巨噬細胞條件性Atg5基因敲除小鼠的構建及鑒定

黃小榮，黃衍恒，葉霖，楊陳，湯濟鑫，安寧，劉建興，劉華鋒

(廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院腎病研究所，湛江市慢性腎臟病防控重點實驗室，湛江 524001)

巨噬細胞屬于單核吞噬細胞家族成員，既在固有免疫中起重要作用，也可通過招募其他免疫細胞如淋巴細胞產生適應性免疫反應，進而在機體免疫反應、組織損傷和修復中起關鍵作用[1]。根據表型和功能不同，巨噬細胞可分為不同的亞類，一般可分為經典活化型M1促炎巨噬細胞(M1)和替代活化型M2抗炎巨噬細胞(M2)。M1可大量分泌TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-23、活性氧簇(ROS)等促炎細胞因子；而M2則可分泌IL-4、IL-13、IL-10、TGF-β1等炎癥抑制因子，及成纖維細胞生長因子及血小板衍生因子等促纖維化因子[2-3]。幾乎所有類型的急性腎損傷和進行性慢性腎臟病都可在腎小球及腎間質中檢測到巨噬細胞浸潤[4]，且根據腎臟微環(huán)境變化，巨噬細胞可在促炎表型和抗炎促纖維化表型之間進行轉化[5]，從而在腎小管-間質損傷、修復和纖維化各階段中發(fā)揮著不同作用[4, 6-8]，顯著影響腎小管-間質損傷的最終轉歸。

近年來，自噬通路在腎小管-間質損傷進程中的作用越來越受關注；而目前對自噬的研究主要集中在TECs上[9-10]，免疫細胞自噬在腎臟疾病的作用研究尚涉及甚少?，F研究認為，自噬可影響免疫細胞的增殖、凋亡、遷徙、分化、活化以及炎癥因子分泌[11]。有研究表明在眼色素層炎[12]、高脂飲食誘導肥胖小鼠[13]、半乳糖胺聯合LPS誘導的急性肝損傷[14]等諸多炎癥模型中，特異性阻斷巨噬細胞自噬通路，可引起巨噬細胞炎癥體降解受阻而分泌大量炎癥因子IL-1阻和IL-18，加劇疾病相關器官的炎癥反應及損傷嚴重程度[12]。因此巨噬細胞自噬很可能參與調節(jié)機體炎癥免疫反應，影響疾病進展。然而在腎臟疾病發(fā)生發(fā)展過程中，自噬如何調節(jié)巨噬細胞功能，進而影響腎臟疾病進展尚未知曉。

ATG5是自噬通路中的關鍵蛋白，對于自噬泡形成及降解是必不可少的[15]。ATG12-ATG/ ATG16復合物通過參與LC3-PE偶聯途徑或直接與膜結合兩種方式形成自噬體膜[16]；并且ATG5可通過與自噬體膜上的TECRP結合，促進自噬體與溶酶體融合[17-18]，形成自噬溶酶體，最終降解其所包裹的內容物。敲低或敲除ATG5可導致自噬下調或完全抑制，表明ATG5在自噬通路中起關鍵作用[19]。因此，巨噬細胞條件性Atg5基因敲除小鼠模型的構建，為在動物水平上研究巨噬細胞自噬在腎臟疾病發(fā)生發(fā)展中的作用是可行且非常必要的。在本實驗中我們將探討最佳繁殖方案、繁育小鼠基因型鑒定及Atg5敲除效果分析，為研究巨噬細胞自噬在腎臟疾病發(fā)病機制中的作用提供實驗材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

4月齡SPF級C57BL/6J-Atg5em2(flox)/SMOC小鼠共6只，雌雄各3只；LysM-Cre JAX stock No. 004781小鼠共4只，雌雄各2只，體重20 ～25 g，購于上海南方模式生物科技股份有限公司【SCXK(瀘)2017-0010】，飼養(yǎng)于廣東醫(yī)科大學實驗動物中心【SYXK(粵)2015-0147】。所有小鼠飼養(yǎng)于12 h/12 h光照/黑暗條件下，自由采食和飲水，所有操作均符合實驗動物倫理學要求(GDY1801016)。

1.1.2 試劑與儀器

Premix Tag 2.0 plus(TaKaRa，日本)；BIOWEST AGAROSE，Gel red核酸凝膠染料(聯碩科技有限公司，中國)；TAE緩沖液(廣州銳科生物有限公司，中國)；雷帕霉素(Sigma，美國)，氯喹(Sigma，美國)，anti-LC3 II antibody(Sigma，美國)；anti-SQSTM1/p62 antibody(MBL，日本)；anti-Atg5 antibody，辣根酶標記山羊抗兔IgG(Abcam，英國)；anti-GAPDH antibody(上海碧云天生物技術有限公司，中國)。

