選得到的植物乳桿菌 ZJ316（Lactobacillus plantarum ZJ316）產(chǎn)生的細(xì)菌素具有廣譜抑菌性，可抑制或殺死大腸桿菌、沙門氏菌、葡萄球菌、單增李斯特氏菌和少許真菌等致病菌[12]。索成等[13]利用植物乳桿菌ZJ316發(fā)酵液代替抗生素乙酰甲喹喂養(yǎng)剛斷奶的仔豬，使仔豬腹瀉率和死亡率顯著降低，日增重增加，腸道菌群的結(jié)構(gòu)改變，豬肉品質(zhì)改善。在前期研究基礎(chǔ)上，利用噴霧干燥的方法建立細(xì)菌素制備體系，為高抑菌活性細(xì)菌素規(guī)?；a(chǎn)打下基礎(chǔ)，推進(jìn)細(xì)菌素在食品工業(yè)中的應(yīng)用。

1 材料與設(shè)備

1.1 菌種

植物乳桿菌（L.plantarum）ZJ316，本實(shí)驗(yàn)室從健康新生嬰兒糞便中分離篩選得到，-80℃保藏。藤黃微球菌 10209（Micrococcus luteus 10209），購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心，-80℃保藏。

1.2 主要試劑和藥品

胰蛋白胨、酵母、無水葡萄糖、磷酸氫二鉀、無水乙酸鈉、吐溫-80、檸檬酸三銨、七水硫酸鎂、牛肉浸膏、硫酸錳、氯化鈉、瓊脂粉、氫氧化鈉、一次性使用無菌注射器、水系微孔過濾膜0.22 μm，購(gòu)于永華化學(xué)科技（江蘇）有限公司；麥芽糖、乳糖、D-果糖、蔗糖，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Nisin（2.5%，potency：106IU/g），購(gòu)于Sigma公司；脫脂奶粉、玉米淀粉、食鹽，均為市售。

1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基，按文獻(xiàn)[14]配制。

1.4 主要儀器和設(shè)備

微型噴霧干燥儀，Buchi B-290，瑞士Buchi公司；生物膜過濾系統(tǒng)，賽多利斯16828，德國(guó)賽多利斯公司；生物安全柜，Thermo，USA；生化培養(yǎng)箱，SPX-150B-Z型，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；分光光度計(jì)pHarmaSpec UV-1700，SHIMADZU，Japan；全自動(dòng)滅菌鍋，Tuttnauer，USA；恒溫水浴鍋，DK-8D，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；pH酸度計(jì) PB-10，Startorius；小型離心機(jī)，Thermo，USA。

2 試驗(yàn)方法

2.1 菌種活化

菌種活化：將-80℃保藏的菌種用劃線的方法活化 （植物乳桿菌ZJ316劃線于MRS固體培養(yǎng)基，指示菌M.luteus 10209劃線于LB固體培養(yǎng)基），30℃過夜培養(yǎng)。挑取單菌落于相應(yīng)液體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)過夜。

2.2 植物乳桿菌ZJ316發(fā)酵上清液制備

已活化的植物乳桿菌ZJ316按照3%的接種量接種于6 L MRS液體培養(yǎng)基，30℃靜置培養(yǎng)24 h。發(fā)酵液離心（4℃，8 000 r/min，20 min）得到上清，并用膜分離系統(tǒng)過濾（0.22 μm 膜），4℃儲(chǔ)藏待用。

2.3 蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定

樣品稱重，溶于300 mL超純水，利用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定樣品蛋白質(zhì)濃度。配制梯度濃度的牛血清蛋白 （BSA）標(biāo)準(zhǔn)溶液：0，25，125，250，500，750，1 000，1 500，2 000 μg/mL，測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液OD562值。以標(biāo)準(zhǔn)溶液蛋白濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的OD562值為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性標(biāo)準(zhǔn)方程，根據(jù)此方程計(jì)算樣品溶液的蛋白質(zhì)濃度。

