2018年蜜蜂病毒學(xué)研究進展

鄭火青，鄧 潔

（浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058）

隨著對蜜蜂病毒病了解的逐步深入，蜜蜂病毒學(xué)已經(jīng)成為蜜蜂學(xué)研究中的一個重要分支領(lǐng)域。本文對2018年度國內(nèi)外在蜜蜂病毒學(xué)研究上取得的進展進行梳理，以期為蜜蜂病毒學(xué)研究和蜜蜂病毒病的防控提供一些參考。

1 病毒流行病學(xué)

關(guān)于蜜蜂病毒病最基礎(chǔ)的問題即是這些病毒在時間、空間和物種上的出現(xiàn)規(guī)律。因此，關(guān)于病毒的檢測和分析是蜜蜂病毒學(xué)研究中經(jīng)久不衰的主題。

Shum k ova等[1]檢測了保加利亞不同地區(qū)8個蜂場50個蜂群250只蜜蜂的6種常見病毒的感染情況，并做了進化樹分析，6種病毒分別為：蜜蜂急性麻痹病毒（Acute bee paralysis virus,ABPV）、黑蜂王臺病毒（Blac k queen cell virus,BQCV）、慢性蜜蜂麻痹病毒 （Chronic bee paralysis virus,CBPV）、殘翅病毒（Deformed win g virus,DWV）、克什米爾蜜蜂病毒（Kashm ir bee virus,KBV） 和囊狀幼蟲病毒（Sacbrood virus,SBV）。結(jié)果表明，除CBPV和KBV之外，其他4種病毒都有檢出，檢出率從高到低依次為DWV、SBV、ABPV和BQCV。值得注意的是，保加利亞蜜蜂病毒感染率很低，即使是作為檢出率最高的病毒，DWV的檢出率也只有10.20%，而SBV和BQCV的檢出率更是只有6.12%和1.5%。

Chanpanit k itchote等[2]檢測了泰國清邁省的西方蜜蜂（Apismellifera）、野生東方蜜蜂（Apis cerana） 及西方蜜蜂群里的梅氏熱厲螨（Tropilaelapsmercedesae）上的蜜蜂殘翅病毒和急性蜜蜂麻痹病毒，首次在東方蜜蜂和梅氏熱厲螨上檢測到ABPV；進化樹分析顯示，ABPV的傳播歷史可能是從梅氏熱厲螨傳播到西方蜜蜂，再到東方蜜蜂；而DWV的傳播歷史則可能是從東方蜜蜂到西方蜜蜂，再到梅氏熱厲螨。

食蚜蠅也是一類重要的授粉昆蟲，訪花種類和蜜蜂相似[3]。英國倫敦大學(xué)皇家霍洛威學(xué)院和劍橋大學(xué)兩個團隊合作，對英國最常見的4個食蚜蠅種的各20只個體檢測6種蜜蜂病毒（ABPV,BQCV,DWV-A型,DWV-B型,SBPV和SBV），在E ristalis tena x和E ristalis arbustorum 2個食蚜蠅種的部分個體能檢測到BQCV和SBV，在E.arbustorum部分個體還能檢測到DWV-B型。E ristalis上的SBV和西方蜜蜂SBV序列相似度達到95%～99%，BQCV相似度為87%～100%，這種最高達到99%和100%的序列相似度說明這2種病毒在食蚜蠅和西方蜜蜂間可以無障礙傳播。盡管該研究未能在食蚜蠅上檢測到病毒的負(fù)義鏈，不能說明這些病毒可以在食蚜蠅體內(nèi)復(fù)制，但食蚜蠅上SBV的滴度和西方蜜蜂上滴度相似，說明食蚜蠅很可能能成為SBV的宿主，這些結(jié)果至少說明食蚜蠅作為病毒傳播載體的角色不容忽視[4]。

2 病毒與其他致病因子的協(xié)同作用

蜜蜂抗病毒能力會受到其他因素的影響，而且不同因素共存很可能產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。絕大多數(shù)蜂群都攜帶或多或少的病毒，但不表現(xiàn)臨床癥狀，在特殊條件下，這些隱性感染的病毒可能爆發(fā)，導(dǎo)致蜂群崩潰[5]。因此，病毒與其他致病因子的協(xié)同作用是蜜蜂病毒學(xué)研究的另一熱點。

2018年度有2項研究都聚焦于CBPV與殺蟲劑的協(xié)同關(guān)系。Coulon等[6]研究了噻蟲嗪的代謝和與CBPV的協(xié)同作用關(guān)系。健康蜜蜂按照 0.25 n g/蜂·天的劑量攝入噻蟲嗪后，可較快地將噻蟲嗪降解為噻蟲胺，而且大部分會被排出體外。而在噻蟲嗪和CBPV共侵染的實驗中，高劑量的噻蟲嗪（5 n g/蜂·天） 在實驗第8～10 d時出現(xiàn)顯著更高的死亡率，但卻未引起CBPV滴度升高；而相對低劑量的噻蟲嗪（2.5 n g/蜂·天） 未導(dǎo)致更高的死亡率，但卻引起CBPV滴度顯著升高。該研究顯示，病原和殺蟲劑在蜜蜂上的協(xié)同作用關(guān)系可能比較復(fù)雜：更高的殺蟲劑劑量不一定會引起更高的病毒滴度，而可能會引起蜜蜂對病毒感染的耐受度降低。