凝膠電泳儀(Bio-Rad，美國)；Azure biosystems c500雙激光近紅外成像分析儀(Azure biosystems，美國)；ProFlexTM3 x 32-well PCR System(Applied Biosystems，美國)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠尾部組織基因組DNA的提取、擴增及鑒定

(1) DNA提?。翰捎脡A裂解法提取鼠尾組織基因組DNA。待新生小鼠達3～4周齡打耳標后，剪取小鼠鼠尾約3 mm，置于1.5 mL EP管中；加入50 mmol/L NaOH溶液90 μL，置恒溫水浴鍋中95℃加熱30 min。待EP管冷卻后，加入1 mol/L Tris溶液(pH 8.0)10 μL充分震蕩混勻，以12 000 r/min離心2 min。取上清置于新1.5 mL EP管中，-20℃保存。

(2) PCR擴增：Flox基因的上游引物：5′-TTCAGTGTACCCTGTGTATTGG-3′，下游引物：5′-GGGAAACAGTTGTGTTCTTTGT-3′和Cre基因的上游引物：5′-CTTGGGCTGCCAGAATTTCTC-3′，下游引物：5′-CCCAGAAATGCCAGATTACG-3′，5′-TTACAG TCGGCCAGGCTGAC-3′；反應體系25 μL；擴增程序為94℃預變性2 min，94℃變性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)，72℃延伸5 min。

(3) PCR產物鑒定：PCR產物使用1.5%(質量濃度)瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠成像分析系統(tǒng)觀察分析條帶位置。瓊脂糖凝膠上的PCR條帶出現與Flox基因、Cre基因PCR產物大小一致的條帶為陽性結果，否則為陰性結果。

1.2.2 巨噬細胞Atg5基因敲除效果驗證

將已進行基因型鑒定的小鼠，進行敲除效果鑒定。待小鼠8周齡后，取Atg5+/+小鼠及Atg5-/-小鼠骨髓細胞，使用M-CSF刺激7 d，誘導為成熟巨噬細胞，提取其RNA及蛋白質。將提取的RNA逆轉錄為cDNA后，進行PCR擴增，上游引物序列：5′-TTCAGTGTACCCTGTG TATTGG-3′，下游引物序列：5′-GGGAAACAGTTGTGTTCTTTGT-3′，然后將PCR產物送天一輝遠生物科技有限公司進行測序。

用RIPA裂解液提取巨噬細胞蛋白，BCA法測定蛋白含量；按每孔30 μg總蛋白上樣，行SDS-PAGE電泳，電泳完成后將蛋白轉移至0.22 μm PVDF膜上；20 mL含5%BSA封閉液室溫封閉1 h；分別加入1× PBST稀釋的抗ATG5多克隆抗體(1∶1000)、抗LC3多克隆抗體(1∶1000)、抗P62多克隆抗體(1∶1000)和抗GAPDH單克隆抗體(1∶1000)，4℃孵育過夜；20 mL 1×PBST緩沖液中洗膜3次，每次5 min；加入1×PBST緩沖液稀釋的二抗辣根酶標記山羊抗兔IgG (1∶1000)，置搖床室溫孵育1 h；20 mL 1×PBST緩沖液中洗膜3次，每次5 min；在Azure biosystems c500雙激光近紅外成像分析儀曝光成像。通過檢測自噬相關蛋白(如LC3 II、p62等)，觀察雷帕霉素(Rapamycin，10 μmol/L)及氯喹(Chloroquine，10 μmol/L)刺激24 h后，是否能夠激活/抑制Atg5-/-小鼠巨噬細胞自噬，進一步確定Atg5-/-小鼠巨噬細胞自噬功能缺陷。

2 結果

2.1 小鼠的繁殖情況

為挑選出最佳繁殖方案，我們在得到F2代小鼠后，采用了2種配種方式進行繁殖(圖1)；結果為若按F2a得到實驗小鼠(Atg5flox/floxCre+/-或Atg5flox/floxCre-/-)共5只，占50%(5/10)，若按F2b得到實驗小鼠(Atg5flox/floxCre+/-或Atg5flox/floxCre-/-)共3只，占25%(3/12)；以上兩種繁育方案的分離比例均符合基本孟德爾遺傳定律，表明巨噬細胞條件性敲除Atg5基因后對小鼠繁殖能力無明顯影響，且F2代采用F2a繁殖方式，獲得巨噬細胞條件性敲除Atg5基因小鼠及對照小鼠的效率更高。

