便攜式植物葉片葉綠素含量無損檢測儀設(shè)計與試驗

楊 彪 杜榮宇 楊 玉 朱德寬 郭文川,2 朱新華

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)機(jī)械與電子工程學(xué)院， 陜西楊凌 712100；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)物聯(lián)網(wǎng)重點(diǎn)實驗室， 陜西楊凌 712100)

0 引言

葉綠素是植物進(jìn)行光合作用不可或缺的基礎(chǔ)物質(zhì)[1]。植物葉片中的葉綠素含量與植被的光合能力、發(fā)育階段以及氮素狀況有著良好的相關(guān)性[2]，能夠反映植物的生理狀況[3]，因此，葉綠素含量的檢測備受農(nóng)業(yè)科技工作者關(guān)注[4]。文獻(xiàn)[5]規(guī)定了植物葉片中葉綠素含量的檢測方法為分光光度法。該方法具有檢測結(jié)果穩(wěn)定且精確的優(yōu)點(diǎn)[6]，但其操作步驟繁瑣、耗時長、需要破壞待測樣本，同時，檢測中使用有毒物質(zhì)丙酮，對操作者身體健康有嚴(yán)重的危害，且實驗廢液若處理不當(dāng)會污染水資源[7]。

為了設(shè)計方便、快捷、無損的葉綠素含量檢測方法，國內(nèi)外科研工作者先后采用原子吸收光譜技術(shù)[8]、高光譜技術(shù)[9-11]、反射光譜技術(shù)[12]、多光譜圖像技術(shù)[13-15]、機(jī)器視覺技術(shù)[16-18]以及可見和近紅外光的吸收特性[19-20]等檢測葉綠素含量，取得了良好的效果。但原子吸收光譜法、高光譜法、反射光譜法、多光譜圖像技術(shù)所使用的儀器價格昂貴，并且采集到的光譜數(shù)據(jù)需要經(jīng)過復(fù)雜計算才能得到葉綠素含量[21]。機(jī)器視覺法受光照條件影響較大，測量穩(wěn)定性較差[22]。目前，基于葉綠素在可見光(波長650 nm)和近紅外光(波長940 nm)波長的吸收特性開發(fā)出了一些葉綠素檢測儀，如SPAD-502型葉綠素儀(日本柯尼卡美能達(dá)公司)[19]，小麥葉綠素、氮素、水分一體化測定儀[20]等。與光譜法相比，這些儀器雖具有成本較低、操作簡便的優(yōu)點(diǎn)，但由于需要檢測近紅外波段的吸光度，而植物葉片在近紅外波段的反射率很高[23]，導(dǎo)致該波段的透射光信號比較微弱，因此需要加大光源功率、并使用近紅外波段的傳感器，最終導(dǎo)致儀器價格較高，較難大規(guī)模推廣使用。

葉綠素主要吸收藍(lán)紫光(波長400～500 nm)和紅光(波長600～700 nm)。植物葉片中的葉綠素分為葉綠素a和葉綠素b，兩種葉綠素在藍(lán)紫光和紅光波段的吸收峰不同。在紅光波段，葉綠素a具有相對更強(qiáng)的吸收峰(波長660 nm)，而在藍(lán)紫光波段，葉綠素b具有相對更強(qiáng)的吸收峰(波長460 nm)[24]。通常葉片中的葉綠素含量指的是葉綠素a和葉綠素b之和[5]。對于不同的植物葉片，或者不同生理狀況下的同一種植物葉片，其葉綠素a、b的比例并不相同[25]，因此使用650 nm作為檢測波長僅能輸出與葉綠素a、b的總含量相關(guān)的某一值，如SPAD值。有研究表明，雖然不同葉片的SPAD值與葉綠素含量有較好的相關(guān)性，但對于不同的植物，其SPAD值與葉綠素含量之間的關(guān)系模型卻不盡相同[26]。導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因可能在于未考慮葉綠素a、b各自的吸收特性。目前廣泛使用的葉綠素儀輸出的是SPAD值，而并非植物葉片的葉綠素含量。因此，基于葉綠素a、b的最大吸收峰開發(fā)一款檢測速度快、成本低廉、操作簡單，且可以直接輸出葉綠素含量值的植物葉片葉綠素含量無損檢測儀，對于指導(dǎo)農(nóng)作物生產(chǎn)具有重要的意義。

本文以51單片機(jī)為控制器，基于葉綠素a、b分別在光波長約660 nm和460 nm處具有最大吸收峰的原理，設(shè)計一款便攜式植物葉片葉綠素含量無損檢測儀，并對檢測儀的性能進(jìn)行試驗測試。

