BCL-6在經(jīng)典型霍奇金淋巴瘤細胞株L428和過表達CD99的L428中的表達差異及其意義*

李 鋒, 黃作平, 黃學平, 王志強, 鐘 琳, 周新華, 吳自勍, 朱梅剛, 趙 彤△

(1南方醫(yī)科大學附屬南方醫(yī)院病理科，廣東 廣州 510515;2武警廣東省總隊醫(yī)院腫瘤科，廣東 廣州 510507)

1000-4718(2012)03-0409-06

2011-10-20

2012-01-05

國家自然科學基金資助項目(No.30770908;No.81071941)

△通訊作者 Tel:020-61648228;E-mail:zhaotongketizu@126.com

BCL-6在經(jīng)典型霍奇金淋巴瘤細胞株L428和過表達CD99的L428中的表達差異及其意義*

李 鋒1,2, 黃作平1, 黃學平1, 王志強1, 鐘 琳1, 周新華1, 吳自勍1, 朱梅剛1, 趙 彤1△

(1南方醫(yī)科大學附屬南方醫(yī)院病理科，廣東 廣州 510515;2武警廣東省總隊醫(yī)院腫瘤科，廣東 廣州 510507)

目的探究BCL-6在經(jīng)典型霍奇金淋巴瘤(classical Hodgkin’s lymphoma，cHL)細胞株L428和過表達CD99的L428(L428-CD99+)中的表達差異及其意義。方法應用免疫細胞化學和免疫熒光共聚焦檢測BCL-6和CD99在cHL細胞株L428和L428-CD99+中的表達；運用實時熒光定量PCR和Western blotting檢測細胞株L428和L428-CD99+中BCL-6和CD99的表達水平；MTT實驗檢測L428和L428-CD99+細胞增殖能力的差異；流式細胞術檢測L428和L428-CD99+細胞的凋亡差異。結果免疫細胞化學和免疫熒光共聚焦顯示CD99在L428細胞中為陰性表達，在L428-CD99+細胞中為陽性表達，并定位于細胞膜；BCL-6在L428細胞為陰性表達，在L428-CD99+細胞株中為陽性表達，并定位于細胞核。Western blotting顯示CD99和BCL-6在L428細胞為陰性表達，在L428-CD99+細胞為陽性表達。實時熒光定量PCR結果顯示，與L428細胞相比，CD99和BCL-6 mRNA在L428-CD99+細胞中的表達量增高(P<0.01)。MTT顯示L428細胞增殖能力強于L428-CD99+細胞(P<0.01)；流式細胞術顯示L428-CD99+細胞凋亡較L428細胞增多(P<0.01)。結論過表達CD99誘發(fā)BCL-6表達增高，可導致L428細胞增殖能力下降及凋亡增加。

L428細胞株； CD99； BCL-6

原癌基因bcl-6位于3q27，編碼706個氨基酸殘基的鋅指蛋白[1]。BCL-6蛋白為一核內(nèi)轉錄因子，可作為序列特異性的轉錄抑制劑，參與非霍奇金淋巴瘤中彌漫大B細胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)的發(fā)生發(fā)展[2]。CD99蛋白是一個分子量為32 000的跨膜糖蛋白，在大多數(shù)細胞表面表達。它作為一種細胞黏附分子，參與細胞黏附、凋亡過程，在腫瘤細胞的遷移、浸潤、侵襲及腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用[3]。文獻和我們以往研究發(fā)現(xiàn)CD99表達缺失與經(jīng)典型霍奇金淋巴瘤(classical Hodgkin’s lymphoma,cHL)的發(fā)生發(fā)展有關[4]，為此我們構建了穩(wěn)定表達CD99的cHL細胞株L428(L428-CD99+)[5]。本研究在以往研究基礎上，采用免疫細胞化學、免疫熒光共聚焦、實時熒光定量PCR、Western blotting等方法比較CD99和BCL-6在L428和L428-CD99+細胞之間的表達差異及其意義，從而明確在霍奇金淋巴瘤中CD99和BCL-6之間的關系及對細胞增殖和凋亡的影響。

