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    低pH值條件下不同大豆蛋白組分聚合性能研究

    2019-12-31 07:52:30徐紅華郭珊珊馬金玉高子雯馬彩虹
    關(guān)鍵詞:豆粉巰基亞基

    徐紅華 丁 瑞 郭珊珊 馬金玉 高子雯 馬彩虹

    (東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院, 哈爾濱 150030)

    0 引言

    長(zhǎng)期以來(lái),食品蛋白質(zhì)的研究主要集中在大于等電點(diǎn)的pH值條件下,但近年研究表明,低 pH 值條件下部分蛋白質(zhì)可以自組裝形成納米纖維聚合結(jié)構(gòu),并且其凝膠性、乳化性、起泡性等功能性質(zhì)得到明顯改善[1]。pH值的變化也會(huì)賦予蛋白質(zhì)不同的聚合結(jié)構(gòu),例如:乳中的β-乳球蛋白在等電點(diǎn)附近形成顆粒狀聚合物[2],進(jìn)一步降低pH值,形成鏈狀聚合物[3],當(dāng)pH值低于2.5、低離子強(qiáng)度、持續(xù)加熱時(shí),則形成纖維狀聚合物[4]。也有學(xué)者對(duì)大豆蛋白進(jìn)行了相關(guān)研究。文獻(xiàn)[5-6]研究發(fā)現(xiàn),7S在pH值為2.0、80℃長(zhǎng)時(shí)間加熱時(shí),也可以形成纖維;隨后文獻(xiàn)[7]將7S的亞基α′、α和β-亞基分離出來(lái),在pH值為2.0、85℃條件下加熱,可以形成纖維聚合物;課題組前期研究中也發(fā)現(xiàn),11S 自身不能形成纖維聚合物,但11S的酸性亞基在pH值2.0、95℃條件下加熱20 h,可以形成淀粉樣纖維聚合物[8]。除了低pH值對(duì)蛋白質(zhì)聚合形態(tài)的影響以外,蛋白質(zhì)組成也對(duì)功能性質(zhì)有很大影響。7S比11S的凝膠特性弱,由于網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的差異,7S熱致凝膠的硬度比11S低,而且易斷裂[9]。綜上,大豆蛋白組成不同、相同蛋白組分不同的情況下,聚合結(jié)構(gòu)都可能賦予其不同的功能特性。本文通過(guò)研究大豆蛋白不同組分在不同pH值條件下形成的熱致凝膠,比較分析不同組分、相同組分不同pH值條件下聚合物的結(jié)構(gòu)特性、微觀形態(tài)及其主要驅(qū)動(dòng)力的差異,探討不同大豆蛋白組分在低pH值條件下的自組裝聚合結(jié)構(gòu)與功能特性之間的關(guān)系,為改善大豆蛋白功能性提供一種新思路。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    試驗(yàn)采用的大豆(Glycinemax)原料品種為東農(nóng)42號(hào)大豆,經(jīng)研磨、過(guò)篩、脫脂制備脫脂豆粉。其它化學(xué)試劑均為分析純(AR)試劑。

    試驗(yàn)使用的主要儀器有:GL-21M型離心機(jī),上海精密儀器研究所;DK-98-ⅡA 型恒溫水浴鍋,天津市泰斯特儀器有限公司;pHS-3C 型精密 pH 計(jì),梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;AL204 型分析天平, 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;LNK-872 型多功能快速消化器,江蘇省宜興市科教儀器研究所;KDN-102C 型半自動(dòng)定氮儀,上海纖檢儀器有限公司;JEM-1200EX型透射電子顯微鏡,日本日立公司;S-3400N型掃描電子顯微鏡,日本日立公司;DTT-6C型電泳儀,北京六一儀器廠;DYCZ-28A型電泳槽,北京六一儀器廠;UV-240IPC型紫外可見分光光度計(jì),日本島津公司;PE Pyris6 型差示掃描量熱儀,美國(guó)PE公司;H-1 微型漩渦混合器,上海精科實(shí)業(yè)有限公司;F-4500 型熒光分光光度計(jì),日本日立公司;旋轉(zhuǎn)流變儀,英國(guó)馬爾文公司;DS-1型高速組織搗碎機(jī),上海精科實(shí)業(yè)有限公司;LGJ-1型冷凍干燥機(jī),上海醫(yī)用儀器分析廠;TA-XT2 PLUS 型物性測(cè)定儀,英國(guó) Stable Micro System 公司。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1原料成分的測(cè)定