1 儀器設(shè)計

1.1 硬件設(shè)計

如圖1所示為便攜式植物葉片葉綠素含量無損檢測儀的硬件結(jié)構(gòu)圖。該檢測儀主要由單片機(jī)、光源模塊、光傳感器、電源模塊和輸入輸出模塊組成。單片機(jī)負(fù)責(zé)控制其他模塊并處理數(shù)據(jù)；光源模塊負(fù)責(zé)發(fā)出光照強(qiáng)度穩(wěn)定且中心波長為460 nm和660 nm的光；光傳感器將檢測到的光信號轉(zhuǎn)換為可供單片機(jī)讀取的數(shù)字信號，并將該信號傳送給單片機(jī)；電源模塊為整個系統(tǒng)穩(wěn)定供電；輸入輸出模塊負(fù)責(zé)處理用戶輸入指令并將測量結(jié)果通過顯示器顯示出來。

圖1 植物葉片葉綠素含量檢測儀硬件結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Structure diagram of portable nondestructive detector for chlorophyll content

1.1.1單片機(jī)

采用STC12C5A60S2單片機(jī)作為檢測儀控制器，其內(nèi)部數(shù)據(jù)存儲器為1 280 B，程序存儲器為60 KB。與其配套外圍電路有時鐘電路、復(fù)位電路和串口通訊電路，時鐘電路晶振的頻率為11.059 2 MHz。單片機(jī)的引腳分配如圖2所示。

圖2 單片機(jī)引腳分配圖Fig.2 Pin assignment diagram of STC12C5A60S2 single-chip micro-computer

1.1.2光源模塊

由于葉綠素a和葉綠素b在光波長660 nm和460 nm左右有最大吸收峰。因此采用了兩個發(fā)光二極管作為光源，并為其配備了恒壓驅(qū)動電路，使其可以發(fā)出光照強(qiáng)度穩(wěn)定且中心波長為460、660 nm的光。發(fā)光二極管的最大工作電流為500 mA，發(fā)光強(qiáng)度與電源電壓有關(guān)。

1.1.3光傳感器

由于待測光信號的中心波長為460、660 nm，均處于可見光波段。綜合考慮成本和精度，采用以BH1750FVI數(shù)字光照傳感器芯片為核心的GY-30型數(shù)字光照傳感器模塊檢測待測光照強(qiáng)度。該傳感器的分辨率為16位，響應(yīng)波段為300～800 nm，輸入電壓為3.3～5 V，滿足設(shè)計要求。該傳感器模塊共有5個引腳，其中VCC和GND用于供電；ADDR為片選端口，低電平有效；SCL為串行時鐘信號線，SDA為串行數(shù)據(jù)信號線。SCL引腳和SDA引腳分別連接單片機(jī)的P1.0和P1.1引腳。

1.1.4電源模塊

為降低儀器成本，提高儀器便攜性，采用1604G(6F22)型9 V干電池配合LM2596S型DC-DC直流可調(diào)降壓穩(wěn)壓模塊給整個儀器供電。降壓穩(wěn)壓模塊負(fù)責(zé)將干電池產(chǎn)生的9 V左右電壓轉(zhuǎn)換為穩(wěn)定的5 V電壓，供整個儀器使用。

1.1.5輸入輸出模塊

考慮到便攜性和實用性，檢測儀共有4個按鍵，其中包括電源鍵、測量鍵、顯示數(shù)據(jù)選擇鍵和數(shù)據(jù)查詢鍵。其中電源鍵控制整個系統(tǒng)的供電，測量鍵控制儀器開始檢測葉綠素含量，顯示數(shù)據(jù)選擇鍵用于選擇需要顯示的數(shù)據(jù)，例如光照強(qiáng)度、葉綠素含量。為了同市場上常用的SPAD儀的測量結(jié)果進(jìn)行比較，也可以選擇顯示SPAD值。數(shù)據(jù)查詢鍵用于查詢歷史測量數(shù)據(jù)。

輸出模塊采用0.96英寸的OLED顯示器。該顯示器共有4個引腳，其中VCC和GND用于供電，SCL為串行時鐘信號線，SDA為串行數(shù)據(jù)信號線，SCL引腳和SDA引腳分別連接單片機(jī)的P2.0和P2.1引腳。顯示器與單片機(jī)之間采用I2C協(xié)議通信。

1.1.6整體結(jié)構(gòu)