材 料 和 方 法

1材料

1.1細胞株 cHL細胞株L428細胞由南方醫(yī)科大學廣東省分子腫瘤病理重點實驗室保存，過表達CD99的L428細胞株L428-CD99+由課題組前期構建，L428-CTR細胞為應用脂質體轉染技術轉染了空載體的L428細胞，均由南方醫(yī)科大學廣東省分子腫瘤病理重點實驗室保存。

1.2主要儀器和試劑 胎牛血清為杭州四季青生物工程材料有限公司產(chǎn)品；兔抗人CD99單克隆抗體購自Abcam,鼠抗人CD99單克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司,兔抗人BCL-6多克隆抗體購自北京博奧森生物技術有限公司，山羊抗兔IgG/辣根酶標記、山羊抗兔IgG/FITC和山羊抗鼠IgG/TRITC購自北京中杉金橋生物技術有限公司；免疫組化SP試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司；熒光共聚焦顯微鏡為Olympus FluoView 1000；流式細胞儀為Becton Dickinsion產(chǎn)品；總RNA提取試劑盒RNAisoTMPlus、逆轉錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time)和熒光定量PCR試劑盒SYBR Premix Ex TaqTM均為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品；Western blotting I抗稀釋液、II抗稀釋液和發(fā)光液均購自碧云天生物技術有限公司。

2方法

2.1細胞培養(yǎng) L428細胞、L428-CD99+細胞和L428-CTR細胞在含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，取對數(shù)期、生長狀態(tài)良好的細胞進行實驗。

2.2細胞蠟塊制作 具體制作方法見參考文獻[6]。

2.3免疫細胞化學 免疫細胞化學檢測采用SP法，具體操作如下：細胞蠟塊2 μm連續(xù)切片，石蠟切片脫蠟水化；用3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶；PBS洗后，分別用EDTA和檸檬酸溶液微波修復6 min和10 min，滴加I抗，37 ℃孵育1 h，PBS洗后，滴加過氧化物酶標記的II抗，37℃孵育45 min；PBS洗后，DAB顯色；蘇木素復染、脫水、透明、中性樹膠封片。以已知陽性片作為陽性對照，以陰性表達的細胞作陰性對照。

2.4免疫熒光共聚焦檢測細胞株中CD99和BCL-6的表達差異 (1)吸取培養(yǎng)瓶中的細胞懸液，經(jīng)離心去上清轉移至1.5 mL的EP管，0.02 mol/L PBS洗滌3次，每次5 min，用4%多聚甲醛0.5 mL室溫固定30 min，再用0.02 mol/L PBS洗滌3次，每次5 min；(2)0.2% Triton X-100 0.5 mL室溫破膜10 min，0.02 mol/L PBS洗3次，每次5 min；(3)10% 正常山羊血清0.2 mL封閉20 min，不洗；(4)I抗孵育：工作液鼠抗CD99抗體200 μL，稀釋后兔抗BCL-6抗體200 μL，4 ℃孵育過夜，第2 d室溫孵育30 min，0.02 mol/L PBS洗滌4次，每次3 min；(5)II抗孵育：在暗室內(nèi)操作，I抗為CD99樣品加山羊抗鼠IgG/TRITC 200 μL，I抗為BCL-6樣品加山羊抗兔IgG/FITC 200 μL，室溫避光，加上錫箔紙，孵育1 h，0.02 mol/L PBS洗3次，每次3 min；(6)每個樣品加DAPI 200 μL，室溫避光孵育5 min，0.02 mol/L PBS洗2次，每次5 min；(7)100 μL PBS重懸，轉移至confocal皿，激光共聚焦顯微鏡觀察。

2.5逆轉錄和熒光定量PCR檢測細胞株中CD99和BCL-6 mRNA的表達差異 取培養(yǎng)細胞懸液5 mL，離心去上清，每107細胞中加入1 mL RNAiso Plus試劑，用移液器反復吹吸，室溫靜置5 min，向上述裂解液加入200 μL的氯仿，蓋緊離心管蓋，劇烈振蕩15 s，室溫靜置5 min，12 000 r/min、4 ℃離心15 min。吸取上層無色上清液至一新離心管，加入等體積的異丙醇，混勻，室溫靜置10 min，12 000 r/min、4 ℃ 離心10 min，去上清，緩慢沿離心管壁加入1 mL預冷75 %乙醇，2 000 r/min、4 ℃離心5 min后小心棄去乙醇，室溫干燥沉淀5 min，加入無RNA酶的水30 μL，待RNA完全溶解后于-80 ℃保存。CD99、BCL-6及內(nèi)參照GAPDH引物序列見表1。細胞株的RNA按試劑盒步驟逆轉錄合成cDNA，作為模板進行熒光定量PCR 擴增，擴增程序如下：使用二步法進行檢測，預變性95 ℃ 30 s；變性95 ℃ 5 s；退火58 ℃(CD99)或55 ℃(BCL-6) 34 s，共40個循環(huán)。反應結束后，立即進行擴增曲線和融解曲線分析。以GAPDH作為內(nèi)參照，由公式2-ΔΔCt計算CD99和BCL-6 mRNA在這些細胞株中的相對表達量。