Diao等[7]研究了吡蟲啉與CBPV之間的協(xié)同關(guān)系。給感染低滴度水平的CBPV的蜜蜂接種不同劑量的吡蟲啉后，在接種66 n g/蜂的劑量96 h后，CBPV的滴度顯著上升。該研究表明，隱性感染CBPV的蜜蜂接觸高劑量吡蟲啉后，健康情況可能受到顯著影響，也暗示，急性環(huán)境壓力因子可以成為病毒復(fù)制的主要加速因子，從而導(dǎo)致病毒大量擴增，進而導(dǎo)致蜂群衰亡。

狄斯瓦螨（Varroa destructor）是影響西方蜜蜂健康最重要的生物因子，其與病毒的協(xié)同作用是導(dǎo)致全世界蜂群損失的主要原因之一[8]。近年來，在全世界各地出現(xiàn)的多個西方蜜蜂自然抗螨種群為徹底解決狄斯瓦螨的問題帶來了希望，也為研究狄斯瓦螨與病毒的協(xié)同作用關(guān)系提供了另一研究視角。Thaduri等[9]分析了2009-2010年間采集的瑞典哥特蘭島抗螨蜂群的病毒組，并和附近的普通蜂群進行了比較，除BQCV、SBV和DWV外，還發(fā)現(xiàn)了Apis rhabdo virus-1（A R V-1） 和L a k e Sinaivirus(L SV)2種病毒，且這2種病毒在普通蜂群中的滴度高于抗螨蜂群?？跪淙褐蠦QCV、DWV、A R V-1和L SV的滴度在2009年秋至2010年春之間都呈上升趨勢，SBV在前3個時間點都有檢出，在最后一個時間點（2010年春）卻未檢出。該團隊在之前的一項研究中表明SBV對成年蜂蛋白加工過程起到負(fù)面影響，從而在蜂群健康方面扮演重要角色。這兩項研究的結(jié)果似乎將SBV對西方蜜蜂蜂群健康的影響提高到了一個新的認(rèn)識高度，但這些結(jié)論有待驗證。

3 影響越冬意蜂的病毒種類

陳功文等[10]通過比較分析3個蜂場共48群意大利蜜蜂越冬前與越冬后病毒感染情況，及其中1個蜂場8群蜜蜂越冬期間病毒感染情況的變化，探究了與越冬期蜜蜂健康緊密相關(guān)的病毒種類。對所取樣本檢測ABPV、BQCV、CBPV、DWV、I APV和SBV等6種病毒的感染情況，并對感染率較高的病毒進行基因組拷貝數(shù)定量。研究表明，DWV、BQCV和I APV在越冬意蜂群中感染率很高。與越冬后正常蜂群相比，瀕臨死亡的蜂群I APV病毒量基因組拷貝數(shù)極顯著更高，拷貝數(shù)到了109左右；出現(xiàn)蜂群死亡的蜂場在越冬期間，蜂群DWV基因組拷貝數(shù)病毒量呈下降趨勢，而I APV基因組拷貝數(shù)病毒量呈上升趨勢。這些結(jié)果表明，I APV是影響越冬期意蜂健康的重要因素。如何降低I APV感染水平及提高蜜蜂抗I APV能力是減少蜜蜂越冬期損失需面對的重要問題。

4 囊狀幼蟲病的基礎(chǔ)研究和防控

囊狀幼蟲病是中蜂的主要病害，同時對西方蜜蜂也有一定的影響[11]。2018年度蜜蜂病毒學(xué)研究領(lǐng)域影響力最大的成果當(dāng)屬發(fā)表于《美國科學(xué)院院刊》 （P N AS） 的關(guān)于SBV病毒粒子晶體結(jié)構(gòu)解析的報道[12]。同時SBV作為已知影響中蜂健康最主要的病毒，也是國內(nèi)學(xué)者最關(guān)注的病毒。

