EGFR突變影響非小細(xì)胞肺癌PD-L1表達(dá)的研究進(jìn)展

智曉玉 李衛(wèi)威 王少偉 汪進(jìn)良

肺癌，尤其是非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC），是腫瘤相關(guān)性死亡的最主要原因[1]。在傳統(tǒng)手術(shù)治療、鉑類為基礎(chǔ)的化療以及放療快速發(fā)展的背景下，NSCLC的治療效果仍不能達(dá)到理想狀態(tài)。目前，以吉非替尼、厄洛替尼、奧希替尼等為代表的表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKIs）成為存在EGFR突變NSCLC患者的標(biāo)準(zhǔn)一線治療方案[2]，其客觀緩解率可達(dá)到70%左右甚至更高，但通常1年左右就會(huì)產(chǎn)生耐藥[3]。因此，亟待尋求新的治療方法以應(yīng)對(duì)EGFR突變的NSCLC患者耐藥的發(fā)生。近年來，以程序性死亡受體1（programmed death-1, PD-1）及其配體（programmed death-1 ligand, PD-L1）抑制劑為代表的免疫檢查點(diǎn)抑制劑（immune checkpoint inhibitors, ICIs）在肺癌治療中取得突破性進(jìn)展，但既往研究[4-7]卻顯示其對(duì)EGFR突變患者的治療效果并不理想。這就說明，EGFR突變很可能通過影響腫瘤免疫微環(huán)境，而進(jìn)一步影響PD-1/PD-L1抑制劑對(duì)腫瘤的殺傷效果。PD-L1表達(dá)率是評(píng)估PD-1/PD-L1抑制劑治療效果的潛在因素，尤其是其高表達(dá)的患者可以從相關(guān)治療中獲益更多[8]。我們將進(jìn)一步總結(jié)EGFR突變對(duì)PD-L1表達(dá)影響的基礎(chǔ)及臨床研究，并對(duì)其結(jié)果存在差異的原因進(jìn)行簡單探討，希望可以對(duì)相關(guān)研究及PD-1/PD-L1抑制劑的臨床應(yīng)用提供有效的建議及指導(dǎo)。

1 EGFR突變導(dǎo)致PD-L1表達(dá)上調(diào)相關(guān)研究

1.1 基礎(chǔ)研究 2014年，Azuma團(tuán)隊(duì)[9]對(duì)14種人NSCLC細(xì)胞系（PC9、HCC827、NCI-H1975、QG56、1-87、 H1299、H2122、H322、H460、LK2、LK87、H23、A549、H157）進(jìn)行流式細(xì)胞分析技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)存在EGFR突變的細(xì)胞系PD-L1表達(dá)明顯高于EGFR野生型細(xì)胞系（P=0.023），且EGFR突變型細(xì)胞系HCC827、PC-9、H1975可以檢測(cè)到EGFR高水平的磷酸化作用（表1）。為了探索EGFR通路對(duì)PD-L1表達(dá)的影響，研究者進(jìn)一步對(duì)EGFR突變細(xì)胞系HCC827、PC-9應(yīng)用厄洛替尼處理后發(fā)現(xiàn)其PD-L1表達(dá)下調(diào)以及EGFR磷酸化受到抑制，但對(duì)EGFR野生型細(xì)胞系A(chǔ)549、H1975應(yīng)用厄洛替尼處理后并未影響其PD-L1的表達(dá)及EGFR磷酸化水平。該研究說明，EGFR突變可以導(dǎo)致人NSCLC細(xì)胞系PD-L1表達(dá)上調(diào)。

表 1 依據(jù)基因突變狀態(tài)和組織病理學(xué)分類的肺癌細(xì)胞系Tab 1 Lung cancer cell lines classified according to oncogene status and histology