表1 熒光定量PCR的引物序列

2.6Western blotting檢測細胞株中CD99和BCL-6的表達差異 取L428細胞、L428-CTR細胞和L428-CD99+細胞懸液，離心去上清，提蛋白前將PMSF 1 μL加入100 μL蛋白裂解液RIPA，將混合液加入細胞，冰上超聲裂解細胞30次，每次大概0.5 s，間隔1 s，冰上裂解30 min，12 000 r/min離心30 min，取上清。BCA法測定蛋白濃度，酶標儀測定波長為570 nm，根據(jù)標準曲線計算出蛋白濃度。灌制10%分離膠，5%濃縮膠的SDS-PAGE 凝膠。吸取40 μg總蛋白，恒壓80 V 30 min。當溴酚藍前沿進入分離膠，把電壓提高到120 V，繼續(xù)電泳60 min直到溴酚藍到達分離膠底部。切膠濕轉恒流100 mA 120 min，將蛋白從SDS-PAGE 凝膠轉至PVDF膜。TBST配制5%的脫脂奶粉封閉。用I抗稀釋液按1∶100稀釋BCL-6抗體，1∶1 000稀釋CD99抗體，抗體和PVDF膜4 ℃孵育過夜。1 ∶5 000稀釋山羊抗兔IgG/辣根酶標記II抗，孵育1 h，增強化學發(fā)光(enhanced chemiluminescence, ECL) 顯影。UVI 凝膠成像系統(tǒng)攝像，Image-Pro Plus 5.10軟件分析。

2.7MTT檢測細胞株的增殖能力 RPMI-1640培養(yǎng)液將L428細胞、L428-CTR細胞和L428-CD99+細胞懸液調整為4×107cells/L，接種到96孔板上，每孔加細胞懸液200 μL，每組共設置3個復孔?？瞻讓φ占覲BS 200 μL。隨后，每孔加入20 μL 5 g/L的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去上清，每孔加150 μL DMSO，振蕩10 min，酶聯(lián)免疫儀檢測570 nm波長的吸光度值(A值)，每組實驗重復3次。

2.8流式細胞術檢測細胞株凋亡 取對數(shù)生長期L428細胞和L428-CD99細胞，離心去上清。將105～106個細胞懸浮于1 mL的RPMI-1640培養(yǎng)基中，再加入10 μL Hoechst 33342染液，混勻，37 ℃孵育15 min。加入1 mL buffer A工作液(用雙蒸水將10×buffer A 稀釋10倍)懸浮細胞，加入5 μL PI染液，室溫避光放置5～15 min后混勻。上機，流式細胞術檢測細胞的凋亡。

3統(tǒng)計學處理

用SPSS 13.0進行統(tǒng)計學處理。MTT實驗采用析因分析，熒光定量PCR實驗和流式細胞術測定細胞凋亡實驗采用One-way ANOVA，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1免疫細胞化學檢測CD99和BCL-6在細胞株中的表達

CD99在L428表達陰性(圖1A)，而在L428-CD99+為陽性表達(圖1B)，并定位于細胞膜；而BCL-6在L428表達陰性(圖1C)，在L428-CD99+為陽性表達(圖1D)，并定位于細胞核。

Figure 1. The expression of CD99 (A,B) and BCL-6 (C,D) in the cell lines of L428 (A,C) and L428-CD99+(B,D) detected by immunocytochemistry (SP,×400).

