自噬相關(guān)蛋白5通過p53/p21通路調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞衰老

胡福清，陳雅祺，吳齊，胡俊波，王桂華，劉鷺

0 引言

自噬相關(guān)蛋白5（autophagy related protein5,ATG5）是一種重要的自噬小體形成相關(guān)蛋白，主要起類E1樣激活酶作用[1-2]。大量的文獻(xiàn)報道，除了發(fā)揮調(diào)控自噬的作用外，ATG5在病毒免疫、腫瘤凋亡和腫瘤增殖中也發(fā)揮了重要的作用[3-5]，有研究提示ATG5有望成為臨床腫瘤治療的新靶點[6]。然而ATG5與腫瘤細(xì)胞衰老的關(guān)系鮮有報道。

腫瘤最重要的生物學(xué)特點體現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞倍增時間縮短，分裂能力增強，而造成這一特性的原因目前尚不清楚，因此臨床針對腫瘤靶向治療取得的效果亦有限，深入探討腫瘤發(fā)生發(fā)展的具體分子機制顯得尤為重要。腫瘤衰老目前被認(rèn)為是一種抑制腫瘤增殖與分裂的重要方式，研究目前已認(rèn)為其機制與p53/p21、p16/RB、細(xì)胞周期蛋白等信號通路密切相關(guān)[7-8]。針對腫瘤衰老機制深入的研究有望為腫瘤干預(yù)帶來新措施和新思路。因此本文將重點闡明ATG5與腫瘤衰老的關(guān)系，探討以ATG5為分子靶點作為治療腫瘤的可行性。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑

人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞由華中科技大學(xué)附屬同濟醫(yī)院分子生物中心保種培養(yǎng)傳代。β-半苷乳糖檢測試劑盒以及CCK8檢測試劑盒（cell counting kit-8）購于江蘇碧云天生物公司，多柔比星（DOX，10 mmol/L）購于上海Med Chem Express（MCE）公司。轉(zhuǎn)染試劑Lipo2000和Opti-MEM培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司，針對ATG5特異性siRNA和對照無序小干擾RNA購于廣州銳博生物公司。ATG5、GAPDH、P53和P21抗體均購自美國Santa Cruz生物科技公司，高糖培養(yǎng)基購于武漢啟動子生物公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

結(jié)腸癌HT29細(xì)胞培養(yǎng)在含有5%CO2的37℃恒溫箱中，建立誘導(dǎo)結(jié)腸癌衰老模型時，使用1 μmol/L多柔比星于HT29細(xì)胞中孵育24 h。細(xì)胞傳代時，使用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞2 min，加入高糖培養(yǎng)基中和胰蛋白酶，將細(xì)胞輕柔吹打成單細(xì)胞懸液。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將結(jié)腸癌HT29細(xì)胞鋪于6孔板中加入2 ml完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁，融合度達(dá)60%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。分別將siRNA和Lipo2000溶于250 μl Opti-MEM培養(yǎng)基中，靜置5 min后將siRNA和Lipo2000輕柔混合再次靜置20 min。期間，棄6孔板中細(xì)胞培養(yǎng)基，加入1.5 ml完全培養(yǎng)基。20 min后，將siRNA和Lipo2000混懸液輕柔加入六孔板中，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.4 細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色

將細(xì)胞鋪于6孔板中進(jìn)行相應(yīng)實驗干預(yù)，通過多柔比星誘導(dǎo)細(xì)胞衰老或利用siRNA低表達(dá)ATG5后，棄細(xì)胞培養(yǎng)基，加入1 ml β-半乳糖苷酶染色固定液，室溫放置15～30 min。吸出固定液后用PBS洗滌細(xì)胞2～3次。每孔加入1 ml染色工作液后，將6孔板封口膠封閉置于不含CO2的37℃烘箱中孵育12 min。次日將6孔板取出，顯微鏡下觀察細(xì)胞著色情況并拍照。

1.5 CCK8法檢測細(xì)胞增殖

細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，將各組細(xì)胞鋪于96孔板，每孔約3 000個細(xì)胞，每組設(shè)置3個復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后，分別于0、24、48、72 h在每孔中加入10 μl CCK8，孵育2 h后，使用酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞在450 nm波長處吸光度，繪制各組細(xì)胞生長曲線。

