EGFR突變和擴(kuò)增與Ⅰ/Ⅱ期非小細(xì)胞肺癌根治術(shù)預(yù)后的相關(guān)性研究

丁光貴,萬 軍,任康奇,王 正

(暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院深圳市人民醫(yī)院胸外科，廣東深圳 518020)

非小細(xì)胞肺癌(non- small cell lung cancer,NSCLC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率、病死率位居世界惡性腫瘤第1位[1- 2]。目前，對(duì)于Ⅰ/Ⅱ期NSCLC的臨床治療方式仍是以手術(shù)根治為主，但在進(jìn)行根治術(shù)后仍存在一定比例復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。目前臨床上缺乏Ⅰ/Ⅱ期NSCLC根治術(shù)后預(yù)后預(yù)測(cè)的指標(biāo)，現(xiàn)今腫瘤大小、TNM分期、分化程度等指標(biāo)雖然可作為Ⅰ/Ⅱ期NSCLC術(shù)后預(yù)測(cè)的指標(biāo)，但都存在靈敏度差、特異度不高等缺點(diǎn)。

NSCLC的發(fā)生、發(fā)展與表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)相關(guān)信號(hào)通路的激活存在密切關(guān)系[3]。EGFR基因突變已經(jīng)被作為EGFR- 酪氨酸激酶抑制劑(TKIs)的作用靶點(diǎn)，廣泛用于晚期NSCLC的檢測(cè)中[4]，但其對(duì)于早期NSCLC的臨床意義和價(jià)值尚缺乏研究支持。同時(shí)，EGFR基因擴(kuò)增也與NSCLC的發(fā)生、發(fā)展有著重要的關(guān)聯(lián)。Ⅱ/Ⅲ期臨床研究中發(fā)現(xiàn)，EGFR- TKIs類藥物對(duì)于EGFR擴(kuò)增患者治療效果更好[5]。但目前對(duì)于EGFR突變和擴(kuò)增與Ⅰ/Ⅱ期NSCLC患者根治術(shù)后預(yù)后的相關(guān)性研究報(bào)道較少。本研究將無進(jìn)展生存期(progress free survival,PFS)作為重點(diǎn)研究對(duì)象，研究EGFR基因突變、擴(kuò)增與Ⅰ/Ⅱ期NSCLC患者的臨床特性及術(shù)后預(yù)測(cè)價(jià)值相關(guān)性，為制訂合理有效的臨床治療方案和預(yù)后的評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究對(duì)象為2013年8月至2017年5月在本院接受根治術(shù)的208例Ⅰ/Ⅱ期NSCLC患者。根據(jù)WHO(2015年)肺腫瘤組織學(xué)分型[6- 7]進(jìn)行病理分型，根據(jù)第8版TNM腫瘤學(xué)分類[8]標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床分期。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)男女不限；(2)臨床檢驗(yàn)判定為NSCLC；(3)TNM分期為Ⅰ、Ⅱ期，并進(jìn)行手術(shù)根治；(4)既往無腫瘤病史；(5)入院前未接受抗腫瘤的相關(guān)治療；(6)記錄有詳細(xì)的治療信息，且信息可靠。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)臨床檢驗(yàn)判定為小細(xì)胞肺癌；(2)合并其他腫瘤患者；(3)失訪患者；(4)TNM分期非Ⅰ、Ⅱ期患者；(5)未進(jìn)行根治術(shù)治療?；颊叩呐R床資料記錄包括性別、年齡、病理類型、吸煙情況、TNM分期、EGFR突變情況、治療情況等。PFS定義為治療第1天起至疾病發(fā)生進(jìn)展的時(shí)間，以月為單位，進(jìn)行24個(gè)月隨訪。本研究已經(jīng)過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者對(duì)研究知情并簽署知情同意書。

1.2主要試劑與儀器 DNA引物、DNA提取試劑盒(貨號(hào)97030196)、探針購自廣州英韋創(chuàng)津生物科技有限公司；EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)TB002)購自北京雅康博生物科技有限公司；EGFR抑制劑蛋白酶K(貨號(hào)P6556)購自美國Sigma- Aldrich公司；PCR儀(型號(hào)T100)購自美國Bio- Rad公司；NanoDrop1000分光光度計(jì)(型號(hào)722)購自美國Thermo Fisher Scientific公司；熒光原位雜交法(fluoresce in situ hybridization,FISH)檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)F01014)購自北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司。

1.3方法

1.3.1突變擴(kuò)增系統(tǒng)(amplification refractory mutation system,ARMS)PCR使用DNA提取試劑盒提取患者組織切片中的DNA，按照說明書進(jìn)行操作：往組織切片樣品加入適量細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解，用酚氯仿法提取DNA，再用75%乙醇對(duì)提取的DNA進(jìn)行純化，測(cè)定所提取DNA的濃度和純度后用ARMS在熒光定量PCR儀中檢測(cè)EGFR基因第18～21號(hào)外顯子的突變情況，根據(jù)擴(kuò)增曲線判斷樣品的基因突變情況。