圖1免疫細胞化學檢測cHL細胞株L428和L428-CD99+中CD99和BCL-6的表達

2免疫熒光共聚焦檢測L428和L428-CD99+細胞中CD99和BCL-6的表達

在L428細胞中，CD99表達為陰性，而在L428-CD99+細胞(圖2A)表達陽性，且在細胞膜表達；BCL-6在L428細胞中表達為陰性，而在L428-CD99+細胞中表達為陽性(圖2B)，且在細胞核表達。

Figure 2. The expression of CD99 (A) and BCL-6 (B) in the cell lines of L428 and L428-CD99+detected by confocal immunofluorescence (×1 000).

圖2免疫熒光共聚焦檢測cHL細胞株L428、L428-CTR和L428-CD99+中CD99和BCL-6mRNA的表達

3熒光定量PCR檢測L428、L428-CTR和L428-CD99+細胞中CD99和BCL-6mRNA的表達

與L428和L428-CTR細胞相比，L428-CD99+細胞的CD99 mRNA表達量明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與L428和L428-CTR細胞相比，L428-CD99+細胞的BCL-6 mRNA表達量明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖3。

4Westernblotting檢測L428、L428-CTR和L428-CD99+細胞中CD99和BCL-6的表達

在L428細胞和L428-CTR細胞中，CD99為陰性表達，而在L428-CD99+細胞中，CD99為陽性表達；在L428細胞和L428-CTR細胞中，BCL-6為陰性表達，而在L428-CD99+細胞中，BCL-6為陽性表達，見圖4。

圖3熒光定量PCR檢測細胞株L428、L428-CTR和L428-CD99+中CD99和BCl-6mRNA的表達

Figure 4. Expression of CD99 and BCL-6 in the cell lines of L428, L428-CTR and L428-CD99+detected by Western blotting. β-actin was used as loading control.

圖4Westernblotting檢測細胞株L428、L428-CTR和L428-CD99+中CD99+和BCl-6的表達差異

5MTT檢測L428、L428-CTR和L428-CD99+細胞的增殖能力

MTT 法檢測L428、L428-CTR和L428-CD99+細胞體外增殖能力，經(jīng)析因設計方差分析，結果顯示不同細胞組之間差異顯著(F=427.671，P<0.01)；不同時點組對細胞體外增殖的影響差異顯著(F=2029.134,P<0.01)；細胞各組與各時點兩因素交互效應顯著(F=75.515,P<0.01)。3組細胞經(jīng)多重比較顯示，L428-CD99+細胞的增殖能力低于L428及L428-CTR細胞，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而L428和L428-CTR的增殖能力差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖5。

圖5MTT實驗檢測細胞株L428、L428-CTR和L428-CD99+增殖能力的差異

6流式細胞術檢測L428、L428-CTR和L428-CD99+細胞凋亡

結果可見L428-CD99+細胞凋亡率明顯高于L428及L428-CTR細胞，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，而L428和L428-CTR細胞的凋亡率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖6。

圖6流式細胞術檢測細胞株L428、L428-CTR和L428-CD99+的凋亡率

討 論

CD99的表達缺失是cHL發(fā)生發(fā)展的重要條件之一。1998年Kim 等[4]首先發(fā)現(xiàn)Hodgkin/Reed-sternberg(H/RS)細胞形態(tài)的發(fā)生與CD99表達缺失有關。本課題組前期也發(fā)現(xiàn)cHL病變組織內(nèi)的H/RS細胞及cHL細胞株L428中CD99表達缺失[7-8]，進一步證實了CD99在cHL中扮演了重要的角色。本課題組前期研究將小鼠B淋巴瘤細胞株A20的mCD99L2基因沉默，下調CD99的表達誘導了H/RS樣細胞的產(chǎn)生[9-10]。上述研究在人和鼠驗證了H/RS腫瘤細胞形態(tài)的發(fā)生與CD99表達缺失有關。本課題探究cHL細胞株L428中CD99過表達前后BCL-6的表達差異并探討其對細胞增殖及凋亡的影響。

BCL-6 的生物學功能是調節(jié)淋巴結生發(fā)中心B細胞的分化和發(fā)育成熟，故生發(fā)中心B細胞表達BCL-6[11]。本課題揭示了過表達CD99后L428 的BCL-6表達水平增高，誘導殘疾B細胞起源的cHL細胞株L428[12]向生發(fā)中心B細胞分化。BCL-6和細胞的凋亡也有著密切的關系，BCL-6的靶基因多數(shù)是抗凋亡基因如bcl-2或bcl-XL，BCL-6的表達增高往往伴隨著Bcl-2或Bcl-XL的表達下降，從而導致細胞凋亡增加[13]。