1.6 Western blot檢測蛋白表達(dá)

將細(xì)胞鋪于6孔板中，通過多柔比星誘導(dǎo)細(xì)胞衰老或利用siRNA低表達(dá)ATG5后，將細(xì)胞置于冰上，細(xì)胞裂解液裂解30 min，刮取細(xì)胞置于1.5 ml EP管中，高速低溫離心（4℃，12 000 r/min）15 min，取上清液測蛋白濃度，計算樣品濃度及蛋白上樣量。加樣以SDS-PAGE膠電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉。分別孵育一抗和二抗后，在Western blot曝光機下利用ECL發(fā)光顯色。

1.7 PI染色細(xì)胞周期實驗

將細(xì)胞鋪于6孔板中，通過多柔比星誘導(dǎo)細(xì)胞衰老或利用siRNA低表達(dá)ATG5后，胰酶消化收集細(xì)胞，低速離心（常溫，1 200 r/min），每管加入預(yù)冷的80%乙醇固定細(xì)胞。過夜，低速離心后，PBS洗滌細(xì)胞沉淀一次，加入200 μl binding buffer，同時分別加入5 μl PI和5 μl RNase，吹打均勻后室溫避光靜置30 min，流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的細(xì)胞周期分布變化。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，檢驗方法采用t檢驗。每組實驗均進(jìn)行了三次獨立重復(fù)實驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ATG5蛋白在多柔比星誘導(dǎo)的結(jié)腸癌衰老模型中的表達(dá)

為檢測ATG5是否參與了結(jié)腸癌衰老的過程，在HT29細(xì)胞中加入1 μmol/L多柔比星培養(yǎng)48 h，細(xì)胞衰老現(xiàn)象顯著增加，見圖1A。相對于對照組，誘導(dǎo)組細(xì)胞增殖活性明顯下降，見圖1B。同時誘導(dǎo)組細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯，見圖1C。證實多柔比星誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞衰老模型建立成功。另外收集細(xì)胞進(jìn)行Western blot檢測ATG5蛋白表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)相對于對照組，誘導(dǎo)組中ATG5蛋白的表達(dá)量顯著降低，提示ATG5蛋白可能參與了結(jié)腸癌細(xì)胞衰老過程，見圖1D。

圖1 ATG5在結(jié)腸癌衰老細(xì)胞中低表達(dá)Figure 1 ATG5 expression was downregulated in colon cancer cell senescence

2.2 ATG5對結(jié)腸癌細(xì)胞衰老的影響

在HT29細(xì)胞中瞬時轉(zhuǎn)染針對ATG5的siRNA（兩條靶向ATG5的不同siRNA序列：SiATG5#1和SiATG5#2）和對照siRNA（SiNC），24 h后，通過β-半乳糖苷酶染色檢測發(fā)現(xiàn)，siRNA對照組發(fā)生衰老細(xì)胞數(shù)平均值為3±1，而SiATG5組發(fā)生衰老細(xì)胞數(shù)平均值為11±2，見圖2A～B，提示低表達(dá)ATG5可促進(jìn)HT29細(xì)胞衰老。由于ATG5是自噬調(diào)控蛋白，因此為了排除自噬在ATG5調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞衰老中的作用，在低表達(dá)ATG5的同時加入自噬誘導(dǎo)劑Rapa（1 μmol/L）誘導(dǎo)自噬，24 h后SiNC對照組細(xì)胞發(fā)生衰老細(xì)胞數(shù)平均值為3±1，而SiATG5組發(fā)生衰老細(xì)胞數(shù)平均值為12±2，低表達(dá)ATG5+Rapa組發(fā)生衰老細(xì)胞平均值為12±1，見圖2C～D，提示ATG5對結(jié)腸癌細(xì)胞衰老的促進(jìn)作用并非依賴于自噬。

2.3 ATG5對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響

在HT29細(xì)胞中瞬時轉(zhuǎn)染針對ATG5的siRNA和對照siRNA，預(yù)轉(zhuǎn)染24 h后，將細(xì)胞消化接種于96孔板。CCK8法檢測細(xì)胞增殖能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)染48 h后相對于對照SiNC，SiATG5#1、SiATG5#2組細(xì)胞增殖能力明顯較弱（P＜0.05），見圖3A，提示ATG5通過調(diào)控細(xì)胞衰老來抑制HT29細(xì)胞的增殖。另外，在低表達(dá)ATG5的同時加入自噬誘導(dǎo)劑1 μmol Rapa誘導(dǎo)自噬，發(fā)現(xiàn)SiATG5#1組細(xì)胞和低表達(dá)ATG5+Rapa組之間細(xì)胞增殖活性無明顯差異，見圖3B。證實ATG5通過誘導(dǎo)衰老抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HT29增殖非依賴于自噬。

