微管相關蛋白2和巢蛋白在人胚胎小腸中的表達*

劉學紅, 張 泳

(紹興文理學院醫(yī)學院 1組織學與胚胎學教研室，2醫(yī)學實驗中心,浙江 紹興 312000)

1000-4718(2012)03-0553-03

2011-08-29

2011-12-31

浙江省教育廳科研計劃項目(No.Y201018535)；紹興文理學院重點項目(No.2010LG1011)

△通訊作者 Tel:0575-88345099； E-mail:lxh6588@yahoo.com.cn

微管相關蛋白2和巢蛋白在人胚胎小腸中的表達*

劉學紅1△, 張 泳2

(紹興文理學院醫(yī)學院1組織學與胚胎學教研室，2醫(yī)學實驗中心,浙江 紹興 312000)

目的探討微管相關蛋白2(MAP-2)和巢蛋白(nestin)與人胚胎小腸壁組織發(fā)育的關系。方法應用免疫組織化學PV法和圖像分析(NIS-DR)軟件檢測第2、3、4個月齡段，人胚胎小腸組織內(nèi)MAP-2和nestin的表達分布規(guī)律，數(shù)據(jù)的組間比較采用單因素方差分析。結果第2、3、4個月齡段，MAP-2主要表達于人胚胎小腸壁黏膜下和肌間神經(jīng)叢內(nèi)神經(jīng)細胞和纖維，隨胎齡的增大，肌間神經(jīng)叢內(nèi)神經(jīng)細胞的陽性強度增強, 兩兩比較, 差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Nestin蛋白在小腸壁各層均有陽性表達，其黏膜下層和肌間神經(jīng)叢內(nèi)陽性細胞數(shù)量隨胎齡增大而呈先增高再降低的趨勢，兩兩比較, 差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論MAP-2和nestin參與調(diào)節(jié)人胚胎小腸壁組織的生長發(fā)育過程。

小腸； 微管相關蛋白2； 巢蛋白； 人胚胎

巢蛋白(nestin) 和微管相關蛋白2 (microtubule-associated protein 2，MAP-2)均屬于細胞骨架蛋白，其表達分布規(guī)律反映細胞的分化、生長發(fā)育及增殖能力。目前微管蛋白和巢蛋白在動物和人中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織中的分布及病理作用機制研究較多[1-4]，但關于它們在人胚胎小腸壁發(fā)育過程中的表達、分布規(guī)律國內(nèi)外文獻報道甚少。本文通過研究人胚胎小腸壁組織細胞生長發(fā)育過程中微管蛋白和巢蛋白的表達狀況，探討兩者在小腸壁組織細胞分化、發(fā)育過程中的分布規(guī)律及其作用，為先天性小腸疾病研究提供形態(tài)結構基礎和理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1胚胎收集與分組

收集因意外原因造成人工流產(chǎn)、發(fā)育正常的人胚胎標本16例(每例標本均取得產(chǎn)婦本人同意和院倫理委員會審批)。根據(jù)產(chǎn)婦末次月經(jīng)、B超所測胎兒雙頂徑和人胚胎形態(tài)學特征等確定胎齡為7～16周。以每4周為一月齡組，每月齡為一研究組，其例數(shù)分布如下：第2個月齡組5例，第3個月齡組6例，第4個月齡5例。

2取材和免疫組織化學染色程序

從胎尸內(nèi)取出小腸標本，分別從每例標本中切取腸管長約1.0 cm，用4 ℃生理鹽水沖洗腸管，放入10%的中性甲醛水溶液中固定12 h后，取出流水沖洗30 min，行常規(guī)脫水、透明、浸蠟和包埋。石蠟切片，片厚4 μm，每個標本取4片，行免疫組織化學染色(所用試劑MAP-2和nestin Ⅰ抗(小鼠抗人)及其輔助試劑盒均購于北京中杉金橋生物技術有限公司)。免疫組化染色采用PV法：即切片常規(guī)脫蠟至水→微波抗原修復→3%H2O2滅活內(nèi)源性酶→滴加Ⅰ抗(抗體濃度為1∶150)→PV6002→DAB顯色(在以上各步之間均用PBS洗滌5 min×3次)→蘇木精輕度復染，然后脫水，透明，中性樹膠封片，顯微鏡觀察。