檢測儀整體結(jié)構(gòu)采用Creo軟件設(shè)計，尺寸為 80 mm×90 mm×44 mm，外殼用3D打印技術(shù)制作，材料為樹脂。為減少環(huán)境光對檢測結(jié)果的影響，將殼體內(nèi)部涂成黑色。檢測時，將植物葉片插于儀器檢測區(qū)域。圖3為開發(fā)的植物葉片葉綠素含量無損檢測儀的樣機(jī)。

圖3 葉綠素含量無損檢測儀樣機(jī)Fig.3 Prototype of developed portable nondestructive chlorophyll content detector1.顯示屏 2.電源開關(guān) 3.上翻查詢按鍵 4.下翻查詢按鍵 5.檢測按鍵 6.葉片檢測區(qū)域

1.2 軟件設(shè)計

檢測儀的控制軟件在Keil uVision4中采用C51語言編寫。主要包括主函數(shù)、按鍵子函數(shù)、光采集子函數(shù)、數(shù)據(jù)處理子函數(shù)、顯示子函數(shù)等部分。主函數(shù)主要完成光傳感器、顯示器等元器件的初始化，并協(xié)調(diào)其他各個子函數(shù)的運(yùn)行；光采集子函數(shù)負(fù)責(zé)控制GY-30型光傳感器模塊，根據(jù)測量得到的光照強(qiáng)度，計算葉片的吸光度；按鍵子函數(shù)負(fù)責(zé)響應(yīng)用戶的操作；數(shù)據(jù)處理子函數(shù)根據(jù)光傳感器采集的數(shù)據(jù)計算出葉片的葉綠素含量和SPAD值。顯示子函數(shù)負(fù)責(zé)顯示采集到的光照強(qiáng)度、計算的葉綠素含量和SPAD值。檢測儀的控制軟件流程如圖4所示。

圖4 葉綠素含量檢測軟件流程圖Fig.4 Program flow chart of developed software for chlorophyll content detector

2 試驗材料與方法

2.1 材料

試驗所用的植物葉片樣本為菠菜、大青菜和油麥菜。樣品采自于楊凌周邊的蔬菜園以及西北農(nóng)林科技大學(xué)的園藝農(nóng)場。為了保證所用樣品的葉綠素含量有一個比較大的范圍，避免某一個范圍葉綠素含量值比較集中，采摘前先用SPAD-502型葉綠素儀測量葉片的SPAD值，初步篩選需要的葉片。然后采摘葉片，并密封于自封袋內(nèi)于20 min內(nèi)帶回實驗室，用自制的葉綠素含量檢測儀測量460 nm和660 nm處的吸光度，隨后進(jìn)行葉綠素含量的檢測。每天隨機(jī)采集不同地塊、不同植物的葉片10～15個，共采集樣品70個。

2.2 試驗方法

2.2.1植物葉片吸光度測量

打開自制的葉綠素含量檢測儀的電源，然后按測量鍵后，讀取未放置植物葉片時光傳感器的輸出光照強(qiáng)度I460和I660。隨后，將植物葉片放于自制的葉綠素含量檢測儀的測量區(qū)域，接著按測量鍵，讀取此時光透過植物葉片后光傳感器的輸出光照強(qiáng)度It460和It660。為了減少葉綠素分布不均對測量結(jié)果的影響，測量時避開主葉脈。每個葉片取4個不同部位進(jìn)行測定，4個部位的平均值作為每個葉片的測量結(jié)果。

吸光度計算公式為

(1)

(2)

式中I460、I660——無植物葉片時460、660 nm下的光照強(qiáng)度，lx

It460、It660——透過植物葉片時460、660 nm下的光照強(qiáng)度，lx

A460、A660——植物葉片在460、660 nm下的吸光度

2.2.2葉綠素含量測量

在用自制的葉綠素含量檢測儀測量完葉片的吸光度后，使用FA004型電子分析天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)準(zhǔn)確稱取0.2 g待測葉片放入研缽中，稱取2.5 mL體積分?jǐn)?shù)為80%的丙酮溶液加入研缽中，取CaCO3約0.002 g加入研缽中，并加入適量石英砂。當(dāng)葉片樣品被研磨至勻漿狀態(tài)時，再量取體積分?jǐn)?shù)80%的丙酮溶液3 mL加入研缽中，繼續(xù)研磨，直到葉片組織變?yōu)榛野咨Ｖ寡心?。為了使葉綠素的提取更加充分，將研磨好的樣品靜置在黑暗處約5 min。使用快速濾紙過濾并清洗濾渣，直至濾渣變?yōu)榛野咨?，再將濾液定容到25 mL的棕色容量瓶中[27]。測量時，選用厚度為10 mm的石英比色皿為樣品池，將UV2310Ⅱ型紫外-可見分光光度計(北京天美(中國)科學(xué)儀器有限公司)的波長分別設(shè)定為663 nm和645 nm[28]。將體積分?jǐn)?shù)80%的丙酮溶液作為空白對照放置在參比池中，將待測葉綠素溶液放置在樣品池中，分別測量葉綠素溶液在663 nm和645 nm下的吸光度。計算葉綠素的質(zhì)量濃度[5]