    脫脂豆粉蛋白含量參照AOAC 991.20[10]測(cè)定。

    1.2.2蛋白樣品的制備

    脫脂豆粉的制備:將大豆磨碎后過(guò)40目篩,所得的豆粉按照文獻(xiàn)[11]脂肪的測(cè)定方法脫除脂肪,最后將脫脂豆粉風(fēng)干,重新過(guò)40目篩,得到蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40.83%的脫脂豆粉。

    可溶性大豆蛋白(以下簡(jiǎn)稱全蛋白)的制備:將脫脂豆粉與水按照液料比10 mL/g混合,分別將其調(diào)制不同的pH值,室溫(20℃)下攪拌1 h,4℃下離心(10 000g,20 min)處理,取上清液,即為相應(yīng)pH值下水可溶性全蛋白溶液。

    7S和11S的分離制備:將得到的水可溶性全蛋白溶液調(diào)pH值到6.4,4℃條件下冷沉12 h,4℃下冷凍離心(10 000g,20 min),得到的沉淀即為11S的粗提物。將11S沉淀復(fù)溶,分別將其調(diào)制不同的pH值,室溫下攪拌1 h,4℃下離心(10 000g,20 min)處理,取上清液待用。收集可溶性蛋白的上清液,調(diào)pH值到4.8,8℃下離心(6 500g,20 min)處理,得到的沉淀即為7S粗提物。將7S沉淀復(fù)溶,分別將其調(diào)制不同的pH值,室溫下攪拌1 h,4℃下離心(10 000g,20 min)處理,取上清液待用[12]。

    酸性亞基和堿性亞基的分離制備:酸性亞基和堿性亞基的分離[13]由大豆球蛋白(11S)開始。用30 mol/L的pH值8.0的Tris緩沖液將大豆球蛋白(11S)稀釋到0.005 g/mL,然后加入β-巰基乙醇使其濃度為15 mol/L,90℃加熱處理30 min,冷卻到室溫后,4℃下離心(10 000g,20 min) 處理,所得的沉淀即為堿性亞基。將沉淀復(fù)溶,分別將其調(diào)制不同的pH值,室溫下攪拌1 h,4℃下離心(10 000g,20 min)處理,取上清液待用。收集除掉堿性亞基的上清液用2 mol/L HCl調(diào)pH值到4.8,4℃離心(6 500g,20 min)處理,沉淀物即為酸性亞基。將沉淀復(fù)溶,分別將其調(diào)制不同的pH值,室溫下攪拌1 h,4℃下離心(10 000g,20 min)處理,取上清液待用。

    1.2.3凝膠的制備

    利用凱氏定氮法測(cè)定溶液的蛋白質(zhì)含量,將溶液的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)調(diào)至3.0%,再用1 mol/L HCl和0.1 mol/L HCl將溶液調(diào)至相應(yīng)的pH值,全蛋白90℃,7S 80℃,11S、酸性亞基、堿性亞基95℃,分別水浴10 h,取出立即冷卻,4℃冰箱保存12 h。

    1.2.4表面疏水性

    采用ANS熒光探針法[14]進(jìn)行測(cè)定。分別將不同蛋白樣品用磷酸鹽緩沖液(0.01 mol/L,pH值7.0)依次稀釋至0.1、0.05、0.025、0.012 5 mg/mL后,取不同質(zhì)量濃度樣品的溶液6 mL,分別加入 25 μL 8 mmol/L 的 ANS 溶液(用0.01 mol/L、pH值7.0 的磷酸鹽緩沖液配制),經(jīng)振蕩后靜置15 min,再測(cè)定樣品的熒光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)中激發(fā)波長(zhǎng)λex=390 nm,發(fā)射波長(zhǎng)λem=470 nm,夾縫為5 nm。以熒光強(qiáng)度對(duì)蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度制圖,初始段斜率即為蛋白質(zhì)分子的表面疏水性指數(shù)。