本課題用熒光定量PCR、免疫細胞化學、免疫熒光共聚焦和Western blotting等方法從基因和蛋白水平驗證了過表達CD99后的L428細胞BCL-6的表達水平增高，并且從MTT實驗和流式細胞術檢測細胞的凋亡率證實了過表達CD99后L428增殖能力減弱，細胞凋亡增加。這揭示了在L428細胞中，CD99過表達導致BCL-6的表達增高，有助于抑制細胞的增殖能力并促進細胞的凋亡，其原因可能是：一方面在cHL中NF-κB信號通路是持續(xù)激活的[14]，而BCL-6是轉錄因子抑制劑，可抑制cHL賴以生存的NF-кB信號通路的轉錄[15]，從而使cHL持續(xù)激活的NF-кB信號通路失活，從而影響細胞增殖能力和促進細胞凋亡；另一方面，Bcl-XL蛋白是一抗凋亡蛋白，在其啟動子區(qū)包含BCL-6蛋白的結合位點，也就是說Bcl-XL蛋白是BCL-6的靶蛋白，所以BCL-6能直接結合bcl-XL的啟動子區(qū)并抑制其表達。所以BCL-6表達增高，靶蛋白Bcl-XL表達就減少，抗凋亡的作用也減弱了，從而可促進細胞凋亡[16]。研究也顯示BCL-6的表達可以作為DLBCL獨立的預后因子，BCL-6在非霍奇金淋巴瘤中的高表達往往提示較好的預后[17]。Lossos等[18]研究表明在DLBCL中BCL-6蛋白高表達者比低表達者有更長的無病生存期，這也從臨床上進一步證明了BCL-6有促進腫瘤細胞凋亡的作用，使預后變好。

[1] Ye BH, Rao PH, Chaganti RS, et al. Cloning ofbcl-6, the locus involved in chromosome translocations affecting band 3q27 in B-cell lymphoma[J]. Cancer Res, 1993, 53(12): 2732-2735.

[2] Zhang A, Ohshima K, Sato K, et al. Prognostic clinicopathologic factors, including immunologic expression in diffuse large B-cell lymphomas[J]. Pathol Int, 1999, 49(12): 1043-1052.

[3] Lee I, Kim MK, Choi EY, et al. CD99 expression is positively regulated by Sp1 and is negatively regulated by Epstein-Barr virus latent membrane protein 1 through nuclear factor-κB[J]. Blood, 2001, 97(11): 3596-3604.

[4] Kim SH, Choi EY, Shin YK, et al. Generation of cells with Hodgkin’s and Reed-Sternberg phenotype through downregulation of CD99 (Mic2)[J]. Blood, 1998, 92(11): 4287-4295.

[5] 黃作平, 何 瀅, 周新華, 等.mic2/CD99基因克隆及在霍奇金淋巴瘤L428細胞株中表達[J]. 南方醫(yī)科大學學報, 2009,29(12): 2407-2409.

[6] 王志強, 黃學平, 黎相照, 等. 懸浮培養(yǎng)細胞的細胞塊制作及其應用[J]. 臨床與實驗病理學雜志,2009,25(6): 667-668.

[7] 李先茂, 李 燕, 趙 彤, 等. 霍奇金淋巴瘤CD99基因表達缺失的意義[J]. 第四軍醫(yī)大學學報,2004,25(23): 2136-2137.

[8] 沈麗佳, 何 瀅, 蔣會勇,等. mic2/CD99 在經(jīng)典型霍奇金淋巴瘤H/RS 細胞中的表達及與Eber-1/LMP-1相關性的研究[J].中國病理生理雜志, 2006, 22(4): 776-780.

[9] 何 瀅, 沈麗佳, 李祖國, 等.mCD99L2基因沉默對小鼠B淋巴瘤細胞系A20細胞轉化為H/RS樣細胞的影響[J]. 基礎醫(yī)學與臨床,2007,27(6):610-615.

