新疆棉田土壤黃萎病菌致病類型和微菌核定量分析

徐燦，劉啟，蔡夢(mèng)杭，高峰，黃家風(fēng)

(石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院/新疆綠洲農(nóng)業(yè)病蟲害治理與植保資源利用自治區(qū)高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832003)

新疆是我國(guó)最大的棉花種植區(qū)，據(jù)新疆維吾爾自治區(qū)統(tǒng)計(jì)局統(tǒng)計(jì)，2018年新疆棉花種植面積達(dá)到247萬hm2，占全國(guó)棉花種植面積的80%，在國(guó)家棉花產(chǎn)業(yè)中占有重要的戰(zhàn)略地位。棉花黃萎病是一種土傳維管束病害，在發(fā)病嚴(yán)重的地區(qū)可造成棉花減產(chǎn)30%以上，是影響我國(guó)棉花生產(chǎn)的主要病害[1]。由于缺乏有效的防治藥劑和抗病品種，加之新疆棉花長(zhǎng)期處于連作狀態(tài)，棉花黃萎病在新疆棉區(qū)的發(fā)生逐年加重。引起我國(guó)棉花黃萎病的病原菌為大麗輪枝菌(VerticilliumdahliaeKleb.)[2]，根據(jù)不同菌系對(duì)棉花致病的嚴(yán)重程度和癥狀類型，將其分為落葉型和非落葉型2種致病型[3]，一般認(rèn)為落葉型菌系的致病性強(qiáng)于非落葉型菌系[3-4]，落葉型菌系引發(fā)的黃萎病病情發(fā)展迅速，嚴(yán)重時(shí)常導(dǎo)致棉花大面積光桿，對(duì)棉花生產(chǎn)危害很大[5]。近年新疆棉田病株的鑒定結(jié)果[6-7]顯示，落葉型菌系所占比例不斷增加，從39%到53.2%，但是棉田土壤中落葉型和非落葉型菌系所占比例是否與病株中分離的比例一致，以及不同致病型黃萎病菌在新疆棉田土壤中的發(fā)生與分布如何目前并不清楚。

大麗輪枝菌侵染寄主時(shí)，在植物體內(nèi)產(chǎn)生大量微菌核。當(dāng)病株解體時(shí)微菌核釋放到土壤中，以休眠體的形式在土壤中存活10年以上[8]。微菌核作為大麗輪枝菌的休眠結(jié)構(gòu)，表皮厚而堅(jiān)硬，表面附著黑色素，抗逆境能力極強(qiáng)，是黃萎病的主要初侵染來源，因此土壤中大麗輪枝菌數(shù)量的多少與黃萎病的發(fā)生、發(fā)展及危害程度密切相關(guān)[9-11]。已有研究表明，只有當(dāng)土壤中微菌核的數(shù)量積累到一定量時(shí)才能引起典型的棉花黃萎病[12]，感病和抗病棉花品種的發(fā)病閾值分別是每克土壤4個(gè)和7個(gè)微菌核[13]。土壤中微菌核的數(shù)量與棉花的生長(zhǎng)季節(jié)有一定相關(guān)性，苗期土壤中微菌核數(shù)量相對(duì)較低，從蕾期開始逐漸增加，到花鈴期和吐絮期數(shù)量達(dá)到最高值，并且土壤中微菌核的季節(jié)變化與田間棉花黃萎病發(fā)生趨勢(shì)高度一致[14]。因此，明確落葉型和非落葉型黃萎病菌在棉田土壤中的分布狀況和快速準(zhǔn)確地定量測(cè)定土壤中黃萎病菌的微菌核密度，對(duì)深入研究棉花黃萎病流行規(guī)律及制定防治措施具有重要意義。