Chen等[10]于2015年對(duì)人NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549、PC-9、HCC827、H1975、H1993以及Beas-2B細(xì)胞系進(jìn)行的相關(guān)研究進(jìn)行了報(bào)道。該研究主要由四部分組成：①研究者通過蛋白質(zhì)印跡法、RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，EGFR突變NSCLC細(xì)胞系（PC-9、HCC827、H1975）PD-L1表達(dá)水平明顯高于EGFR野生型細(xì)胞系（A549、H1993）和Beas-2B細(xì)胞系；并進(jìn)一步應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法及流式細(xì)胞分析技術(shù)對(duì)H1975和A549細(xì)胞系PD-L1表達(dá)情況進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果與之前一致。②研究者使用了EGF去激活EGFR野生型細(xì)胞系，研究發(fā)現(xiàn)隨著EGF激活劑量的升高（0 ng/mL-40 ng/mL）Beas-2B細(xì)胞系中p-EGFR和PD-L1蛋白表達(dá)也逐漸升高；隨后，研究者對(duì)該細(xì)胞系進(jìn)行了轉(zhuǎn)染來促進(jìn)不同強(qiáng)度的EGFR-19del以及EGFR-L858R表達(dá)，發(fā)現(xiàn)同樣可以導(dǎo)致p-EGFR和PD-L1表達(dá)水平的升高。③研究者發(fā)現(xiàn)吉非替尼可以逆轉(zhuǎn)EGF激活導(dǎo)致的p-EGFR以及PD-L1表達(dá)上調(diào)；可以逆轉(zhuǎn)Beas-2B-EGFR-L858R 細(xì)胞系PD-L1表達(dá)上調(diào)；可以降低PC-9、HCC827細(xì)胞系的PD-L1蛋白表達(dá)；吉非替尼不會(huì)使H1975細(xì)胞系p-EGFR以及PD-L1表達(dá)發(fā)生變化，但C0-1686（三代EGFR-TKI）可以使該細(xì)胞系PD-L1表達(dá)下調(diào)。④研究者進(jìn)一步研究認(rèn)為EGFR突變是通過p-ERK 1/2/p-c-jun信號(hào)通路而不是p-AKT/p-S6通路影響PD-L1的表達(dá)。該研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步驗(yàn)證了Azuma團(tuán)隊(duì)的相關(guān)研究，不僅說明了EGFR突變可以導(dǎo)致人NSCLC細(xì)胞系PD-L1表達(dá)上調(diào)，并對(duì)EGFR影響PD-L1表達(dá)的通路機(jī)制進(jìn)行了簡單探索。

隨后，Lin等[11]通過流式細(xì)胞分析技術(shù)發(fā)現(xiàn)EGFR突變細(xì)胞系（PC-9、HCC827、NCI-H1650）比EGFR野生型細(xì)胞系（NCI-H1299、NCI-H460、SPC-A1）PD-L1表達(dá)高。同樣，為了確定EGFR的激活可以誘導(dǎo)PD-L1表達(dá)，研究者應(yīng)用了重組人EGF（100 ng/mL）刺激H460細(xì)胞系，24 h后在該細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)了升高的PD-L1 mRNA及蛋白質(zhì)。充分說明EGFR激活可導(dǎo)致PD-L1表達(dá)上調(diào)。研究者進(jìn)一步對(duì)PC-9以及HCC827細(xì)胞系進(jìn)行不同劑量吉非替尼培養(yǎng)48 h后發(fā)現(xiàn)，其PD-L1表達(dá)水平下調(diào)并且呈劑量依賴型。對(duì)嚴(yán)重免疫缺陷小鼠移植PC-9細(xì)胞系后應(yīng)用吉非替尼并與溶媒組進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用吉非替尼的小鼠PD-L1表達(dá)低于對(duì)照組。相較之前的研究，該研究進(jìn)一步說明應(yīng)用EGFR-TKIs可以降低小鼠體內(nèi)PC-9細(xì)胞系的PD-L1表達(dá)。