3對照實驗

用PBS替代Ⅰ抗、Ⅱ抗作陰性對照，用已知陽性片作陽性對照。

4圖像分析及統(tǒng)計學處理

結 果

切片經(jīng)染色后，MAP-2和nestin陽性細胞的細胞質(zhì)/膜呈淡黃色、黃色或深黃色，細胞核不著色。第2～4月齡段，nestin蛋白在小腸絨毛間質(zhì)細胞、黏膜下及肌層血管內(nèi)皮細胞、神經(jīng)叢內(nèi)部分神經(jīng)細胞呈陽性表達，黏膜上皮和腸腺呈陰性表達，見圖1。隨著胎齡的增大，黏膜下層及肌間神經(jīng)叢內(nèi)nestin蛋白表達陽性細胞數(shù)量呈先增高再降低的趨勢,其差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 見表1。

MAP-2主要表達于人胚胎小腸壁黏膜下和肌間神經(jīng)叢內(nèi)神經(jīng)細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞和它們相連的神經(jīng)纖維,見圖2。隨胎齡的增大，肌間神經(jīng)叢內(nèi)神經(jīng)細胞的陽性強度增強, 其差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 見表2。

Figure 1. Expression of nestin protein in the small intestinal intermuscular nerve plexus and submucosal plexus at the 2nd to 4th months of fetal age(immunohistochemical staining,×400)↑:positive expression.A: 2 months; B:3 months; C:4 months.

圖1人胎第2～4個月齡時，巢蛋白在黏膜下和肌間神經(jīng)叢中的表達

Figure 2. The MAP-2 expression in the small intestinal intermusculer nerve plexus at the 2nd to 4th months of fetal age(immunohistochemical staining, ×400).↑:intensively positive expression.A:2 months; B: 3 months; C:4 months.

圖2人胎第2～4個月齡時，MAP-2蛋白在小腸肌間神經(jīng)叢中的表達

討 論

在人胚胎形成的第7周，小腸由中腸發(fā)育、分化、演變而成，此期，小腸四層結構已形成。正常小孩和成人胃腸道內(nèi)存在神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)，俗稱胃腸小腦，它作為周圍神經(jīng)系統(tǒng)的一部分，調(diào)控胃腸道正常蠕動等各種生理功能。目前臨床許多難治性胃腸功能紊亂性疾病均與胃腸道的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)異常有關。研究胃腸道神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)細胞的發(fā)生、演變規(guī)律，對深入研究胃腸道神經(jīng)功能失調(diào)及先天發(fā)育異常具有重要意義。據(jù)報道，巢蛋白為第Ⅵ類中間絲蛋白,參與調(diào)節(jié)細胞骨架形成、細胞信號轉(zhuǎn)導、組織器官發(fā)生，代表干細胞增殖、遷移、分化的特性，是神經(jīng)干細胞的標志性蛋白，被廣泛用于研究人和哺乳動物中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)神經(jīng)細胞的分化、發(fā)育及演變規(guī)律[5-9]。MAP-2是細胞骨架系統(tǒng)重要成分之一 ，主要存在于神經(jīng)元的胞體和突起中。MAP-2在神經(jīng)元的生長和發(fā)育、突起的形成和生長、細胞器運輸及信號轉(zhuǎn)導等方面起到重要作用[10-11]。本實驗結果顯示，第2～4月齡段，nestin蛋白在小腸絨毛間質(zhì)、黏膜下及肌層血管內(nèi)皮細胞、神經(jīng)叢內(nèi)部分神經(jīng)細胞胞質(zhì)呈陽性表達，黏膜上皮和腸腺呈陰性表達。隨著胎齡的增大，黏膜下層及肌間神經(jīng)叢內(nèi)nestin蛋白表達陽性細胞數(shù)量呈先增高再降低的趨勢。MAP-2主要表達于人胚胎小腸壁黏膜下和肌間神經(jīng)叢內(nèi)神經(jīng)細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞和它們相連的神經(jīng)纖維。隨胎齡的增大，肌間神經(jīng)叢內(nèi)神經(jīng)細胞的陽性強度增強。這說明在胚胎發(fā)育的早期階段，小腸壁在2個月齡尚處于生長發(fā)育形成期，腸壁組織細胞生長速度相對較慢，大部分細胞在此期處于靜止期，細胞積蓄能量，為第3個月齡段小腸壁組織的快速增長做準備。到了第3個月齡段，小腸為適應機體生長發(fā)育的需要，生長速度較前明顯加快，腸壁組織細胞大量增殖，腸壁內(nèi)大量血管和神經(jīng)細胞形成和增生，為滿足小腸壁增厚、增長的生理需要提供營養(yǎng)和信息保障。此期，腸壁內(nèi)原先處于靜止期的干細胞進入增殖、分化階段，使巢蛋白表達陽性細胞數(shù)量較前增多。隨著胎齡增大，第3個月齡段腸壁組織細胞的快速增殖，到了第4個月齡，小腸壁大部分組織細胞發(fā)育接近成熟，細胞骨架成分基本發(fā)育完善，肌細胞也由活躍的增殖期逐漸轉(zhuǎn)為靜止期，細胞增殖能力下降，nestin表達趨于減弱，甚至消失，而MAP-2陽性表達逐漸增強。這與nestin和MAP-2的生物學特性有關，即巢蛋白在干細胞中的表達通常為一過性, 當組織分化成熟時, 巢蛋白的表達即消失。而MAP-2則是神經(jīng)元成熟發(fā)育的重要標志物之一，其陽性表達強度反映神經(jīng)細胞發(fā)育成熟度和細胞內(nèi)微管組裝活動度。錢軍等[12]通過實驗也證實MAP-2的高表達可能在脊髓損傷后突觸結構的重建及受損神經(jīng)功能代償和修復中發(fā)揮重要作用。Cantarero等[13]報道nestin在大鼠十二指腸壁的表達分布規(guī)律與本研究結果基本一致，說明人和大鼠腸壁干細胞的分化發(fā)育機理存在一致性。

