林下參根皂苷類化合物優(yōu)化提取與鑒定

肖涵，張群，王瑋銓，韓宇，馮印，尤麗新，胡楠楠，陳海燕，*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長春130118；2.長春科技學(xué)院，吉林長春130600）

林下參（Panax ginseng C.A.Meyer cv.Silvatica），別名籽海山參，人為將其種子播種到自然環(huán)境中，使其自然生長，生長于天然針闊葉混交林或闊葉次生林，主要產(chǎn)于吉林省、遼寧省長白山山脈和黑龍江省。林下參生長周期長，富含野生人參的珍貴營養(yǎng)成分，大補元氣、回陽散逆、滋陰、益血、生津、強心，所含的有效活性成分人參皂苷（ginsenoside）具有防癌抗腫瘤、增強免疫力、抗心律失常、延緩衰老、抗疲勞、改善記憶與學(xué)習(xí)能力、消炎解毒、抗血栓等藥理作用，本次試驗通過超聲輔助法進行提取，紫外分光光度法和高效液相色譜法進行定性定量，對林下參根中有效活性成分進行研究，借助響應(yīng)面法進行優(yōu)化，為林下參根皂苷類化合物研發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生林下參：吉林省長白山撫松縣；甲醇、乙醇、正丁醇、正戊醇、冰乙酸、高氯酸：天津市富宇精細化工有限公司；香草醛：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；D101大孔吸附樹脂：山東東鴻化工有限公司；人參皂苷Ro標準品、人參皂苷Rd 標準品：成都曼斯特生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YP202N 型電子天平：上海舜宇恒平科技儀器有限公司；KQ-250DE 型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；SHZ-D（III）型循環(huán)水真空泵：邦西儀器科技（上海）有限公司：GZX-9140MBE 型電熱鼓風(fēng)干燥箱：博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；UVmini-1280 型紫外分光光度計：島津（蘇州）有限公司。

1.3 人參皂苷的提取

1.3.1 大孔吸附樹脂預(yù)處理

本試驗使用D101 型大孔吸附樹脂，濕法裝柱后使乙醇液面高于樹脂層約10 cm，浸泡4 h~5 h，用乙醇以2 BV/h 的流速通過樹脂層，洗至流出液與2 倍體積的水混合后澄清為止。用水以同樣流速通過樹脂柱，至無醇味為止，即可投入使用。

1.3.2 人參皂苷的提取

樣品的制備：野生林下參洗凈切片，烘干粉碎，過20 目篩，置密封袋中保存?zhèn)溆谩?/p>

人參皂苷的提?。簻蚀_稱取5.00 g 林下參根粉末，按一定料液比加入一定濃度的溶劑，浸提30 min 后超聲輔助提取，真空抽濾，濾渣重復(fù)上述提取步驟，共提取3 次，合并提取液，提取液過D101 大孔吸附樹脂進行純化，乙醇洗脫，收集洗脫液，進行濃縮干燥，得到人參皂苷樣品。

1.3.3 人參皂苷含量的測定

標準曲線和回歸方程的建立：準確稱取0.015 g 人參皂苷樣品粉末溶于甲醇并定容至50 mL，備用。準確稱取0.506 1 g 香草醛溶于冰醋酸并定容10 mL，備用。分別取已配好的人參皂苷母液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 于6 支干凈的試管中，水浴蒸干，再向每支試管加入高氯酸0.8 mL 和香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL，70 ℃水浴30 min，冰浴降溫后向各試管加入冰醋酸5 mL，在545 nm 處測定吸光值。以吸光度為縱坐標（y），標品含量為橫坐標（x），繪制標準曲線，得回歸方程。

人參皂苷含量測定：準確稱取人參皂苷樣品0.015 0 g，溶于甲醇并定容至50 mL 為樣液，備用。按上述標準曲線的建立條件進行樣液的吸光度測定，將吸光度代入回歸方程得樣品中人參皂苷的含量。

1.4 單因素試驗設(shè)計

1.4.1 溶劑對提取量的影響

準確稱取5 g 林下參根粉末5 份，按料液比1 ∶15（g/mL）分別加入水、80 %甲醇、80 %乙醇、80 %丁醇、80 %戊醇75 mL，浸提30 min，30 ℃超聲輔助30 min，重復(fù)3 次，得粗濾液。

1.4.2 溶劑濃度對提取量的影響

準確稱取5 g 林下參根粉末5 份，按料液比1 ∶15（g/mL）分別加入45%、55%、65%、75%、85%的乙醇75 mL，浸提30 min，30 ℃超聲輔助30 min，重復(fù)3次，得粗濾液。

1.4.3 料液比對提取量的影響

準確稱取5 g 林下參根粉末4 份，按料液比1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25（g/mL）加入65%乙醇，浸提30 min，30 ℃超聲輔助30 min，重復(fù)3 次，得粗濾液。