    多角度寫——既從參與者(自己)的角度來(lái)寫所見、所聞、所感,也從旁觀者(他人)的角度來(lái)寫;既從面上來(lái)寫集體的表現(xiàn),也從點(diǎn)上來(lái)寫有特點(diǎn)的個(gè)體表現(xiàn)。

    1.2.5游離巰基

    蛋白溶液中游離巰基的測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[15]的方法,并加以改進(jìn)。取 0.25 mL大豆蛋白聚合物溶液(20 mg/mL)加入到5 mL Tris-Gly緩沖溶液(0.086 mol/L Tris,0.09 mol/L 甘氨酸,0.004 mol/L乙二胺四乙酸,pH值8.0和8 mol/L 尿素)中,然后再向其中加入體積為20 μL的2,2-dinitro-5,5-dithiodibenzoate (DTNB)試劑,振蕩混勻,在室溫下靜置15 min,利用紫外分光光度計(jì)在412 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度,以不加蛋白樣的溶液做空白調(diào)零。游離巰基質(zhì)量摩爾濃度計(jì)算公式為

    SH=73.53A412D/C

    式中SH——游離巰基質(zhì)量摩爾濃度,μmol/g

    A412——412 nm下的吸光度

    C——固形物質(zhì)量濃度,mg/mL

    D——稀釋系數(shù)

    1.2.6透射電鏡

    參照文獻(xiàn)[16]的方法,使用透射電子顯微鏡(TEM)測(cè)定樣品的微觀結(jié)構(gòu)。將蛋白樣用去離子水稀釋成蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的待測(cè)樣品,取一滴稀釋液滴于透射電鏡專用銅網(wǎng)上吸附15 min,多余的部分用濾紙移除,室溫下干燥10 min,80 kV電壓下用透射電鏡進(jìn)行分析。

    1.2.7掃描電鏡

    參照文獻(xiàn)[17]的方法,實(shí)驗(yàn)操作步驟如下:①固定:取凝膠約1 cm3左右,加入pH值6.8、2.5%的戊二醛進(jìn)行固定,然后置于4℃冰箱中保存。②切片:用液氮將樣品冷凍,小心用刀片切斷橫截面。③沖洗:用pH值6.8磷酸緩沖液反復(fù)沖洗3次,每次10 min。④脫水:分別用體積分?jǐn)?shù)為 30%、50%、70%、90%、100%的乙醇脫水,每次10~15 min, 乙醇體積分?jǐn)?shù)為 100%時(shí)脫水3次。其他體積分?jǐn)?shù)時(shí)各一次。100%的乙醇中要加入吸水劑。⑤置換:100%乙醇10 min,100%乙醇與叔丁醇體積比1∶1一次,純叔丁醇一次,各10 min。⑥冷凍干燥。⑦鍍金:選擇要觀察的面進(jìn)行固定,離子漸射鍍金。⑧上鏡觀察,取相。

    1.2.8質(zhì)構(gòu)測(cè)定

    本實(shí)驗(yàn)采用TA-XT2型物性測(cè)定儀測(cè)定凝膠的質(zhì)構(gòu),它通過(guò)模擬人的觸覺感應(yīng),分析檢測(cè)觸覺中的物理特性。參照文獻(xiàn)[18]的方法,采用直徑為35 mm的P35型探頭以恒定的速率施加于樣品上,記錄穿透厚度達(dá)到一定值時(shí)所用的力。實(shí)驗(yàn)參數(shù):測(cè)前速度1.0 mm/s;測(cè)試速度1.7 mm/s;測(cè)后速度2.0 mm/s,感應(yīng)力設(shè)為50 N,測(cè)試距離為10 mm。