[10]劉 芳,沈麗佳,陳小艷,等. 低表達mCD99L2鼠B淋巴瘤細胞亞系的建立及鑒定[J].中國病理生理雜志, 2008, 24( 8): 1501- 1505.

[11]Ye BH, Lista F, Lo CF, et al. Alterations of a zinc finger-encoding gene,BCL-6, in diffuse large-cell lymphoma[J]. Science, 1993, 262(5134): 747-750.

[12]Tinguely M, Rosenquist R, Sundstrom C, et al. Analysis of a clonally related mantle cell and Hodgkin lymphoma indicates Epstein-Barr virus infection of a Hodgkin/Reed-Sternberg cell precursor in a germinal center [J]. Am J Surg Pathol, 2003, 27(11): 1483-1488.

[13]Bai M, Agnantis NJ, Skyrlas A, et al. Increased expression of the bcl6 and CD10 proteins is associated with increased apoptosis and proliferation in diffuse large B-cell lymphomas[J]. Mod Pathol, 2003, 16(5): 471-480.

[14]Krappmann D, Emmerich F, Kordes U, et al. Molecular mechanisms of constitutive NF-κB/Rel activation in Hodgkin/Reed-Sternberg cells [J]. Oncogene,1999, 18(4): 943-953.

[15]Li Z,Wang X,Yu RY, et al. BCL-6 negatively regulates expression of the NF-κB1 p105/p50 subunit[J]. J Immunol, 2005,174(1):205-214.

[16]Tang TT, Dowbenko D, Jackson A, et al. The forkhead transcription factor AFX activates apoptosis by induction of the BCL-6 transcriptional repressor [J]. J Biol Chem, 2002, 277(16): 14255-14265.

[17]Chen YW, Hu XT, Liang AC, et al. High BCL6 expression predicts better prognosis, independent ofBCL6 translocation status, translocation partner, orBCL6-deregulating mutations, in gastric lymphoma[J]. Blood, 2006, 108(7): 2373-2383.

[18]Lossos IS, Jones CD, Warnke R, et al. Expression of a single gene, BCL-6, strongly predicts survival in patients with diffuse large B-cell lymphoma [J]. Blood, 2001, 98(4): 945-951.

DifferentialexpressionofBCL-6incelllinesofclassicalHodgkin’slymphomaL428andL428

LI Feng1, 2, HUANG Zuo-ping1, HUANG Xue-ping1, WANG Zhi-qiang1, ZHONG Lin1, ZHOU Xin-hua1, WU Zi-qing1, ZHU Mei-gang1, ZHAO Tong1

(1DepartmentofPathology,NanfangHospitalAffiliatedtoSouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China;2DepartmentofOncology,GuangdongProvincialArmedForcesHospital,Guangzhou510507,China.E-mail:zhaotongketizu@126.com)

AIM: To investigate the expression of BCL-6 in classical Hodgkin’s lymphoma (cHL) cell lines, L428 (negative expression of CD99) and L428-CD99+(overexpression of CD99).METHODSThe expression of CD99 and BCL-6 at protein and mRNA levels was detected in the cell lines of L428 and L428-CD99+by the methods of immunocytochemistry, confocal immunofluorescence, real-time fluorescence quantitative PCR and Western blotting. MTT assay was used to determine the difference of proliferation between the cell lines of L428 and L428-CD99+. Apoptosis was analyzed by flow cytometry in the cell lines.RESULTSThe results of immunocytochemistry and confocal immunofluorescence showed that the expression of CD99 and BCL-6 was negative in L428 cell line, but positive in L428-CD99+cell line. The CD99 was localized in the membrane while BCL-6 expression was in the nucleus. The results of real-time fluorescence quantitative PCR showed that the mRNA expression levels of BCL-6 and CD99 in L428-CD99+cells were significantly higher than those in L428 cells (P<0.01). MTT assay showed that the proliferation capacity of L428 cells was higher than that of L428-CD99+cells (P<0.01). More apoptotic cells in L428-CD99+cell line than that in L428 cell line (P<0.01) were found.CONCLUSIONThe increased expression of CD99 and BCL-6 may lead to lower proliferation capacity and higher apoptotic rate of cHL, which are expected to be helpful in prevention and treatment of cHL.

L428 cell line; CD99; BCL-6

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.03.005