由于土壤理化性質(zhì)和生態(tài)系統(tǒng)的復(fù)雜性，土壤中的棉花黃萎病菌所占比例很低，常規(guī)PCR方法很難檢測(cè)到，高峰[15]和張昕[5]等先后建立了針對(duì)落葉型巢式PCR和非落葉型巢氏PCR檢測(cè)方法，可分別對(duì)土壤中的落葉型和非落葉型菌系進(jìn)行檢測(cè)。由于巢式PCR利用2套PCR引物對(duì)同一片段進(jìn)行2次特異性擴(kuò)增，降低了擴(kuò)增多個(gè)靶點(diǎn)的可能性，因而具有較高的靈敏度和特異性，在低模板量樣本檢測(cè)中具有應(yīng)用價(jià)值。但是當(dāng)檢測(cè)樣品數(shù)量較大時(shí)，對(duì)每個(gè)土樣分別進(jìn)行2次巢氏PCR檢測(cè)才能確定落葉型和非落葉型菌系的方法會(huì)消耗雙倍時(shí)間和試劑，因此并不適合大量樣品的檢測(cè)。對(duì)于定量土壤中黃萎病菌種群密度，普遍應(yīng)用的是選擇性培養(yǎng)基法，即將土樣均勻涂布在選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d，用流水沖洗去除表面的土壤顆粒后，在顯微鏡下對(duì)平板上微菌核進(jìn)行計(jì)數(shù)[14]。該法準(zhǔn)確性低、耗時(shí)長(zhǎng)，不適用于大量樣品的檢測(cè)。魏鋒等[13]基于大麗輪枝菌IGS區(qū)設(shè)計(jì)特異引物建立的水篩微菌核和qPCR相結(jié)合的方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，且檢測(cè)效率得到明顯提高。

為此，本研究將2個(gè)巢氏PCR進(jìn)行結(jié)合建立了雙重巢氏PCR，可同時(shí)檢測(cè)土壤中棉花黃萎病菌的落葉型和非落葉型菌系，通過對(duì)棉田土壤中的棉花黃萎病菌進(jìn)行檢測(cè)，初步明確落葉型和非落葉型菌系在田間的發(fā)生與分布。另外，基于qPCR建立大麗輪枝菌拷貝數(shù)(y)與微菌核(x)之間的線性關(guān)系，并對(duì)棉田土壤中黃萎病菌的種群密度進(jìn)行定量檢測(cè)，為深入研究病害流行規(guī)律及制定防治措施奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

棉花黃萎病菌落葉型菌株V592和非落葉型菌株I6，棉花枯萎病菌菌株SF1，均由本實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定并保存。

1.2 供試土壤的采集和處理

2018年在全疆26個(gè)植棉區(qū)采集了208份土壤樣品，其中新疆南部阿克蘇地區(qū)3、8、10、11、12、16團(tuán)采集37份，新疆北部伊犁地區(qū)64團(tuán)采集20份，奎屯地區(qū)123、124、125、126、127、128、130團(tuán)采集51份，石河子地區(qū)121、133、143、144、147、148、149、150團(tuán)采集64份，五家渠地區(qū)106團(tuán)、芳草湖農(nóng)場(chǎng)、新湖農(nóng)場(chǎng)采集30份，塔城地區(qū)184團(tuán)采集6份。在每個(gè)條田隨機(jī)選取3個(gè)采樣點(diǎn)，在每個(gè)采樣點(diǎn)以“W”形選取10個(gè)取樣點(diǎn)，每個(gè)取樣點(diǎn)在地表0～20 cm耕作層采集30～50 g病土，將10個(gè)取樣點(diǎn)采集的總量為300～500 g的土樣作為1個(gè)樣品裝入1個(gè)透氣牛皮紙袋，在室內(nèi)陰涼處自然風(fēng)干，以地區(qū)分類保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 供試菌株的培養(yǎng)及DNA提取

將棉花黃萎病菌V592菌株、I6菌株和棉花枯萎病菌菌株SF1在PDA固體培養(yǎng)基上活化[16]，再轉(zhuǎn)至PDA平板培養(yǎng)基上，置于26 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，暗培養(yǎng)7 d，用滅菌載玻片輕輕刮取培養(yǎng)基表面的菌絲和分生孢子，按照真菌基因組DNA提取試劑盒(BioFlux)操作說明提取3個(gè)菌株的基因組DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 雙重巢式PCR反應(yīng)及靈敏性測(cè)定