    1.2.9流變學(xué)測(cè)定

    表觀粘度測(cè)定:參照文獻(xiàn)[19]的方法,略有修改。采用馬爾文流變儀穩(wěn)態(tài)測(cè)試系統(tǒng)測(cè)試表觀粘度,選擇夾具直徑為60 mm的平行板,平行板之間的夾距為500 nm,取3.0%樣品分散液緩慢傾注充滿夾具,溢出的部分用專用的塑料刮勺刮去,蓋好保溫套,剪切速率范圍0.01~100 s-1。

    粘彈性測(cè)定[20]:選擇夾具直徑為60 mm、夾角為0.5°的錐形板,通過(guò)應(yīng)力掃描,確定應(yīng)力為0.050 61 Pa。

    1.3 數(shù)據(jù)處理分析

    實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin 2017進(jìn)行制圖和IBM SPSS Statistics v 20.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA方差分析,檢驗(yàn)差異顯著性(P<0.05)。數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示(n=3)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 pH值對(duì)流變學(xué)特性的影響

    不同pH值(1.5、2.0、2.5、3.0)條件下大豆全蛋白熱聚合后流變學(xué)特性存在很大差異,從圖1(圖中G′為貯能模量,G″為損耗模量)的結(jié)果可以看出,同一pH值條件下,隨著剪切速率的增加,全蛋白的表觀粘度降低,并且pH值越低,其表觀粘度降低幅度越大,尤其是在剪切初期。pH值3.0樣品的表觀粘度大一些,抗剪切能力強(qiáng)一些,隨pH值的降低依次遞減,pH值1.5時(shí)最低。同樣,隨著頻率的增加,粘彈性逐漸升高,pH值3.0樣品的彈性模量和粘性模量表現(xiàn)最好,其次是pH值2.0、pH值2.5,pH值1.5時(shí)最差(圖1)。pH值改變帶來(lái)的流變學(xué)性質(zhì)變化可能與大豆蛋白聚合物結(jié)構(gòu)差異有關(guān)[21-22]。

    2.2 不同大豆蛋白組分的凝膠質(zhì)構(gòu)特性

    不同pH值會(huì)帶來(lái)大豆全蛋白流變學(xué)性能的差異,當(dāng)把全蛋白分離為7S、11S,11S又分離為酸性亞基和堿性亞基,這些不同大豆蛋白組分在相同蛋白不同pH值條件下凝膠特性也同樣存在很大差異。從表1可以看到,全蛋白在pH值3.5處形成的凝膠硬度是pH值2.0處形成的1.19倍;7S凝膠的這種差異更加明顯,是其1.91倍;11S形成的兩種凝膠的倍數(shù)關(guān)系是3.16;酸性亞基是1.827倍;堿性亞基2種pH值下形成的熱致凝膠硬度差異小,是其0.742倍,差異性不明顯。上述結(jié)果可以發(fā)現(xiàn),對(duì)于pH值3.5的蛋白凝膠來(lái)說(shuō),其硬度、黏性及咀嚼性都高于pH值2.0各種大豆蛋白組分形成的凝膠(表1)。

    圖1 不同pH值樣品表觀粘度及粘彈性的變化曲線Fig.1 Apparent viscosity changes of samples at different pH values

    2.3 不同大豆蛋白組分的聚合形態(tài)

    大豆全蛋白、7S、11S、酸性亞基和堿性亞基在不同pH值條件下凝膠性能的差異可能與形成的聚合物形態(tài)存在很大關(guān)系。從透射電鏡的結(jié)果可以看出,pH值2.0和pH值3.5兩種條件下,蛋白聚合物形態(tài)有很大不同,pH值2.0主要以纖維或鏈狀結(jié)構(gòu)為主;pH值3.5則以顆?;蚱瑺顖F(tuán)簇結(jié)構(gòu)為主。其中堿性亞基在兩個(gè)pH值條件下聚合物狀態(tài)差別不大,沒有明顯的纖維聚合物形成,都是以團(tuán)簇狀聚集。在掃描電鏡中可以看到,對(duì)于不同大豆蛋白成分的凝膠,其在pH值3.5處凝膠的結(jié)構(gòu)比在pH值2.0處凝膠的結(jié)構(gòu)更致密,孔隙度很小且均勻,網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)更規(guī)則,這與其聚合特性也有關(guān),在pH值3.5處的聚合為顆粒聚合,pH值2.0處的蛋白為線性或鏈狀聚合。其中7S和酸性亞基兩種蛋白成分在不同pH值形成的凝膠微觀結(jié)構(gòu)的差異性表現(xiàn)最為明顯(圖2)。