2.2 小鼠基因型鑒定結果

將鼠尾組織基因組DNA進行擴增后電泳，結果見圖2。其中小鼠Flox基因型鑒定結果見圖2A，其中1為Flox/Flox純合小鼠(469 bp)，2、3和5為Flox/- 雜合子(469 bp和411 bp)，4為野生型(411 bp)。Cre基因型鑒定結果見圖2B，其中1、2、4、5為Cre+/-(700 bp和350 bp)，3和6為Cre-/-(350 bp)。

注：“→”為F2a繁殖方式，“--→”為F2b繁殖方式。圖1 小鼠繁殖方案Note. “→”is the propagation mode of F2a and “--→”is the propagation mode of F2b.Figure 1 Mice breeding program

注：A為小鼠Flox基因型鑒定結果，其中1為Flox/Flox純合小鼠，2、3和5為Flox/- 雜合子，4為野生型。B為Cre基因型鑒定結果，其中1、2、4、5為Cre+/-，3和6為Cre-/-。圖2 部分小鼠基因型PCR鑒定Note: A shows the identification results of Flox genotype in mice, in which 1 is Flox/Flox homozygous mouse, 2, 3 and 5 are Flox/- heterozygotes, and 4 is wild type. B shows the identification result of Cre genotype in mice, in which 1, 2, 4, 5 were Cre+/-, and 3 and 6 were Cre-/-.Figure 2 Results of genotype identification of some mice by PCR

2.3 Atg5基因敲除效果鑒定

分別提取Atg5-/-小鼠和Atg5+/+小鼠骨髓細胞，誘導成巨噬細胞；

(1)基因水平敲除效果鑒定：提取該骨髓來源的巨噬細胞RNA，逆轉錄為cDNA后，使用特異性引物進行PCR擴增，將PCR產物進行測序，結果顯示Atg5-/-小鼠編碼區(qū)Exon3(約128 bp)被敲除(圖3A-D)。

(2)蛋白水平敲除效果鑒定：提取兩組小鼠骨髓來源巨噬細胞蛋白進行Western blotting檢測，結果顯示：與Atg5+/+小鼠相比，Atg5-/-小鼠 ATG5 蛋白表達水平明顯減少(圖3E)；且Atg5-/-小鼠巨噬細胞內p62明顯增多，而LC3II明顯減少(圖3F)，提示Atg5-/-小鼠巨噬細胞內自噬水平低下。

(3)功能水平敲除效果鑒定：使用雷帕霉素(Rap)誘導自噬后，Atg5-/-小鼠巨噬細胞自噬不能恢復到正常基礎水平，提示Atg5-/-小鼠巨噬細胞自噬缺陷；綜上，巨噬細胞條件性Atg5基因敲除小鼠構建成功。

注：A、B分別為Atg5-/-(實驗組小鼠)和Atg5+/+(對照組小鼠)骨髓來源巨噬細胞Atg5 mRNA逆轉錄為cDNA的測序結果。C、D為兩組小鼠Atg5 mRNA改變示意圖。E為兩組小鼠骨髓來源巨噬細胞ATG5蛋白表達情況。F為使用雷帕霉素(Rap)和氯喹(CQ)調控自噬后，兩組小鼠骨髓來源巨噬細胞對該調控的反應情況。圖3 Atg5基因敲除效果鑒定Note. A and B are the sequencing results of Atg5-/- (experimental group) and Atg5+/+ (control group), respectively. C and D show the changes of Atg5 mRNA in mice of the two groups. E shows the expression of ATG5 protein in mouse bone marrow derived macrophages in the two groups. F shows the response of bone marrow derived macrophages of mice in the two groups to the regulation of autophagy by rapamycin (Rap) and chloroquine (CQ).Figure 3 Identification of the efficiency of gene Atg5 knockout

3 討論

基因敲除技術是利用一定的生物技術手段，使特定的目的基因缺失或者失活，從而排除其他因素對實驗結果的干擾，使實驗結果變得更可靠和直觀?；蚯贸ㄈ硇曰蚯贸皸l件性基因敲除兩種方法，其中全身性基因敲除是指在小鼠所有組織細胞中，將靶基因敲除掉，從而使靶基因的表達缺失。本文所提及的基因條件性敲除是利用Cre-Loxp重組系統(tǒng)，將Cre基因插入特定的啟動子序列后面，即可人為地控制Cre基因在某些細胞譜系或者在機體發(fā)育的特定時間段亦或在外源性藥物誘導下表達，表達的CRE蛋白識別特定的 DNA 序列 (如 Loxp 位點)，并進行Loxp 位點之間的靶基因剪切，從而實現目的基因在特定細胞類型中功能性缺失[20]。本研究中，我們選用了條件性Atg5基因敲除方案，一方面是出于實驗目的的考慮，另一方面也是為了避免全身性敲除Atg5基因導致小鼠胚胎期死亡或出生期死亡的劣勢[21]，我們引入的LysM-Cre小鼠是將CrecDNA靶向插入其內源性M溶菌酶基因座，從而使CRE重組酶特異性表達在包括巨噬細胞在內的髓樣細胞中。