選用Perez-Artes等[17]和Mercodo-Blanco等[18]設(shè)計(jì)的落葉型黃萎病菌特異性引物D1/D2和INTD1/INTD2，及Mercado-Blanco等[19]設(shè)計(jì)的非落葉型黃萎病菌特異引物ND1/ND2和INTND1/INTND2，進(jìn)行樣本檢測(cè)：以引物D1和D2、引物ND1和ND2作為雙重巢氏PCR第1輪引物，PCR反應(yīng)體系為20 μL：2×PCR Mix 10 μL，10 μmol·L-1引物各0.5 μL，10 mg·L-1模板1.0 μL，ddH2O7 μL；擴(kuò)增產(chǎn)物的大小分別為539、1400 bp。再以引物INTD1和INTD2、引物INTND1和INTND2作為雙重巢氏PCR第2輪引物，為了避免第2輪反應(yīng)因擴(kuò)增產(chǎn)物濃度過高導(dǎo)致凝膠電泳檢測(cè)時(shí)發(fā)生拖帶現(xiàn)象、影響實(shí)驗(yàn)效果，故降低第2輪PCR反應(yīng)的引物和模板的終濃度，PCR反應(yīng)體系為20 μL：2×PCR Mix 10 μL，10 μmol·L-1引物各0.05 μL，第1輪PCR產(chǎn)物0.5 μL，ddH2O 9.3 μL；擴(kuò)增產(chǎn)物的大小分別為462、824 bp。引物由安徽通用生物公司合成，所用引物序列見表1。

表1 棉花黃萎病菌巢式PCR檢測(cè)所用引物Tab.1 The primers used for nested PCR detection of V.dahliaefrom cotton

對(duì)保存的棉花黃萎病菌落葉型菌株V592和非落葉型菌株I6的DNA進(jìn)行濃度測(cè)定，將相同濃度的2個(gè)菌株的DNA等體積混合，使混合液中V592和I6的DNA濃度依次為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6mg·L-1，分別以不同濃度混合液為模板，以無菌水作為陰性對(duì)照，按照上述雙重巢氏PCR反應(yīng)進(jìn)行第1輪和第2輪擴(kuò)增，對(duì)雙重巢氏PCR靈敏度進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 土壤總DNA的提取及棉田土壤黃萎病菌致病類型的檢測(cè)

將晾干的每份土壤樣品稱重前充分混勻，稱取0.5 g置于研缽中，加入液氮研磨至粉末，按照土壤基因組DNA提取試劑盒(北京索萊寶科技公司)說明提取土壤基因組DNA，于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。然后按照上述雙重巢氏PCR反應(yīng)體系對(duì)所有土壤DNA進(jìn)行檢測(cè)，以確定棉田土壤中黃萎病菌的致病類型，記錄電泳結(jié)果，采用Excel 2010軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 大麗輪枝菌IGS區(qū)目標(biāo)片段標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以棉花黃萎病菌V592的基因組DNA為模板，利用根據(jù)大麗輪枝菌Intergenic Spacer(IGS)區(qū)設(shè)計(jì)的特異性引物Vd-F929-947(5'-CGTTTCCCGTTACTCTTC-3')和Vd-R1076-1094(5'-GGATTTCGGCCCAGAAACT-3')[20]，將擴(kuò)增到的160 bp PCR產(chǎn)物克隆到PMD19-T上，然后提取質(zhì)粒。測(cè)定質(zhì)粒濃度后按照拷貝數(shù)公式：(6.02×1023×質(zhì)粒濃度)/(基因全長(zhǎng)×660)[21]，轉(zhuǎn)化為拷貝數(shù)，再按梯度稀釋成10～1010拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒樣品。將不同拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分別作為模板進(jìn)行qPCR反應(yīng)，樣品添加按照PowerUp SYBR Green Master Mix(Life Technologies)試劑盒說明進(jìn)行。qPCR反應(yīng)體系為20 μL：2×SuperReal PreMix plus 10 μL，Vd-F929-947(10 μmol·L-1)0.6 μL，Vd-R1076-1094(10 μmol·L-1)0.6 μL，模板4 μL，50×ROX Refernce Dye 0.8 μL，RNase-freeddH2O 4 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃ 15 min，95 ℃ 10 s，62 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)結(jié)束后按照7500 Real Time PCR System(Life Technologies)軟件分析并建立Ct(threshold cycle)值與拷貝數(shù)相關(guān)性的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7 微菌核數(shù)量與大麗輪枝菌IGS基因拷貝數(shù)的關(guān)系