    2.4 聚合驅(qū)動(dòng)力

    對(duì)于全蛋白、7S和11S的變化規(guī)律,在熱處理1 h時(shí),表面疏水性達(dá)到最大,隨后的加熱處理過(guò)程,表面疏水性呈下降趨勢(shì),而酸性亞基和堿性亞基在加熱過(guò)程中,表面疏水性均呈下降趨勢(shì)。產(chǎn)生這種差異可能是由于其分子結(jié)構(gòu)的差異。5種蛋白樣品表面疏水性在不同pH值條件的變化均從小到大依次為pH值1.5、pH值2.0、pH值3.0、pH值3.5(圖3)。由于未加熱前不同pH值的表面疏水性接近,進(jìn)而說(shuō)明pH值越低疏水相互作用能力越強(qiáng)。相對(duì)于pH值3.5處形成的顆粒凝膠,在pH值2.0處細(xì)鏈凝膠的疏水相互作用是主要作用力,而pH值3.5處顆粒凝膠的這種非共價(jià)作用力弱(圖3)。

    表1 不同樣品的質(zhì)構(gòu)特性比較Tab.1 Comparison of textural properties of different samples

    注:不同pH值同一參數(shù)a、b表示差異顯著(P<0.05)。

    圖2 不同pH值的各種蛋白加熱的透射電鏡和掃描電鏡圖像Fig.2 Transmission electron microscopy images and SEM pictures of aggregates with different morphologies formed by heating proteins under different conditions

    圖3 不同蛋白樣品表面疏水性變化曲線Fig.3 Surface hydrophobic change of different protein samples

    圖4 不同蛋白樣品的游離巰基變化曲線Fig.4 Free sulfhydryl group change of different protein samples

    對(duì)于共價(jià)鍵-二硫鍵的變化而言,在不同大豆蛋白樣品中,熱處理帶來(lái)的游離巰基變化規(guī)律是一致的,都有明顯下降趨勢(shì)且從小到大依次為pH值3.5、pH值3.0、pH值2.0、pH值1.5(圖4)。其中酸性亞基和堿性亞基由于在分離過(guò)程中加入β-巰基乙醇的作用,斷開了二硫鍵,其游離巰基的含量明顯高于可溶性全蛋白和7S、11S(圖4)。但是其變化規(guī)律仍然一致。在加熱的過(guò)程中游離巰基相互結(jié)合形成二硫鍵,造成游離巰基的數(shù)量減少,pH值越低的樣品其減小程度越小。低pH值條件下形成的細(xì)鏈凝膠其二硫鍵作用相對(duì)顆粒凝膠要弱,即相對(duì)顆粒凝膠共價(jià)作用弱,非共價(jià)作用較強(qiáng)。

    3 結(jié)論

    (1)低pH值會(huì)帶來(lái)不同大豆蛋白組分聚合結(jié)構(gòu)及凝膠形態(tài)的差異,多數(shù)大豆蛋白組分在pH值2.0時(shí)形成柔長(zhǎng)細(xì)鏈狀的細(xì)鏈凝膠,7S和酸性亞基纖維化明顯,pH值3.5時(shí)多為顆粒形、短簇片狀的顆粒凝膠。

    (2)pH值在等電點(diǎn)以下的變化會(huì)帶來(lái)大豆蛋白組分熱聚合結(jié)構(gòu)的改變,進(jìn)而產(chǎn)生功能性質(zhì)的變化,細(xì)鏈凝膠表觀粘度降低幅度較顆粒凝膠大,硬度相對(duì)較低。

    (3)細(xì)鏈凝膠的形成中主要作用力是疏水相互作用,二硫鍵的作用很弱。相反,在顆粒凝膠的形成中,二硫鍵的作用較細(xì)鏈凝膠強(qiáng),非共價(jià)鍵作用弱。

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