2#危巖體(W2)分布于1#危巖體上部，危巖體高10～12 m，寬60.0～75.5 m，厚4～6 m，體積約6 435.0 m3，危巖體前緣陡直臨空，局部呈凹腔狀，主要受兩組裂隙和層面切割。切割成的單體危巖呈塊體狀，其南側(cè)為垂直臨空面，巖體表面橫豎向構(gòu)造節(jié)理裂隙發(fā)育，主要受三組裂隙和層面切割，節(jié)理密度為6～10條/10米，節(jié)理切割深度2.0～3.5 m。切割成的單體危巖呈塊體狀，其東、西、南三側(cè)為垂直臨空面，上部為風(fēng)化碎塊石，下部為片麻巖；節(jié)理裂隙多松弛張開、外傾，局部已貫通。危巖體頂部堆積有風(fēng)化碎塊石。

2.4 樣品效價(jià)與比活力的測(cè)定

在一定濃度范圍內(nèi)，效價(jià)的對(duì)數(shù)值與牛津杯法的抑菌圈直徑成直線函數(shù)關(guān)系[15-17]。以不同濃度（1 000，800，600，500，400，200，100和 50 IU/mL）Nisin標(biāo)準(zhǔn)樣品所形成的抑菌圈直徑為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)效價(jià)值的對(duì)數(shù)值lg（IU）對(duì)橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。效價(jià)值除以蛋白質(zhì)濃度等于產(chǎn)品比活力（IU/mg），可衡量樣品中有效成分（細(xì)菌素）的抑菌活性。

2.5 噴霧干燥輔料的選擇

將玉米淀粉、蔗糖、食鹽、脫脂奶粉4種輔料以15%的體積比加入超純水中，進(jìn)行噴霧干燥。干燥條件：進(jìn)風(fēng)溫度135℃、風(fēng)機(jī)工作效率95%、蠕動(dòng)泵工作效率20%、每分鐘通針5次，收集樣品做抑菌試驗(yàn)。

2.6 噴霧干燥制備細(xì)菌素的條件優(yōu)化

在輔料確定的前提下，對(duì)噴霧干燥的影響因素（食鹽添加比例、進(jìn)口溫度、風(fēng)機(jī)工作效率、蠕動(dòng)泵工作效率）分別進(jìn)行單因素優(yōu)化，選取顯著因素進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化。噴霧干燥后，均收集樣品并及時(shí)稱重，做抑菌試驗(yàn)和測(cè)蛋白質(zhì)含量。優(yōu)化試驗(yàn)過程中，噴霧干燥樣品需完全混合均勻，每分鐘通針5次，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6.1 食鹽添加比例的影響 將不同體積比（5%，10%，15%，20%，25%） 的食鹽加入發(fā)酵上清液中，完全溶解后進(jìn)行噴霧干燥，干燥條件：進(jìn)風(fēng)溫度135℃、風(fēng)機(jī)工作效率95%、蠕動(dòng)泵工作效率20%。

2.6.2 進(jìn)口溫度的影響 將20%體積比的食鹽加入到發(fā)酵上清液，完全溶解后進(jìn)行噴霧干燥，進(jìn)口溫度分別設(shè)定為 125，135，145，155，165℃。噴霧干燥機(jī)其它工作參數(shù)：風(fēng)機(jī)工作效率95%、蠕動(dòng)泵工作效率20%。

2.6.3 風(fēng)機(jī)工作效率的影響 將20%體積比的食鹽加入到發(fā)酵上清液，完全溶解后進(jìn)行噴霧干燥，風(fēng)機(jī)的工作效率分別設(shè)定：80%，85%，90%，95%和100%。噴霧干燥機(jī)其它工作參數(shù)：進(jìn)口溫度155℃、蠕動(dòng)泵工作效率20%。

2.6.5 正交試驗(yàn) 以食鹽添加的體積比、進(jìn)口溫度、風(fēng)機(jī)工作效率、蠕動(dòng)泵工作效率作為影響因子，進(jìn)行四因素三水平的L9（34）正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)水平因素設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table1 Factors and levels of orthogonal test

3 結(jié)果與討論

3.1 蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

用BCA法確定蛋白濃度測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得的線性方程式為y=0.0013x+0.0613（R2=0.9975），如圖1。該標(biāo)準(zhǔn)曲線線性較好，可用于測(cè)定樣品蛋白濃度。

圖1 蛋白質(zhì)量濃度測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve for quantitative analysis of protein