取V592菌株的分生孢子將濃度調(diào)整至為1.0×106cfu/mL，取100 μL分生孢子均勻涂布到覆蓋有滅菌玻璃紙的改良基礎(chǔ)培養(yǎng)基(BMM)平板上，24 ℃黑暗培養(yǎng)14 d，將玻璃紙上的微菌核刮下，收集到燒杯中，用研磨棒搗碎，加入蒸餾水分別過80目和100目篩子，收集100目篩子上的殘留物到1.5 mL離心管中，加入100 μL ddH2O混勻后涂布在水瓊脂平板，在倒置顯微鏡下，用注射針頭分別挑取40、50、60、70、80個(gè)微菌核，每個(gè)數(shù)量的微菌核設(shè)3次重復(fù)。按步驟1.3提取微菌核的DNA，再按照上述qPCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件對(duì)棉花黃萎病菌IGS區(qū)160 bp進(jìn)行擴(kuò)增，建立Ct值與微菌核的標(biāo)準(zhǔn)曲線，再結(jié)合Ct值與IGS拷貝數(shù)相關(guān)性的標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立微菌核個(gè)數(shù)與IGS基因拷貝數(shù)的關(guān)系。

1.8 棉田土壤黃萎病菌種群密度的定量分析

分別從阿克蘇、五家渠、石河子、奎屯、伊犁和塔城地區(qū)的每個(gè)采樣團(tuán)場(chǎng)隨機(jī)抽取1份病土樣品，以土壤基因組DNA為模板，按照上述qPCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件對(duì)棉花黃萎病菌IGS區(qū)160 bp進(jìn)行擴(kuò)增，通過測(cè)定Ct值，按照上述建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算土壤中棉花黃萎病菌的DNA拷貝數(shù)，再通過微菌核個(gè)數(shù)與IGS基因拷貝數(shù)的關(guān)系計(jì)算微菌核密度，并通過SPSS 17.0軟件分析數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙重巢式PCR特異性及靈敏性測(cè)定

如圖1A所示，第1輪PCR反應(yīng)只有以落葉型菌株V592和非落葉型菌株I6的混合DNA為模板才能同時(shí)擴(kuò)增到預(yù)期的目標(biāo)片段，分別為539、1400 bp(泳道1)，以V592或I6的DNA單獨(dú)為模板，都只能擴(kuò)增到1條目標(biāo)條帶(泳道5和泳道9)；同樣第2輪PCR反應(yīng)也是只有V592和I6的混合DNA才同時(shí)擴(kuò)增到預(yù)期的目標(biāo)片段，分別為462、824 bp(泳道2)，以V592或I6的DNA單獨(dú)為模板，都分別擴(kuò)增到1條目標(biāo)條帶(泳道6和泳道10)。陰性對(duì)照和棉花枯萎病菌均未擴(kuò)增到任何條帶，表明所用4對(duì)引物特異，能同時(shí)對(duì)大麗輪枝菌落葉型和非落葉型2種致病類型進(jìn)行檢測(cè)。