1.4.4 超聲溫度對提取率的影響

準確稱取5 g 林下參根粉末4 份，按料液比1 ∶15（g/mL）加入65%的乙醇75 mL，浸提30 min，20、30、40、50 ℃超聲輔助30 min，重復(fù)3 次，得粗濾液。

1.4.5 超聲輔助時間對提取量的影響

準確稱取5 g 林下參根粉末5 份，按料液比1 ∶15（g/mL）加入65%的乙醇75 mL，浸提30 min，30 ℃超聲輔助20、30、35、40 min，重復(fù)3 次，得粗濾液。

1.5 提取率計算

通過高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）鑒定最佳提取方案所得樣品，對比標品峰與樣品峰的峰面積，根據(jù)公式（1）計算得到樣品中人參皂苷的提取率。

1.6 響應(yīng)面法優(yōu)化提取方案

通過單因素試驗，選取3 個因素3 個水平進行響應(yīng)面試驗設(shè)計，水平分別以-1、0、1 編碼，以吸光度為響應(yīng)值進行優(yōu)化，見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素水平表Table 1 Response surface test factor level table

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線的繪制

以標品溶液中標品含量（mg）為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線，見圖1~圖2，得回歸方程y1=4.068 9x+0.012（R2=0.999 1）和y2=5.240 1x+0.005 4（R2=0.999 2）。

圖1 人參皂苷Ro 標準曲線Fig.1 Standard curve of ginsenoside Ro

圖2 人參皂苷Rd 標準曲線Fig.2 Standard curve of ginsenoside Rd

2.2 單因素結(jié)果與分析

2.2.1 溶劑種類對提取量的影響

分別以水、80%甲醇、80%乙醇、80%正丁醇、80%正戊醇作為溶劑進行人參皂苷的提取，通過回歸方程計算出樣品中人參皂苷Ro 和Rd 的含量繪制折線圖，結(jié)果見圖3。

圖3 溶劑種類對提取量的影響Fig.3 Influences of solvent type on extracting amount

由圖3 可知，在受試溶劑中乙醇的提取量最高，正丁醇的提取量最低，各溶劑對于人參皂苷Ro 的提取量高于人參皂苷Rd 的含量，故選取乙醇為提取溶劑。

2.2.2 乙醇濃度對提取量的影響

分別以45%、55%、65%、75%、85%的乙醇作為溶劑進行人參皂苷的提取，計算樣品中人參皂苷Ro和Rd 的含量繪制折線圖，結(jié)果見圖4。

圖4 乙醇濃度對提取量的影響Fig.4 Influences of ethanol concentration on extracting amount

由圖4 可知，乙醇濃度對人參皂苷的提取量影響明顯，提取量與乙醇濃度成正比，濃度達到65%后提取量變化不明顯，本著節(jié)約資源成本的原則，選擇65 %乙醇為最佳濃度。

2.2.3 料液比對提取量的影響

分別按料液比1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25（g/mL）進行人參皂苷的提取，計算樣品中人參皂苷Ro 和Rd 的含量繪制折線圖，結(jié)果見圖5。

圖5 料液比對提取量的影響Fig.5 Influences of solvent/solid ratio on extracting amount

由圖5 可知，料液比對人參皂苷提取量的影響隨著料液比的增加而升高，料液比達到1 ∶15（g/mL）以后，提取量變化不明顯，即料液比1 ∶15（g/mL）可以將有效成分基本提取完全，選擇1 ∶15（g/mL）為最佳料液比。

2.2.4 提取溫度對提取量的影響

分別用20、30、40、50 ℃的超聲溫度進行人參皂苷的提取，計算樣品中人參皂苷Ro 和Rd 的含量繪制折線圖，結(jié)果見圖6。

圖6 提取溫度對提取量的影響Fig.6 Influences of extraction temperature on extracting amount

由圖6 可知，提取溫度對人參皂苷的提取量有顯著影響，溫度在20 ℃～30 ℃之間呈現(xiàn)增長趨勢，30 ℃達到最高值，在30 ℃～50 ℃之間，溫度越高提取量越低，猜測因為溫度的升高使某些有效成分分解，從而造成提取量的下降，選擇30 ℃為最佳超聲提取溫度。

2.2.5 提取時間對人參皂苷樣品吸光度的影響

分別以20、25、30、35、40 min 的超聲時間進行人參皂苷的提取，計算樣品中人參皂苷Ro 和Rd 的含量繪制折線圖，結(jié)果見圖7。

由圖7 可知，提取時間在20 min～35 min 之間時，時間與提取量成正比，達到30 min 后提取量升高不明顯；在35 min～40 min 之間時，隨著時間增長提取量降低，猜測超聲時間過長導(dǎo)致提取干擾雜質(zhì)過多，從而有效成分提取量降低，因而選擇30 min 為最佳超聲提取時間。