3.2 蛋白質(zhì)效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)曲線

以Nisin為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線來衡量樣品的抑菌效果。如圖2所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式為y=4.4255x+12.7836，線性程度較好（R2=0.9970），可用來衡量發(fā)酵上清液的抑菌效果。

圖2 Nisin效價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of activity assay

3.3 輔料的比較和選擇

經(jīng)驗(yàn)證，食鹽等4種輔料均無抑菌效果，但對(duì)樣品的得率與品質(zhì)都有很大影響。食鹽為輔料時(shí)，樣品得率最高為80.46%，抑菌效果最好。奶粉為輔料時(shí)，樣品的得率與抑菌活性沒有以食鹽為輔料時(shí)高。以蔗糖為輔料時(shí)，噴霧干燥后的樣品都粘附在收集器皿側(cè)壁上，無法取樣。從制備樣品的外觀看，以食鹽為輔料的樣品品質(zhì)最好，蓬松且不易吸潮，奶粉次之，淀粉最不理想。而且以食鹽為輔料的樣品水溶性最好，奶粉次之，以淀粉為輔料的樣品不溶于水。綜合考慮，選擇食鹽為輔料進(jìn)行下面的優(yōu)化試驗(yàn)。

圖3 輔料對(duì)細(xì)菌素樣品品質(zhì)的影響Fig.3 Effect of different excipients on quality of the bacteriocin samples

3.4 食鹽添加量對(duì)噴霧干燥制備細(xì)菌素的影響

發(fā)酵上清液按不同體積比加入食鹽后，所得樣品比活力隨著食鹽濃度的增加而下降。如圖4所示，當(dāng)食鹽添加量為5%時(shí)，產(chǎn)品得率較低，抑菌活性較差。隨著食鹽濃度增加，得率呈先降低后增加的趨勢(shì)。當(dāng)食鹽添加量為20%時(shí)，樣品溶液的抑菌活性最好，效價(jià)為 2 337.801 IU/mL（P＜0.05）。當(dāng)食鹽添加量高于20%時(shí)，抑菌活性明顯下降。因此，選取20%的食鹽濃度為最佳輔料比。

3.5 進(jìn)口溫度的優(yōu)化

由圖5可知，隨進(jìn)口溫度升高，得率不斷增加。當(dāng)溫度為165℃時(shí)，樣品得率最高為86.713%。155℃時(shí)，樣品比活力與抑菌活性達(dá)到最高，分別為94.137，2 739.479 IU/mL（效價(jià)有顯著性增加P＜0.05）。在測(cè)定過程中發(fā)現(xiàn)當(dāng)進(jìn)口溫度為165℃時(shí)，樣品的得率較高為86.713%，但效價(jià)值降到2 312.625IU/mL，在此溫度下細(xì)菌素活性受到影響。綜合考慮，選擇155℃為最佳進(jìn)口溫度。

圖4 食鹽添加量對(duì)細(xì)菌素樣品品質(zhì)的影響Fig.4 Effect of different salt content on quality of the bacteriocin samples

圖5 進(jìn)口溫度對(duì)細(xì)菌素樣品品質(zhì)的影響Fig.5 Effect of different inlet air temperature on quality of the bacteriocin samples

3.6 風(fēng)機(jī)工作效率的參數(shù)確定

風(fēng)機(jī)功率低時(shí)，風(fēng)速小，產(chǎn)品不易干燥，水分蒸發(fā)不徹底，導(dǎo)致成型困難，得率低；風(fēng)機(jī)功率高時(shí)，風(fēng)速大，水分蒸發(fā)快，成型迅速，損失小，得率高。不考慮發(fā)酵液質(zhì)量的情況下，隨風(fēng)機(jī)工作效率提高，樣品的得率與抑菌活性（P＜0.05）也呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)。當(dāng)工作效率為100%時(shí)，其得率與效價(jià)值達(dá)到最高值分別為87.132%、2 788.243 IU/mL，在此條件下單位樣品的活力為2.400×104IU/g。風(fēng)機(jī)工作效率對(duì)樣品的得率、蛋白含量、比活力、抑菌活性均有影響。風(fēng)機(jī)的工作效率為100%為最佳條件。