A—引物特異性測(cè)定，奇數(shù)泳道對(duì)應(yīng)第1輪PCR產(chǎn)物，偶數(shù)泳道對(duì)應(yīng)第2輪PCR產(chǎn)物，1、2為V592和I6菌株的混合樣品，5、6為V592菌株，9、10為I6菌株，13、14為棉花枯萎病菌菌株SF1，3、4、7、8、11和12為陰性對(duì)照；B—雙重巢氏PCR靈敏性測(cè)定，奇數(shù)泳道對(duì)應(yīng)第1輪PCR產(chǎn)物，偶數(shù)泳道對(duì)應(yīng)第2輪PCR產(chǎn)物；基因組濃度，1、2為10-1 mg·L-1，3、4為10-2 mg·L-1，5、6為10-3 mg·L-1，7、8為10-4 mg·L-1，9、10為10-5 mg·L-1，11、12為10-6 mg·L-1，13、14為陰性對(duì)照，M為marker 2000。圖1 棉花黃萎病菌落葉型和非落葉型菌系雙重巢氏PCR特異性和靈敏度檢測(cè)Fig.1 The specific and the sensitivity of duplex nested PCR for detection of defoliating and non-defoliating strain of V.dahliae

分別以不同濃度的2個(gè)菌株的混合DNA為模板，對(duì)雙重巢氏PCR靈敏度進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖1B所示，只有模板濃度為10-1mg·L-1時(shí)，第1輪PCR能擴(kuò)增到較明顯的2條目標(biāo)條帶；當(dāng)模板濃度為10-2mg·L-1時(shí)，第1輪PCR只能擴(kuò)增到微弱的2條目標(biāo)條帶；當(dāng)模板濃度低于10-2mg·L-1時(shí)，第1輪PCR幾乎擴(kuò)增不到任何條帶；而第2輪PCR擴(kuò)增的2條目標(biāo)條帶始終清晰，即使模板稀釋至濃度為10-6mg·L-1時(shí)，2條目標(biāo)條帶依然清晰(圖1B)，表明通過第2輪PCR反應(yīng)提高了檢測(cè)靈敏度，并且靈敏度至少比第1輪PCR提高了4個(gè)數(shù)量級(jí)，即檢測(cè)靈敏度比普通PCR至少提高了104倍。

2.2 田間土壤樣品的檢測(cè)

隨機(jī)選取10個(gè)棉田土壤樣品，先對(duì)其土壤DNA進(jìn)行落葉型單重巢氏PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示，10個(gè)土壤樣品中都能擴(kuò)增到落葉型菌系預(yù)期大小的462 bp目標(biāo)條帶(圖2A)；再對(duì)土壤DNA進(jìn)行非落葉型單重巢氏PCR檢測(cè)，只有5個(gè)樣品能擴(kuò)增到非落葉型菌系預(yù)期大小的824 bp目標(biāo)條帶(圖2B)。結(jié)果表明，10個(gè)土壤樣品中都有落葉型黃萎病菌，其中5個(gè)土壤樣品中還含有非落葉型黃萎病菌，為落葉型和非落葉型菌系混合感染的樣品。

再將10個(gè)土壤樣品用上述建立的雙重巢式PCR進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖2C所示，所有樣品經(jīng)過第1輪PCR擴(kuò)增都擴(kuò)增不到任何條帶，當(dāng)經(jīng)過第2輪PCR擴(kuò)增后，10個(gè)樣品都能擴(kuò)增到落葉型菌系特異的462 bp的目標(biāo)條帶，同時(shí)從含有非落葉型菌系的5個(gè)土壤樣品中也擴(kuò)增到了非落葉型菌系特異的目標(biāo)條帶(824 bp)，與落葉型單重巢氏PCR和非落葉型單重巢氏PCR分別檢測(cè)的結(jié)果一致，說明雙重巢式PCR同樣可以提高土壤黃萎病菌的檢測(cè)靈敏度，并能快速、有效地檢測(cè)土壤中黃萎病菌的致病類型。