4.1 SBV病毒粒子晶體結(jié)構(gòu)的解析

Procház k ová等[12]通過解析SBV病毒粒子的晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)在SBV病毒粒子表面黏附有60拷貝數(shù)的微小衣殼蛋白，而在已報道的小核糖核酸病毒目相關(guān)病毒結(jié)構(gòu)中均不存在類似的結(jié)構(gòu)。從SBV基因組中的微小衣殼蛋白編碼序列位置可以推測該微小衣殼蛋白是通過導(dǎo)入一個病毒蛋白酶的剪切位點在主要衣殼蛋白C端延伸段進化而來的。SBV病毒進入細(xì)胞過程中很可能遇到酸性p H，并由此分別誘發(fā)三重軸和五重軸中心直徑大小7和12孔洞的形成。這與脊椎動物小核糖核酸病毒相反，因為當(dāng)前普遍認(rèn)為沿著二重二十面體對稱軸的孔洞是基因組的釋放位點。SBV病毒粒子無VP4亞基，而在很多相關(guān)的雙順反子病毒和小RN A病毒中VP4協(xié)助了基因組的釋放。微小衣殼蛋白亞基在體外導(dǎo)致脂質(zhì)體破碎，說明他們是VP4亞單位的功能相似物，使得病毒基因組能夠穿過內(nèi)體膜進入細(xì)胞質(zhì)。

4.2 SBV病毒在臺灣的流行

2016年春，臺灣中部地區(qū)發(fā)生中蜂囊狀幼蟲?。ㄒ韵潞喎Q中囊病）疫情。福建農(nóng)林大學(xué)M ehmood[13]對臺灣北部和中部地區(qū)2015-2016年的一些樣本進行了檢測，并進行了病毒系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果表明，從臺灣地區(qū)分離得到的CSBV的基因序列與亞洲其他地區(qū)的CSBV的基因序列有高度相似性，說明該病毒是由外來引入的；在患病蜂群的個體中病毒流行率較低，在無癥狀的蜂群中未發(fā)現(xiàn)潛伏感染，說明CSBV在臺灣的流行可能還處于初期，病毒尚未達到其最高的流行病潛力。

4.3 雙順反子中囊病病毒克隆的構(gòu)建

M ehmood[13]還構(gòu)建了一種模擬雙順反子病毒基因組結(jié)構(gòu)的雙順反子中囊病病毒克隆。BQCV的基因間區(qū)IR E S在克隆后整合到中囊病病毒基因組3’-端非編碼區(qū)之后，再接上E GF P基因與polyA區(qū)。轉(zhuǎn)錄后，將病毒RN A注射到蜜蜂幼蟲體內(nèi)，產(chǎn)生帶蛋白殼的克隆病毒，接種后的幼蟲表現(xiàn)出典型的中囊病癥狀和E GF P熒光。該研究首次成功構(gòu)建了雙順反子中囊病病毒克隆，有助于更好地理解中囊病病毒的反向遺傳學(xué)、致病機理以及傳染機制，也為其他軟腐病毒的研究提供了借鑒。

4.4 中囊病的防控

錦州醫(yī)科大學(xué)張鶴[14]以純化的中華蜜蜂囊狀幼蟲病毒（CSBV） 免疫BA L B/c小鼠，制備抗CSBV單克隆抗體，并對其效價、特異性和病毒中和能力進行檢測。在此基礎(chǔ)上，用制備的抗CSBV單克隆抗體作為診斷抗體，建立了一種檢測CSBV的瓊脂擴散檢測方法。F ei等[15]通過酵母雙雜交系統(tǒng)實驗發(fā)現(xiàn)，蜜蜂G alectin蛋白可與中蜂囊狀幼蟲病毒VP3蛋白結(jié)合，參與了宿主與病原的作用過程。Sun等[16]將滅活中蜂囊狀幼蟲病毒接種母雞，獲得卵黃抗體，對感染CSBV蜂群的治愈率達到95%～100%。該研究表明卵黃抗體可用于中囊病的治療和預(yù)防。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院吳鵬杰[17]克隆和原核表達CSBV結(jié)構(gòu)蛋白VP1，獲得了大量VP1重組蛋白及最佳表達條件，為后期免疫組化檢測CSBV病毒及構(gòu)建CSBV的侵染性克隆提供了特異性抗體。同時，對響應(yīng)CSBV的2個免疫相關(guān)基因S R P9和G ABA R AP進行了分子克隆、生物信息分析和原核表達研究，為從分子水平上預(yù)防和治療CSBV病毒奠定基礎(chǔ)。

5 結(jié)語

養(yǎng)蜂業(yè)是我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要組成部分，但近年來蜜蜂病害對養(yǎng)蜂業(yè)造成了較大影響。隨著近年來蜜蜂病毒的廣泛流行與傳播，病毒病及病毒與狄斯瓦螨的協(xié)同作用對蜜蜂健康的影響越顯突出。而病毒病的防控涉及消除病原、切斷傳播途徑、減少與病毒協(xié)同作用的因素、提高蜜蜂抗病力等環(huán)節(jié)，是一個系統(tǒng)工程。當(dāng)前，蜜蜂病毒學(xué)基礎(chǔ)與應(yīng)用研究都還很薄弱，有待進一步加強研究，并將研究結(jié)果與生產(chǎn)應(yīng)用相結(jié)合，改善蜜蜂健康形勢，為養(yǎng)蜂業(yè)健康發(fā)展保駕護航。