Ota研究團(tuán)隊(duì)[12]在2015年通過RT-PCR及流式細(xì)胞分析技術(shù)對(duì)EGFR突變細(xì)胞系（HCC827、H1975、PC-9、11-18、H1650）及野生型細(xì)胞系（H322、A549、1-87、LK87、H23、H2122、H1437、H1573、H1944、H157、H596、H460、H1299）的PD-L1 mRNA以及PD-L1細(xì)胞膜蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)EGFR突變型細(xì)胞系PD-L1 mRNA以及細(xì)胞膜蛋白表達(dá)均高于野生型。并且進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用厄洛替尼可以使HCC827細(xì)胞系PD-L1 mRNA以及PD-L1細(xì)胞膜蛋白表達(dá)下調(diào)。

2016年Zhang等[13]同樣采用RT-PCR和蛋白印跡分析技術(shù)對(duì)NSCLC細(xì)胞株EGFR野生型（A549、H1299、SPC-A1）和突變型（PC-9、H1975、HCC827）細(xì)胞系進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)EGFR突變細(xì)胞系PD-L1表達(dá)高于野生型。但H1299與PC-9細(xì)胞系PD-L1表達(dá)相近，考慮與PC-9細(xì)胞系TP53缺失有關(guān)，并且已有研究[14]證實(shí)其與PD-L1表達(dá)水平具有相關(guān)性，這也就說明共突變的存在可以進(jìn)一步影響PD-L1的表達(dá)水平。同時(shí)該研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，EGFR突變影響PD-L1表達(dá)的通路可能為IL-6/JAK/STAT3。

2019年Guo研究團(tuán)隊(duì)[15]對(duì)人NSCLC細(xì)胞系H522、H661、HCC827、H1299、HCC2935、H1650、H1792、H1975進(jìn)行蛋白印跡技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，三種EGFR突變細(xì)胞系（HCC827、HCC2935、H1975）PD-L1表達(dá)水平高于EGFR野生型細(xì)胞系（H522、H661、H1792、H1299）。為了進(jìn)一步探究EGFR突變對(duì)PD-L1表達(dá)的影響，研究者對(duì)H661細(xì)胞系進(jìn)行轉(zhuǎn)染（e19del、e19del+T790M、L858R、L858R+T790M），發(fā)現(xiàn)經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系PD-L1表達(dá)高于EGFR野生型細(xì)胞系。該研究較其他研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了EGFR突變細(xì)胞系較野生型細(xì)胞系IκBα及低氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α）升高。

在進(jìn)行EGFR突變對(duì)PD-L1表達(dá)影響的基礎(chǔ)研究過程中，Abdelhamed團(tuán)隊(duì)[16]、Lastwika團(tuán)隊(duì)[17]的研究結(jié)果也顯示了EGFR突變可以上調(diào)PD-L1表達(dá)，并分別對(duì)相關(guān)影響通路AKT/STAT3以及AKT/mTOM進(jìn)行了進(jìn)一步的簡要探索。

1.2 臨床研究 見表2。Azuma團(tuán)隊(duì)[9]在體外細(xì)胞系研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步對(duì)164例NSCLC患者進(jìn)行PD-L1表達(dá)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，EGFR突變患者PD-L1表達(dá)率明顯高于EGFR野生型（P＜0.001），且EGFR突變是導(dǎo)致PD-L1表達(dá)上調(diào)的獨(dú)立因素（OR=25.4, 95%CI: 2.9-47.9, P=0.027）。

D'incecco等[18]對(duì)125例晚期NSCLC患者進(jìn)行PD-L1表達(dá)分析，其中包括56例EGFR突變、29例KRAS突變、10例ALK突變、30例EGFR/KRAS/ALK野生型。在進(jìn)行分析的標(biāo)本中，有78.4%的標(biāo)本來自于原發(fā)病灶，13.6%的標(biāo)本來自于轉(zhuǎn)移病灶。其中123例標(biāo)本成功進(jìn)行了PD-L1表達(dá)評(píng)估，中位表達(dá)水平為75。對(duì)29例三陰性患者標(biāo)本進(jìn)行評(píng)估后發(fā)現(xiàn)中位PD-L1表達(dá)水平是20，明顯低于EGFR突變120（P＜0.001）、ALK突變115（P=0.02）、KRAS突變55（P=0.06）。在EGFR突變標(biāo)本中PD-L1陽性率較高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001）。