圖2 低表達(dá)ATG5促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞衰老Figure 2 Low expression of ATG5 promoted senescence of colon cancer cells

圖3 低表達(dá)ATG5抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖Figure 3 Low expression of ATG5 inhibited proliferation of colon cancer cells

2.4 ATG5可調(diào)控P53和P21的蛋白表達(dá)

蛋白免疫印跡方法發(fā)現(xiàn)，SiATG5#1、SiATG5#2組中P53和P21蛋白表達(dá)較對照組明顯增高，見圖4。上述結(jié)果提示了ATG5很有可能通過P53/P21信號通路調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞衰老進(jìn)而影響腫瘤的增殖。

3 討論

結(jié)腸癌是目前世界上發(fā)病率和致死率均較高的惡性腫瘤之一[9-10]。雖然臨床手術(shù)技術(shù)的提高和靶向藥物的研發(fā)使得部分結(jié)直腸癌患者的預(yù)后得到改善，但總體預(yù)后仍不理想[11]。細(xì)胞的衰老行為在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著阻滯的作用，阻遏腫瘤的增殖能抑制腫瘤生長[12]。目前已知PI3K/AKT、TGFβ/SMADs、RAS、p53/p21等多種信號通路[8]的異常激活參與了腫瘤的衰老過程。

圖4 低表達(dá)ATG5可促進(jìn)P53和P21蛋白的表達(dá)Figure 4 Low expression of ATG5 promoted expression of P53 and P21 proteins

ATG5作為自噬基因在自噬小體形成和自噬流過程中扮演了重要的角色并調(diào)控著腫瘤的多種生物學(xué)行為[13]。例如有學(xué)者報道下調(diào)ATG5通過抑制自噬促進(jìn)乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移[14]。多數(shù)研究均只關(guān)注ATG5通過調(diào)控自噬影響腫瘤的生物學(xué)行為，然而ATG5除了調(diào)控自噬作用外，是否有獨立于自噬的作用，目前尚無報道。同時ATG5在腫瘤衰老中的作用未見報道，腫瘤衰老過程中有大量的蛋白參與調(diào)控，相關(guān)蛋白的表達(dá)隨著衰老進(jìn)程的變化而變化。本研究中首先發(fā)現(xiàn)了在腫瘤細(xì)胞衰老的過程中，ATG5蛋白表達(dá)水平明顯下降，提示ATG5可能參與了腫瘤衰老的過程。為了探討ATG5是否能夠調(diào)控腫瘤衰老，進(jìn)一步通過特異性SiRNA構(gòu)建了低表達(dá)ATG5的結(jié)腸癌細(xì)胞模型。通過β-半乳糖苷酶染色首次發(fā)現(xiàn)ATG5低表達(dá)確實可促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的衰老，CCK8實驗結(jié)果進(jìn)一步揭示ATG5低表達(dá)可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖。這一結(jié)果提示ATG5很有可能通過調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞的衰老來影響腫瘤的增殖。以往的研究證實p21作為細(xì)胞周期抑制因子在腫瘤衰老中發(fā)揮了重要作用，而p53作為轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)錄水平激活p21的表達(dá)，進(jìn)而引起細(xì)胞衰老，抑制腫瘤的增殖[15]。為了探索ATG5調(diào)控腫瘤衰老的分子機制，本研究通過Western blot實驗證實了低表達(dá)ATG5可以直接影響P53/P21信號通路的表達(dá)。同時進(jìn)一步證實自噬水平升高后低表達(dá)ATG5仍可促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的衰老，這提示了自噬基因ATG5在結(jié)腸癌中發(fā)揮了非自噬作用，即：通過p53/p21信號通路調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞衰老進(jìn)而影響腫瘤的增殖。而在甲狀腺癌中有學(xué)者證實ATG5通過促進(jìn)自噬抑制腫瘤的增殖[16]，提示在不同腫瘤中ATG5調(diào)控腫瘤增殖的具體方式各有不同，同時提醒我們ATG5調(diào)控腫瘤進(jìn)展很有可能是通過影響衰老和自噬兩種水平方式來實現(xiàn)的。下一步課題組將集中探討ATG5在結(jié)腸癌中調(diào)控p53/p21的具體分子機制，以期望針對ATG5開發(fā)可用于臨床的特異性靶向藥物。