表1Nestin在第2～4個月齡段人胚胎小腸黏膜下層及肌間神經(jīng)叢內(nèi)陽性細胞數(shù)

GroupnNestinpositivecellcount2months520.0000±7.6594*3months638.1304±14.95844months532.9375±10.0696*

*P<0.05vs3 months.

表2MAP-2在第2～4個月齡段人胚胎小腸肌間神經(jīng)叢內(nèi)陽性表達強度

GroupnMAP-2positivecellintensity2months590.7888±9.4122*3months691.2775±3.565304months596.9577±4.4002*

*P<0.05vs3 months.

因此，我們認為在人胚胎早期生長發(fā)育過程中，MAP-2和nestin參與了調(diào)控小腸壁組織細胞分化、發(fā)育過程。

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Expressionofmicrotubule-associatedprotein2andnestininsmallintestinetissuesofhumanembryos

LIU Xue-hong1, ZHANG Yong2

(1DepartmentofHistologyandEmbryology,2MedicalLaboratoryCenter,MedicalCollege,ShaoxingUniversity,Shaoxing312000,China.E-mail:lxh6588@yahoo.com.cn)

AIM: To explore the relationship between expression of microtubule-associated protein 2 (MAP-2)/nestin and development of small intestine in human embryos.METHODSThe expression of MAP-2 and nestin proteins was detected in the second, third and fourth months of fetal human embryonic small intestinal tissues by the PV method of immunohistochemistry. The positive cell counts and positive intensities were analyzed with Nikon imaging system (NIS-DR). One-way ANOVA was applied to compare these positive cell counts and positive intensities.RESULTSAt the second, the third and the fourth month of human embryos, MAP-2 positive expression was observed in the neural cells and neural fibers of the intermuscular nerve plexus and submucosal plexus in the developing small intestines. With the fetal age increasing, the expressive intensity of MAP-2 positive cells in the neural tissues of the intermuscular nerve plexus showed an uptrend. The results of positive intensity values of the MAP-2 positive cells detected in the 3 fetal age periods showed significant difference (P<0.05). Nestin positive expression was seen in all layers of the small intestine, and the number of positive cells was first increased and then decreased in the developing small intestines of human embryos with the increasing fetal age. One-way ANOVA results also showed significant difference (P<0.05).CONCLUSIONMAP-2 and nestin regulate the development of small intestinal tissues in human embryos.

Intestine, small; Microtubule-associated protein 2; Nestin; Human embryo

R329.1

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.03.031