Tang等[19]研究了170例晚期NSCLC患者的PD-L1過表達(dá)率是65.9%（112/170）。其中，99例患者存在EGFR突變。PD-L1過表達(dá)在EGFR突變患者與野生型患者中分別占71.9%（64/89）、57.1%（32/56）（P=0.067）。

Song等[20]對(duì)385例肺腺癌PD-L1表達(dá)情況進(jìn)行研究。該研究中，腫瘤比例評(píng)分（tumor proportion score, TPS）≥5%視為表達(dá)陽性。該研究發(fā)現(xiàn)205例EGFR突變患者中，112例（54.6%）PD-L1表達(dá)陽性；180例EGFR野生型患者中74例（41.1%）表達(dá)陽性（P=0.008）。研究者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在385例患者中有24例存在基因突變共表達(dá)的情況，且共突變比單基因突變對(duì)PD-L1陽性表達(dá)的影響更大（P＜0.001）。205例EGFR突變患者中包括14例共突變患者，這就說明基因共突變存在也是可能影響研究結(jié)果的因素。

2 EGFR突變導(dǎo)致PD-L1表達(dá)下調(diào)的臨床研究

Huynh等[21]對(duì)261例肺腺癌進(jìn)行PD-L1表達(dá)評(píng)估。該研究排除既往進(jìn)行過新輔助化療的患者。包括54例EGFR突變患者，有5例TPS≥5%，49例TPS＜5%。該研究發(fā)現(xiàn)，EGFR突變與PD-L1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（P＜0.001）。

Ji等[22]對(duì)100例原發(fā)性肺腺癌患者標(biāo)本進(jìn)行PD-L1表達(dá)情況檢測(cè)。已排除既往行新輔助化療或有過惡性腫瘤病史的患者。該研究將cut-off值設(shè)置為5%。60例EGFR突變患者中，42例PD-L1低表達(dá)，18例高表達(dá)；EGFR野生型患者中18例低表達(dá)，22例高表達(dá)。該研究發(fā)現(xiàn)存在EGFR突變的患者PD-L1表達(dá)降低（P=0.012）。

Inoue等[23]對(duì)654例NSCLC患者進(jìn)行研究，包括腺癌430例（65.7%）、鱗癌179例（27.4%）、其他45例（6.9%）。其中EGFR突變患者132例（20.2%），PD-L1表達(dá)陽性25例（12.4%），陰性107例（23.6%）；EGFR野生型522例（79.8%），PD-L1表達(dá)陽性176例（87.6%），陰性346例（76.4%）。該研究同樣發(fā)現(xiàn)EGFR突變可以下調(diào)PD-L1表達(dá)（P=0.001）。

表 2 已發(fā)表NSCLC患者EGFR 突變狀態(tài)與PD-L1表達(dá)相關(guān)性的研究匯總Tab 2 Published report that have studied the relationship of EGFR mutation and PD-L1 expression in NSCLC

Dong等[24]對(duì)15項(xiàng)研究進(jìn)行了匯總分析發(fā)現(xiàn)存在EGFR突變的患者PD-L1表達(dá)較低（OR=1.79, 95%CI: 1.10-2.93, P=0.02）。為了對(duì)該匯總分析結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，研究者對(duì)腫瘤基因圖譜研究（The Cancer Genome Atlas, TCGA）中的237例肺腺癌患者進(jìn)行反向蛋白質(zhì)陣列分析（reverse phase protein microarray, RPPA），發(fā)現(xiàn)EGFR突變患者的PD-L1表達(dá)蛋白要比EGFR野生型低（P=0.014）；并對(duì)通過全基因組測(cè)序（wholegenome sequencing, WGS）對(duì)廣東省肺癌研究所（Guangdong Lung Cancer Institute, GLCI）的mRNA情況進(jìn)行分析，也顯示EGFR突變患者PD-L1表達(dá)低于EGFR野生型患者（P=0.044）。研究者進(jìn)一步對(duì)GLCI 255例NSCLC患者分析發(fā)現(xiàn)，EGFR突變和PD-L1表達(dá)具有負(fù)相關(guān)性（P=0.014）。