A—巢式PCR檢測(cè)落葉型菌系；B—巢式PCR檢測(cè)非落葉型菌系，1～10為棉田自然土樣，11為陰性對(duì)照，M為marker 2000；C—雙重巢式PCR同時(shí)檢測(cè)落葉型和非落葉型菌系，奇數(shù)泳道對(duì)應(yīng)第1輪PCR產(chǎn)物，偶數(shù)泳道對(duì)應(yīng)第2輪PCR產(chǎn)物。圖2 單重巢式PCR和雙重巢式PCR檢測(cè)棉田土壤中黃萎病菌的致病類型Fig.2 Pathotypes detection of V.dahliaein natural soils from cotton fields by nested PCR and duplex nested PCR

2.3 新疆各棉區(qū)土壤中黃萎病菌致病類型的鑒定

用雙重巢氏PCR對(duì)208份棉田土壤中的黃萎病菌進(jìn)行致病類型檢測(cè)。結(jié)果如表2所示，205份土壤樣品檢測(cè)到落葉型菌系，占樣品總量的98.6%；81份土壤樣品檢測(cè)到非落葉型菌系，占樣品總量的38.9%；其中78份土壤樣品同時(shí)檢測(cè)到落葉型和非落葉型菌系，占樣品總量的37.5%；只檢測(cè)到落葉型菌系的土樣為127份，占樣品總量的61.1%，只檢測(cè)到非落葉型菌系的土樣只有3份，占樣品總量的1.4%。表明棉田土壤中黃萎病菌以落葉型菌系為優(yōu)勢(shì)致病類型，非落葉型菌系單獨(dú)發(fā)生的棉田所占比例很少，幾乎都與落葉型菌系混合發(fā)生。

表2 棉花黃萎病菌落葉型和非落葉型菌系在新疆棉田土壤中的比例Tab.2 The proportion of defoliating and non-defoliating strains of V.dahliaein cotton field soil in Xinjiang

從土壤樣品的地區(qū)來源來看，從阿克蘇、伊犁、五家渠和石河子地區(qū)采集的棉田土壤，其落葉型黃萎病菌的檢出率都為100%，非落葉型菌系的檢出率為33.3%～37.0%；非落葉型菌系都是與落葉型菌系以混合發(fā)生的方式存在，沒有檢測(cè)到非落葉型菌系單獨(dú)存在的土樣。塔城地區(qū)的土樣沒有檢測(cè)到非落葉型菌系，都是以落葉型菌系單獨(dú)存在。只有奎屯地區(qū)檢測(cè)到3份以非落葉型菌系單獨(dú)存在的土樣，并且非落葉型菌系的檢出率明顯比其它地區(qū)都高，為49%。

2.4 大麗輪枝菌IGS區(qū)目標(biāo)片段標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將不同拷貝數(shù)的質(zhì)粒樣品通過qPCR擴(kuò)增大麗輪枝菌IGS區(qū)目標(biāo)片段，熒光定量PCR測(cè)定系統(tǒng)自動(dòng)生成Ct值與IGS區(qū)目標(biāo)片段拷貝數(shù)(10～1010拷貝/μL)對(duì)數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3 A)，曲線的決定系數(shù)R2=0.9837，說明在質(zhì)粒稀釋拷貝數(shù)范圍內(nèi)二者具有良好的線性關(guān)系。線性方程為y=-3.311x+38.945，擴(kuò)增效率E=100.4%，表明建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線能準(zhǔn)確地反映目標(biāo)片段的擴(kuò)增。以不同數(shù)量微菌核的DNA為模板，經(jīng)過同樣的qPCR擴(kuò)增，熒光定量PCR測(cè)定系統(tǒng)自動(dòng)生成Ct值與微菌核數(shù)對(duì)數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3B)，曲線的決定系數(shù)R2=0.984，擴(kuò)增效率E=97.7%，表明微菌核數(shù)對(duì)數(shù)與Ct值也呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系?；?個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出大麗輪枝菌拷貝數(shù)(y)與微菌核密度(x)的換算公式為：y=11.54x，為檢測(cè)田間土壤微菌核密度奠定基礎(chǔ)。