由于巨噬細胞具有高度異質性，而且其基因表達譜和單核細胞、粒細胞及樹突狀細胞之間有很大的重疊[22]；因此，一個完全針對巨噬細胞的轉基因Cre小鼠在本質上是不存在的。目前靶向巨噬細胞的Cre小鼠主要是基于單核細胞/巨噬細胞標志物，如LysM、CSF1R、CD11b和CX3CR1等。其中Csf1r-Cre小鼠可用于研究巨噬細胞發(fā)育的命運圖譜分析，雖然該轉基因小鼠巨噬細胞基因敲除效率較高，但特異性很低，因Csf1r-Cre可表達于所有白細胞[23]。CD11b-Cre小鼠對巨噬細胞基因敲除效率較低，而且CD11b-Cre不僅表達在單核細胞和巨噬細胞，在中性粒細胞和樹突狀細胞也具有一定的活性。Cx3cr1-Cre小鼠主要針對單核/巨噬細胞和樹突細胞，對中性粒細胞的影響較小，但其在脾巨噬細胞以及外周血單核細胞基因的敲除效率相對較低[24]。雖然LysM也在大多數粒細胞和少數CD11c+樹突狀細胞中表達，但LysM-Cre小鼠對成熟巨噬細胞基因的敲除效率非常高[20]。因此，即使LysM-Cre小鼠對組織常駐巨噬細胞基因的敲除效率不高[24]，但其仍是研究巨噬細胞最常用的工具鼠。

為了研究自噬生物學功能，目前幾種自噬相關基因缺失小鼠已被報道構建成功，包括Atg5-/-、Atg7-/-和Beclin1-/-小鼠[21, 25-26]；其中BECLIN 1通過與VPS34結合，調控吞噬泡的形成及成熟；而ATG5是自噬通路的上游蛋白，啟動自噬體形成，并與ATG12和ATG16結合，促進LC3與PE結合，使LC3沉積在自噬體膜上；ATG7是ATG12與ATG5結合所必需的一種類似E1的酶[19]。因此，敲除Atg5、Atg7或者Beclin1都可以達到自噬抑制的作用。然而Beclin1在細胞凋亡途徑起到重要的作用，而且Beclin1+/-突變小鼠發(fā)生自發(fā)性腫瘤的幾率較高[26]，所以Beclin1并不是研究自噬的特異基因。雖然有研究表明Atg5或Atg7缺失小鼠的細胞仍然可以形成自噬體/自噬溶酶體，并在受到一定應激時可進行自噬介導的蛋白降解[27]，但由于ATG5不僅參與自噬泡形成，而且通過與TECRP結合，促進自噬體與溶酶體的融合[19]，所以Atg5-/-小鼠仍是目前用于研究自噬相關功能最常用的小鼠。

基因敲除小鼠的靶基因敲除后可能影響小鼠生殖功能[28]，我們實驗結果表明巨噬細胞條件性敲除Atg5后并不影響小鼠的生殖能力；在本實驗中，我們探討總結了最佳繁育方案，該繁殖方案可在較短時間、較高概率獲得實驗所需基因型小鼠，為后續(xù)研究巨噬細胞自噬在腎臟疾病發(fā)病機制中的作用提供小鼠數量保障。

基因型鑒定是進行基因敲除小鼠繁育保種的重要環(huán)節(jié)[29]。本研究采用堿裂解法提取鼠尾組織基因組DNA，參照上海南方模式生物科技股份有限公司提供的引物序列，通過普通的PCR擴增凝膠電泳成功鑒定巨噬細胞條件性Atg5基因敲除小鼠的基因型；與用DNA提取試劑盒提取基因組DNA相比，兩種方法的檢測結果一致，但堿裂解法耗時更短、費用更低(結果未展示)，說明該方法可以作為檢測巨噬細胞條件性Atg5基因敲除小鼠的基因型的一種快速可靠方法。

綜上，本研究成功建立了巨噬細胞條件性Atg5基因敲除小鼠模型且能正常繁殖。該小鼠模型為研究巨噬細胞自噬(Atg5)在腎臟疾病發(fā)病機制中的作用機制提供了可靠的體內實驗模型。