ω=20.29A645+8.05A663

(3)

式中A645——葉綠素溶液在645 nm下的吸光度

A663——葉綠素溶液在663 nm下的吸光度

ω——葉綠素溶液的葉綠素質(zhì)量濃度，mg/L

換算成葉綠素含量為[5]

(4)

式中C——植物葉片的葉綠素含量，mg/g

m——材料質(zhì)量，gV——提取液總體積，L

3 試驗分析與建模

圖5a是70個植物葉片的葉綠素含量與檢測儀測得的吸光度之間的關(guān)系。由圖5a可知，吸光度隨葉片中葉綠素含量的增加而增大，說明葉片中的葉綠素含量越高，460 nm和660 nm下光的吸收作用越強(qiáng)，吸光度越大。用Matlab(美國MathWorks公司)對植物葉片的葉綠素含量與其在460 nm與660 nm處吸光度A460和A660進(jìn)行多項式擬合，擬合關(guān)系式為

C=-0.814+0.332A460+0.502A660(R2=0.80)

(5)

說明植物葉片在460 nm和660 nm處的吸光度與葉綠素含量間有很好的相關(guān)性。對回歸方程進(jìn)行F檢驗，P=4.56×10-24<0.01，說明回歸方程顯著有效。對回歸方程的3個解釋變量進(jìn)行t檢驗，P值分別為1.43×10-9、0.000 3、0.002 3，均遠(yuǎn)小于0.01，說明3個解釋變量都在99%的水平下顯著，都通過了t檢驗。

圖5 吸光度與葉綠素含量、SPAD值的關(guān)系圖Fig.5 Relationships of light absorbance with chlorophyll content and SPAD values

根據(jù)式(5)編寫基于植物葉片的吸光度計算其葉綠素含量的程序，并下載到單片機(jī)中，從而可直接給出葉綠素含量的檢測結(jié)果。

為了同市場上常用的葉綠素儀的檢測結(jié)果進(jìn)行比較，同樣對460 nm和660 nm下的吸光度與SPAD-502型葉綠素儀測得的SPAD值進(jìn)行了擬合，擬合關(guān)系式為

S=-12.8+0.437A460+31.3A660(R2=0.98)

(6)

式中S——植物葉片SPAD值

對回歸方程進(jìn)行F檢驗，P=5.9×10-56<0.01，說明回歸方程顯著有效。對回歸方程的3個參數(shù)進(jìn)行t檢驗，P值分別為1.99×10-18、0.555、9.77×10-38，其中A460的t檢驗P值大于0.01，未通過t檢驗，因此需要重新建立模型，原因是460 nm與SPAD-502型葉綠素儀的工作波長差異較大。因此，對660 nm下的吸光度與SPAD-502型葉綠素儀測得的SPAD值進(jìn)行了回歸分析，擬合關(guān)系式為

S=-12.8+31.9A660(R2=0.98)

(7)

由于解釋變量只有A660, 因此只需要對模型進(jìn)行F檢驗，P=9.27×10-61<0.01，說明回歸方程顯著有效，因此檢測儀用式(7)計算SPAD值。圖5b為A660與SPAD值關(guān)系，由圖5b可知A660隨SPAD值的增大而增大。

4 性能測試與驗證

4.1 穩(wěn)定性測試

4.1.1光源驅(qū)動電路穩(wěn)定性

供電電壓是影響光源穩(wěn)定性的最重要因素。為了驗證光源驅(qū)動電路的穩(wěn)定性，用直流穩(wěn)壓電源給儀器穩(wěn)壓模塊供電，測量光源驅(qū)動電路的帶載輸出電壓，驅(qū)動電路的輸出電壓如圖6所示。當(dāng)輸入電壓為6～10.8 V時，輸出電壓的變化范圍為5.04～5.06 V，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.007 V,變異系數(shù)為0.1%?？梢?，光源驅(qū)動電路穩(wěn)定性較好，滿足設(shè)計需求。