A—質(zhì)粒樣品IGS拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值與Ct值的標(biāo)準(zhǔn)曲線；B—不同數(shù)量微菌核的對(duì)數(shù)值與Ct值的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖3 Ct值與大麗輪枝菌IGS目標(biāo)片段拷貝數(shù)相關(guān)性和Ct值與微菌核對(duì)數(shù)相關(guān)性的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curves relating Ct to the copy number of IGS fragment and to number of microsclerotia of V.dahliae

2.5 棉田土壤黃萎病菌微菌核的定量檢測(cè)

對(duì)棉田自然土中黃萎病菌的IGS拷貝數(shù)進(jìn)行定量檢測(cè)，再將其換算為微菌核密度，結(jié)果如圖4所示。棉田土壤的微菌核密度按照每克土微菌核數(shù)量計(jì)算，分別為：阿克蘇98～751個(gè)，石河子3～262個(gè)，奎屯0.5～375個(gè)，五家渠38～102個(gè)、伊犁0.7～45個(gè)，塔城1.6～9個(gè)。對(duì)每個(gè)棉區(qū)而言，土樣之間的菌核量都存在顯著差異，表明不同地塊的土壤帶菌量存在差異。

為了明確不同棉區(qū)的土壤帶菌量是否存在差異，對(duì)各棉區(qū)土壤的最高微菌核密度和平均微菌核密度進(jìn)行比較，結(jié)果如圖4G和圖4H所示，阿克蘇的棉田土壤，其最高微菌核密度和平均微菌核密度都最高，分別為每克土751和351個(gè)微菌核；其次是石河子和奎屯，它們之間的最高微菌核密度和平均微菌核密度都沒有顯著差異，石河子棉田土壤最高微菌核密度和平均微菌核密度分別為每克土262和141個(gè)微菌核，奎屯棉田土壤其最高微菌核密度和平均微菌核密度分別為每克土375和113個(gè)微菌核；然后是五家渠棉田土壤，其最高微菌核密度和平均微菌核密度分別為每克土102和74個(gè)微菌核；伊犁和塔城的棉田土壤，其最高微菌核密度和平均微菌核密度明顯低于其他棉區(qū)，伊犁的最高微菌核密度和平均微菌核密度分別為每克土45和25個(gè)微菌核；塔城的最高微菌核密度和平均微菌核密度分別為每克土9和5個(gè)微菌核。結(jié)果表明各棉區(qū)土壤帶菌量也存在差異，阿克蘇的土壤帶菌量最高，塔城的土壤帶菌量最低。

不同小寫字母表示W(wǎng)aller-Duncan檢驗(yàn)差異極顯著(P<0.05)圖4 棉田土壤黃萎病菌微菌核的定量檢測(cè)Fig.4 Quantitative detection of microsclerotial density of V.dahliaein cotton field soil

3 結(jié)論與討論

(1)本研究建立的雙重巢氏PCR，可同時(shí)對(duì)棉花黃萎病菌落葉型和非落葉型菌系進(jìn)行檢測(cè)。待測(cè)樣品經(jīng)過2輪PCR擴(kuò)增，目標(biāo)條帶清晰、特異，與落葉型單重巢氏PCR和非落葉型單重巢氏PCR擴(kuò)增的效果一致，表明經(jīng)過整合后的雙重巢氏PCR不影響檢測(cè)目標(biāo)的特異性。巢氏PCR第1輪反應(yīng)的檢測(cè)靈敏度最高達(dá)到10-2mg·L-1，與普通PCR法對(duì)大麗輪枝菌基因組DNA檢測(cè)靈敏度達(dá)到10-2mg·L-1一致[22]，但該靈敏度很難對(duì)田間自然土中的黃萎病菌進(jìn)行檢測(cè)，本研究發(fā)現(xiàn)僅通過第1輪PCR從田間自然土中幾乎擴(kuò)增不到任何條帶(圖2C)，但通過雙重巢氏PCR第2輪擴(kuò)增，將檢測(cè)靈敏度提高了104倍，與落葉型單重巢氏PCR提高的靈敏度一致[5]。