2017年Takada研究團(tuán)隊(duì)[25]檢測(cè)了499例原發(fā)NSCLC患者PD-L1表達(dá)情況，并采用了4種不同cut-off值進(jìn)行評(píng)估。這些患者中排除新輔助治療以及既往頭頸部、食道鱗癌患者。EGFR突變?cè)谙侔┗颊咧袡z測(cè)，其中有效標(biāo)本為235例，包括112例（47.7%）突變型以及123例野生型（52.3%）。按照1%、5%、10%、50% cut-off值分別進(jìn)行分類的情況下，EGFR突變肺腺癌患者的PD-L1表達(dá)均低于EGFR野生型患者。于2018年，該研究團(tuán)隊(duì)[26]再次對(duì)441例原發(fā)肺腺癌PD-L1表達(dá)情況進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，EGFR野生型與PD-L1的陽性表達(dá)具有相關(guān)性（P＜0.000,1）。同時(shí)，該研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)EGFR不同位點(diǎn)的突變與PD-L1表達(dá)無明顯相關(guān)性（P=0.599,9），但PD-L1 TPS 5%-49%在EGFR 19del患者中明顯高于EGFR外顯子21 L858R突變（12.2% vs 2.6%）。

Li等[27]分析了21項(xiàng)研究的4,857例患者，1,435例存在EGFR突變的患者中608例（36.7%）存在PD-L1陽性表達(dá)；3,422例突變野生型患者中1,456例（44.1%）存在PD-L1陽性表達(dá)。PD-L1表達(dá)與EGFR野生型存在相關(guān)性（OR=0.68, 95%CI: 0.48-0.96, P=0.03）。

近期，Lee等[28]對(duì)1,000例手術(shù)切除NSCLC患者（腺癌785例，鱗癌188例，21例大細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌，4例類癌，2例小細(xì)胞肺癌）PD-L1表達(dá)情況進(jìn)行了研究。在按照＜1%、1%-49%、≥50% cut-off值分別進(jìn)行分類的情況下，發(fā)現(xiàn)肺腺癌中存在EGFR突變患者（424例）的PD-L1表達(dá)率明顯低于EGFR野生型患者（P＜0.000,1）。

3 EGFR突變導(dǎo)致PD-L1表達(dá)改變無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2014年Yang等[29]對(duì)163例肺腺癌患者PD-L1表達(dá)情況進(jìn)行研究。PD-L1 TPS≥5%視為表達(dá)陽性。結(jié)果顯示，PD-L1陽性表達(dá)率為39.9%（65/163），但其陽性表達(dá)水平與常見的肺腺癌突變基因EGFR（P=0.193）、KRAS（P=0.268）、BRAF（P=0.438）和ALK（P=0.564）均沒有相關(guān)性。2016年該團(tuán)隊(duì)又對(duì)105例肺鱗癌患者PD-L1表達(dá)情況進(jìn)行研究[30]。同樣，PD-L1 TPS≥5%視為表達(dá)陽性。PD-L1陽性表達(dá)率為56.2%（59/105），且陽性表達(dá)水平與突變基因EGFR（P=0.561）、KRAS（P=0.255）、BRAF（P=0.064）和ALK（N/A）均不具有相關(guān)性。

Zhang[31]對(duì)143例肺腺癌PD-L1表達(dá)情況進(jìn)行分析。并排除既往行新輔助化療或有過惡性腫瘤病史的患者。76例EGFR突變患者中，37例PD-L1表達(dá)陽性，39例表達(dá)陰性，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.946）。