3.7 蠕動(dòng)泵工作效率的參數(shù)確定

蠕動(dòng)泵對(duì)樣品的得率與抑菌活性有明顯的影響，對(duì)比活力影響不大。當(dāng)工作效率大于20%，隨泵速的提高，樣品得率與抑菌活性不斷降低。在蠕動(dòng)泵工作效率為35%時(shí)，樣品的得率僅為49.582%，效價(jià)值為1 306.413 IU/mL，單位樣品的活力為7 904.560 IU/g。隨著泵的工作效率的增加，進(jìn)料速度加快，樣品沒有完全干燥。綜合考慮。因此選取20%為蠕動(dòng)泵的工作效率。

圖6 風(fēng)機(jī)工作效率對(duì)細(xì)菌素樣品品質(zhì)的影響Fig.6 Effect of different air-blower on quality of the bacteriocin samples

圖7 蠕動(dòng)泵工作效率對(duì)細(xì)菌素樣品品質(zhì)的影響Fig.7 Effect of different feed flow rate on quality of the bacteriocin samples

3.8 正交試驗(yàn)結(jié)果

選取食鹽添加量、進(jìn)口溫度、風(fēng)機(jī)工作效率、蠕動(dòng)泵工作效率4個(gè)影響因子，每個(gè)因子取3個(gè)水平，進(jìn)行四因素三水平的L9（34）正交試驗(yàn)。結(jié)果見表2。

表2 四因素三水平正交試驗(yàn)方案與結(jié)果Table2 Result of orthogonal experiment

由表3正交試驗(yàn)結(jié)果可知，樣品抑菌活性最高的試驗(yàn)條件為食鹽添加量20%、進(jìn)口溫度155℃、風(fēng)機(jī)工作效率100%、蠕動(dòng)泵工作效率10%，此時(shí)單位樣品的活力是2.476×104IU/g。根據(jù)對(duì)三水平的極差分析，4種因素對(duì)產(chǎn)品抑菌活性影響力的大小依次是蠕動(dòng)泵工作效率＞風(fēng)機(jī)工作效率＞食鹽添加量＞進(jìn)口溫度，最佳組合為A2B2C3D2。

4 結(jié)論與討論

我國(guó)是一個(gè)乳酸菌資源豐富的國(guó)家，很多乳酸菌來源于食品、人畜腸道及少數(shù)臨床樣本，隨著對(duì)乳酸菌及其細(xì)菌素研究的不斷深入，乳酸菌細(xì)菌素在抑菌性、安全性及其它活性研究方面逐漸被認(rèn)識(shí)。乳酸菌細(xì)菌素作為一種最具發(fā)展前途的天然防腐劑，可降低食品滅菌溫度，提高食品品質(zhì)，縮短食品滅菌時(shí)間，減少食品營(yíng)養(yǎng)破壞，延長(zhǎng)食品保質(zhì)期。目前，全世界已有60多個(gè)國(guó)家和地區(qū)將乳酸鏈球菌素作為食品防腐劑添加到肉類、罐頭、乳制品、蔬菜和啤酒等食品中。但只有Nisin一種細(xì)菌素被商業(yè)化，由于其抑菌譜窄，只能抑制部分革蘭氏陽性菌，使應(yīng)用受到了極大的限制[18]。

本研究利用從健康新生嬰兒糞便中分離篩選得到產(chǎn)細(xì)菌素的L.plantarum ZJ316為試驗(yàn)菌株，利用噴霧干燥技術(shù)將其發(fā)酵上清液制備得到細(xì)菌素產(chǎn)品，優(yōu)化了噴霧干燥試驗(yàn)條件（食鹽添加量、進(jìn)口溫度、風(fēng)機(jī)工作效率、蠕動(dòng)泵工作效率），利用食鹽作為輔料時(shí)，可使產(chǎn)品質(zhì)地蓬松，水溶性好，不易吸潮，這些特點(diǎn)類似于商品化的Nisin。該研究建立細(xì)菌素高效制備體系，有望實(shí)現(xiàn)細(xì)菌素制品在食品工業(yè)、醫(yī)藥制品、畜牧產(chǎn)品中的應(yīng)用。