(2)從田間病株檢測(cè)結(jié)果來看，1999年以前，新疆沒有發(fā)現(xiàn)落葉型菌株，完全是非落葉型菌株；2003—2004年檢測(cè)，落葉型菌株占供測(cè)菌株的4%～5.9%；2008年檢測(cè)時(shí)，南、北疆的落葉型菌株分別占供測(cè)菌株的33.3%和39%；2015年落葉型菌株比例已達(dá)53.2%[6-7,23-24]。本研究對(duì)棉田土壤黃萎病菌的鑒定結(jié)果顯示，落葉型菌系占供試土樣的98.6%，非落葉型菌系占供試土樣的38.9%，因此土壤中落葉型菌系所占比例遠(yuǎn)高于病株中的比例；并且除奎屯檢測(cè)到3個(gè)以非落葉型菌系單獨(dú)存在的土樣外，非落葉型菌系幾乎都與落葉型菌系混合發(fā)生。在不到20年的時(shí)間內(nèi)田間致病類型迅速演變的原因普遍認(rèn)為與新疆大量從內(nèi)地引種和缺乏抗病品種有關(guān)[25]，但是是否與落葉型菌系和非落葉型菌系對(duì)寄主的侵染能力有關(guān)也需要進(jìn)行深入研究。

(3)本研究以qPCR為基礎(chǔ)建立了Ct值與大麗輪枝菌IGS目標(biāo)片段拷貝數(shù)相關(guān)性的標(biāo)準(zhǔn)曲線，及Ct值與微菌核密度相關(guān)性的標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后基于2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線推導(dǎo)出大麗輪枝菌IGS拷貝數(shù)和菌核數(shù)之間的關(guān)系，對(duì)棉田土壤中黃萎病菌的微菌核密度進(jìn)行了定量測(cè)定。檢測(cè)結(jié)果顯示，該方法可對(duì)棉田自然土中的微菌核進(jìn)行定量檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度達(dá)到每克土0.5個(gè)微菌核，這與Wei等[13]檢測(cè)靈敏度相當(dāng)。Wei等將土壤水篩提純微菌核和qPCR技術(shù)相結(jié)合建立了土壤大麗輪枝菌微菌核的快速定量方法，檢測(cè)下限為每克土0.5個(gè)微菌核，但該方法需對(duì)待測(cè)土樣進(jìn)行過篩水洗處理，雖然檢測(cè)特異性強(qiáng)、靈敏度高，但是樣品處理耗時(shí)長(zhǎng)，不利于大量樣品的定量檢測(cè)。本研究建立的微菌核定量檢測(cè)方法可直接針對(duì)土壤DNA進(jìn)行定量檢測(cè)，且能達(dá)到相同的靈敏度。

(4)劉海洋等[7]2015年對(duì)新疆主要植棉區(qū)發(fā)病棉田的調(diào)查顯示，阿克蘇發(fā)病棉田平均病指最高，為12.9；其次是石河子棉田，平均病指是9.6；然后是奎屯棉田，平均病指為6.2。本研究通過對(duì)不同植棉區(qū)棉田土壤中的微菌核進(jìn)行定量測(cè)定，結(jié)果表明，阿克蘇棉田土壤中微菌核密度最高，其次是石河子和奎屯地區(qū)，塔城棉田土壤微菌核密度最低，這與不同棉區(qū)田間棉花發(fā)病程度相一致。另外，對(duì)同一地區(qū)不同地塊的微菌核進(jìn)行定量測(cè)定，結(jié)果顯示，地塊之間微菌核含量也存在顯著差異。由于感病和抗病棉花品種的發(fā)病閾值不同[13]，田間發(fā)病程度相對(duì)一致的不同地塊，其微菌核含量可能存在很大差異，因此選擇地塊進(jìn)行輪作或者在研究病害流行規(guī)律時(shí)以病田土壤中的實(shí)際帶菌量為依據(jù)尤為重要。