圖7 提取溫度對提取量的影響Fig.7 Influences of extraction time on extracting amount

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果與分析

2.3.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計

根據(jù)單因素的結(jié)果分析，按照中心組合試驗設(shè)計原理，選取乙醇濃度、料液比、超聲時間進行三因素三水平的試驗設(shè)計，因素水平分別以-1、0、1 編碼，以吸光度為響應(yīng)值，見表1。以乙醇濃度（A）、料液比（B）、超聲時間（C）為自變量，以人參皂苷樣品的吸光度為響應(yīng)值（Y），用Design-expert 8.0.6.1 軟件進行響應(yīng)面數(shù)據(jù)分析，得回歸方程為：

Y=0.92-0.014×A+0.016×B+9.313×10-3×C+4.050×10-3×A×B+3.200×10-3×A×C-7.250×10-4×B×C-0.12×A2-0.10×B2-0.077×C2。方差分析結(jié)果見表2。

由表2 可知，A、B、C、AC、BC、A2、B2、C2因素對人參皂苷樣品吸光度的影響顯著，其中乙醇濃度和料液比以及超聲時間交互作用也會對樣品吸光度有顯著影響。分析方程方差，由總模型P＜0.001 可知本試驗所選取的二次多項式模型具有高度的顯著性；失擬項為0.927 3＞0.05，故失擬項不顯著；R2=0.995 8 和R2adj=0.990 4 說明模型可以解釋99.04%響應(yīng)值的變化，說明該模型的擬合度較好。

表2 方差分析結(jié)果Table 2 Variance analysis results

2.3.2 響應(yīng)面圖分析

根據(jù)多元回歸方程得到的三因素對林下參根中提取的人參皂苷吸光度具有影響的響應(yīng)面圖，見圖8。

圖8 三因素對樣品吸光度值影響的響應(yīng)面圖Fig.8 Response surface plots showing the interactive effects of ethanol concentration，solvent/solid ratio，time on the ginsenoside extraction yield

由圖8 可知，三因素間交互作用不顯著，在相同試驗條件下，隨著乙醇濃度的增加，人參皂苷提取量呈現(xiàn)增長趨勢；超聲提取時間的增長，提取的人參皂苷含量呈現(xiàn)先增后降的趨勢，考慮可能是由于加熱時間過久其中的部分皂苷出現(xiàn)分解，從而使皂苷出現(xiàn)少量的減少；對于料液比對提取的影響，顯示隨著料液比的變化，提取的皂苷呈現(xiàn)增長的趨勢，呈現(xiàn)正相關(guān)。

2.3.3 最佳條件預(yù)測及驗證試驗

通過Design-expert 8.0.6.1 軟件進行數(shù)據(jù)分析，得到林下參中人參皂苷樣品的最佳提取條件是乙醇濃度為65.4 %；料液比為1 ∶21（g/mL）；超聲時間為32 min。在理論上林下參人參皂苷樣品的吸光度為1.018 7，考慮實際情況，確定最佳提取條件是乙醇濃度為65%；料液比為1 ∶20（g/mL）；超聲時間為30 min。在此條件下提取3 次，樣品吸光度分別為1.021 3、0.998 7、1.015 6，平均值為1.011 9，與理論值想接近。將吸光度代入標準曲線回歸方程，得人參皂苷Ro 和Rd 含量分別為0.246、0.192 mg，以人參皂苷Ro 和Rd標準品為提取標準，則提取率分別為82%和64%。

2.4 最佳方案HPLC 鑒定結(jié)果

通過響應(yīng)面優(yōu)化得到最佳的提取方案，按照該方案提取得到樣品進行液相檢測，色譜條件為，色譜柱：C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫35 ℃；流速1 mL/min；波長：203 nm；流動相為乙腈：0.1%磷酸水=35 ∶65。人參皂苷Ro 和Rd 標準品溶液HPLC 色譜圖見圖9。

樣品溶液HPLC 色譜圖見圖10。

根據(jù)出峰時間可知圖10 中1' 號峰為人參皂苷Ro，2'峰為人參皂苷Rd。對比樣品與標品HPLC 色譜圖，根據(jù)公式（1）計算可得樣品中人參皂苷Ro 的提取率為74.6%，人參皂苷Rd 的提取率為87.1%。

圖9 人參皂苷Ro 和Rd 標準品溶液HPLC 色譜圖Fig.9 HPLC chromatograms of ginsenoside Ro and ginsenoside Rd standards

圖10 樣品溶液HPLC 色譜圖Fig.10 HPLC chromatograms of ginsenoside Ro and ginsenoside Rd samples

3 結(jié)論

通過單因素試驗對溶劑種類、溶劑濃度、料液比、溫度及時間進行研究后發(fā)現(xiàn)，乙醇在受試溶劑中提取量最高，提取量隨溶液體積的增加而增長，提取量隨提取溫度和時間的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。選取三因素三水平進行響應(yīng)面優(yōu)化，結(jié)果顯示各因素見交互作用不明顯，確定最佳提取條件是乙醇濃度為65%，料液比為1 ∶20（g/mL），超聲時間為30 min。該條件下所得樣品，通過HPLC 色譜圖對比可得樣品中人參皂苷Ro 的提取率為74.6%，人參皂苷Rd 的提取率為87.1%。