圖6 光源驅(qū)動電路輸入輸出電壓Fig.6 Input and output voltages of light source driving circuit

4.1.2植物葉片吸光度測量結(jié)果穩(wěn)定性

測量位置等其他干擾因素的改變都會影響儀器工作的穩(wěn)定性，這些因素綜合起來影響儀器對植物葉片吸光度測量的穩(wěn)定性。為了驗證設(shè)計的儀器對植物葉片吸光度測量的穩(wěn)定性，取5組葉綠素含量不同的葉片，每個葉片測10次，測量結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)如表1所示。由表1可見，變異系數(shù)的變化范圍為1.5%～6.2%，平均值約為3.5%。該結(jié)果說明，本檢測儀測量植物葉片吸光度結(jié)果比較穩(wěn)定。

表1 A460和A660測量的標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)Tab.1 Standard deviations and coefficients of variation of A460 and A660

4.1.3葉綠素含量和SPAD值測量結(jié)果穩(wěn)定性測試

為了驗證儀器對植物葉片葉綠素含量和SPAD值測量的穩(wěn)定性，取5組葉綠素含量不同的葉片，每個葉片測10次，測量結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)如表2所示。由表2可見，變異系數(shù)的變化范圍為2.1%～8.1%，平均值約為4.7%?？梢姳緳z測儀測量得到的植物葉片的葉綠素含量和SPAD值較穩(wěn)定。

4.2 測量精度測試

為了對設(shè)計的便攜式植物葉片葉綠素含量無損檢測儀的性能進(jìn)行驗證，另取27組植物葉片，分別用自制的儀器測量葉綠素含量，用SPAD-502型葉綠素含量檢測儀測量SPAD值，再按分光光度法測量葉綠素含量的實際值。圖7a是實測的葉綠素含量與開發(fā)的葉綠素含量檢測儀測量結(jié)果的對比。由圖7a可知，測量結(jié)果均勻地分布在45°線的附近。同分光光度法相比，當(dāng)葉片的葉綠素含量在0.21～1.97 mg/g范圍內(nèi)時，設(shè)計的葉綠素含量檢測儀的絕對測量誤差為-0.32～0.20 mg/g，平均絕對誤差是0.14 mg/g。可見，本儀器對于植物葉片葉綠素含量具有良好的檢測精度。

表2 葉綠素含量和SPAD值測量標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)Tab.2 Standard deviations and coefficients of variation of chlorophyll content and SPAD value

此外，將本儀器的SPAD值測量結(jié)果與市售的SPAD-502型葉綠素含量檢測儀的測量結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果如圖7b所示。同SPAD-502型葉綠素檢測儀相比，自制檢測儀測量葉片SPAD值的絕對測量誤差為-3.3～1.8，平均絕對誤差為1.1。同市售的SPAD-502型葉綠素含量檢測儀相比，本文所開發(fā)檢測儀的成本很低(硬件成本約100元)。此外，該儀器既可以直接輸出葉綠素含量，也可以輸出SPAD值，且響應(yīng)時間小于2 s。

5 結(jié)論

(1)基于葉綠素a和葉綠素b分別在波長660、460 nm左右具有光的最大吸收峰的現(xiàn)象，設(shè)計了一款便攜式植物葉片葉綠素含量無損檢測儀。該檢測儀的硬件系統(tǒng)由單片機(jī)、光源模塊、光傳感器、電源模塊和輸入輸出模塊組成，其軟件采用C51語言編寫。

圖7 自制儀器測量的葉綠素含量和SPAD值分別同分 光光度法和SPAD-502型葉綠素儀測量結(jié)果的比較Fig.7 Comparison of measured chlorophyll content and SPAD value by using developed detector with values obtained by spectrophotometry and SPAD-502 chlorophyll meter

(2) 植物葉片的葉綠素含量與460、660 nm處吸光度之間的關(guān)系可用二元一次關(guān)系式表達(dá)，該關(guān)系式的決定系數(shù)為0.80。

(3)與分光光度法相比，當(dāng)葉片葉綠素含量在0.21～1.97 mg/g時，本檢測儀的葉綠素含量測量絕對誤差為-0.32～0.20 mg/g，平均絕對誤差是0.14 mg/g。與SPAD-502型葉綠素儀相比，本檢測儀的SPAD值絕對測量誤差為-3.3～1.8，平均絕對誤差為1.1，且響應(yīng)時間小于2 s。