Cooper研究團(tuán)隊(duì)[32]檢測(cè)了678例NSCLC患者PD-L1表達(dá)情況。其中包括腺癌276例、鱗癌271例、大細(xì)胞癌116例、混合3例、其他病理類型12例。腫瘤細(xì)胞TPS顯示≥50%或H-Score≥50考慮為PD-L1高表達(dá)。EGFR突變患者兩種分級(jí)方法中不同PD-L1表達(dá)情況患者的數(shù)量均相同。EGFR野生型且PD-L1 TPS＜50%的患者222例（93.7%），PD-L1 TPS≥50%的患者15例（6.3%）；EGFR突變型PD-L1 TPS＜50%的患者33例（100%），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.23）。

Kim[33]、Schmidt[34]、Gainor[35]、Ameratunga[36]等團(tuán)隊(duì)，在相關(guān)研究的過程中也發(fā)現(xiàn)NSCLC患者PD-L1表達(dá)情況與EGFR基因狀態(tài)無明顯相關(guān)性。

4 研究結(jié)果不一致原因分析

在對(duì)既往相關(guān)研究進(jìn)一步學(xué)習(xí)的過程中，我們不難發(fā)現(xiàn)，EGFR突變對(duì)PD-L1表達(dá)相關(guān)影響的研究結(jié)果存在不一致性，我們總結(jié)出以下幾點(diǎn)可能的原因：①大多數(shù)臨床研究為回顧性研究，存在選擇偏倚，且納入患者數(shù)量不同，有些研究納入患者數(shù)量較少。②在這些研究中，患者基線特征的異質(zhì)性也會(huì)影響研究的結(jié)果，比如患者不同地域的分布、病理分型及分期。有相關(guān)研究顯示，亞裔EGFR突變概率要高于非亞裔，在亞洲人群中EGFR突變?cè)贜SCLC中占39.6%，在肺腺癌中更是高達(dá)50%[37]；鱗癌與腺癌基因突變的概率與種類不同[38]；PD-L1陽性表達(dá)在鱗癌NSCLC中比腺癌更常見[39,40]。③免疫治療領(lǐng)域目前缺乏關(guān)于PD-L1標(biāo)準(zhǔn)化測(cè)試，許多不同的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)與試劑被應(yīng)用[41]。有研究[42]發(fā)現(xiàn)對(duì)同一標(biāo)本應(yīng)用不同抗體PD-L1蛋白表達(dá)結(jié)果不同；另外有研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用SP142染色的PD-L1表達(dá)陽性率低于其他抗體，如：28-8、22C3和SP263[43]。④PD-L1陽性表達(dá)的臨界值不同。⑤依據(jù)既往研究傳統(tǒng)化療[44]、抗血管治療[45-47]、EGFR-TKIs[10,11]均會(huì)對(duì)PD-L1表達(dá)有影響，本文提及的臨床研究部分未明確描述進(jìn)行PD-L1檢測(cè)前既往治療情況。

5 總結(jié)與展望

隨著PD-1/PD-L1抑制劑治療NSCLC相關(guān)研究的不斷進(jìn)展，腫瘤突變驅(qū)動(dòng)基因?qū)ζ渲委煰熜У挠绊戨S之被關(guān)注。腫瘤微環(huán)境是腫瘤細(xì)胞賴以生存和發(fā)展的復(fù)雜環(huán)境，腫瘤細(xì)胞PD-L1表達(dá)情況與PD-1/PD-L1免疫抑制劑治療效果存在一定相關(guān)性。因此，EGFR通路對(duì)PD-L1表達(dá)的影響也被進(jìn)一步探索。雖然目前相關(guān)研究結(jié)果存在差異，但我們期待在未來研究的過程中可以對(duì)EGFR突變影響PD-L1表達(dá)水平的多條信號(hào)通路進(jìn)行探索，并完成多中心、隨機(jī)性、前瞻性的臨床研究。希望在進(jìn)一步的探索過程中，可以為EGFR突變患者找到提高PD-1/PD-L1抑制劑治療療效的突破點(diǎn)。