1.3.2FISH檢測(cè) 將患者的組織切片進(jìn)行FISH檢測(cè)。按照說明書進(jìn)行操作：將組織切片進(jìn)行脫蠟預(yù)處理，加入適量蛋白酶K消化后進(jìn)行變性雜交，洗滌干凈后進(jìn)行復(fù)染色，顯微鏡下判斷檢測(cè)結(jié)果，對(duì)細(xì)胞(100個(gè)以上)的紅綠信號(hào)進(jìn)行計(jì)數(shù)，紅色信號(hào)與綠色信號(hào)比值大于2∶1時(shí)提示EGFR基因擴(kuò)增。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，Kaplan- Meier法計(jì)算PFS，組間比較采用Log- rank檢驗(yàn)，多變量Cox模型計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)比(HR)及其95%置信區(qū)間(95%CI),用Graphpad Prism7.05軟件分析并制作生存曲線。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1納入患者臨床信息 本研究共納入208例Ⅰ/Ⅱ期NSCLC患者的相關(guān)信息，其中男126例(60.6%)，女82例(39.4%)?；颊叩闹形荒挲g為59.4(27.0，89.0)歲，Ⅰ期患者134例(64.4%)，Ⅱ期患者74例(35.6%)；曾經(jīng)或現(xiàn)在吸煙的患者73例(35.1%)，不吸煙患者135例(64.9%)。

2.2EGFR基因突變與NSCLC臨床特征的關(guān)系 共檢出EGFR基因突變87例，突變率為41.8%(87/208)。87例EGFR基因突變型患者中36例(41.3%)為19號(hào)外顯子缺失，43例(49.4%)為21號(hào)外顯子的L585存在突變，此外20號(hào)外顯子G719X、L861Q和20號(hào)外顯子短片段插入各2例，20號(hào)外顯子的S768I存在1例突變，還有1例存在20號(hào)外顯子的T790M和21號(hào)外顯子的L858R聯(lián)合突變。EGFR基因突變型患者與野生型患者在年齡、臨床分期(Ⅰ/Ⅱ期)和病理類型方面比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與EGFR基因野生型患者相比，EGFR基因突變型患者中女性和不吸煙患者比例顯著升高(P<0.05)，見表1。

表1 EGFR基因突變型和野生型患者的臨床特征 比較分析[n(%)]

續(xù)表1 EGFR基因突變型和野生型患者的臨床特征 比較分析[n(%)]

2.3EGFR突變情況與預(yù)后相關(guān)性分析 TNM Ⅰ/Ⅱ期NSCLC患者根治術(shù)后，對(duì)患者隨訪并進(jìn)行生存統(tǒng)計(jì)。87例EGFR基因突變型患者中有9例復(fù)發(fā)，其中Ⅰ期患者7例，Ⅱ期患者2例；78例EGFR基因突變型患者在術(shù)后24個(gè)月無疾病進(jìn)展，其中Ⅰ期患者52例，Ⅱ期患者26例。121例EGFR基因野生型患者中有32例復(fù)發(fā)，其中Ⅰ期患者20例，Ⅱ期患者12例；89例EGFR基因野生型患者在術(shù)后24個(gè)月無疾病進(jìn)展，其中Ⅰ期患者55例，Ⅱ期患者34例。EGFR基因突變型患者的PFS長于野生型患者(P=0.002 7)，見圖1A。Ⅰ期、Ⅱ期EGFR基因突變型患者的PFS均長于野生型患者，見圖1B、C。

2.4影響PFS的因素分析 通過Cox模型分析了年齡、性別、吸煙情況、EGFR基因是否突變等多個(gè)因素對(duì)PFS的影響。分析結(jié)果顯示，上述多個(gè)因素均對(duì)PFS無影響，只有EGFR基因突變是影響PFS的獨(dú)立因素(P=0.024)，見表2。

A：TNM Ⅰ/Ⅱ期EGFR基因突變型患者與野生型患者的PFS比較(P=0.002 7)；B:TNM Ⅰ期EGFR基因突變型患者與野生型患者的PFS比較(P=0.026 5)；C:TNM Ⅱ期EGFR基因突變型患者與野生型患者的PFS比較(P=0.039 5)

圖1EGFR基因突變型和野生型NSCLC患者生存分析

表2 TNM Ⅰ/Ⅱ期NSCLC患者的PFS因素影響分析

2.5EGFR基因 FISH檢測(cè)結(jié)果與NSCLC臨床特征的關(guān)系 208例Ⅰ/Ⅱ期NSCLC患者中，EGFR基因FISH檢測(cè)陽性為98例，占比47.1%。其中，男性EGFR基因FISH檢測(cè)陽性率為46.8%，女性為47.6%，二者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；不同年齡組中，<60歲的患者EGFR基因FISH檢測(cè)陽性率為43.3%，≥60歲的患者為50.5%，二者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；不同吸煙狀況比較，無吸煙史患者EGFR基因FISH檢測(cè)陽性率為45.9%，曾經(jīng)或現(xiàn)在吸煙患者為49.3%，二者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；Ⅰ期患者EGFR基因FISH檢測(cè)陽性率為44.8%，Ⅱ期為51.4%，二者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 EGFR基因FISH檢測(cè)結(jié)果與臨床特征比較分析

2.6EGFR基因FISH檢測(cè)結(jié)果與預(yù)后的相關(guān)性分析 對(duì)采取根治術(shù)后Ⅰ/Ⅱ期NSCLC患者進(jìn)行隨訪和生存統(tǒng)計(jì)。98例FISH檢測(cè)陽性患者中有26例(26.5%)患者發(fā)生復(fù)發(fā)，72例(73.5%)患者在術(shù)后無疾病進(jìn)展。110例FISH檢測(cè)陰性患者中有15例(13.6%)患者發(fā)生復(fù)發(fā)，95例(86.4%)患者在術(shù)后無疾病進(jìn)展。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與FISH檢測(cè)陽性患者比較，F(xiàn)ISH檢測(cè)陰性患者的PFS顯著延長(P=0.011 2)。見圖2。

圖2 EGFR基因FISH檢測(cè)陽性與陰性患者PFS比較

2.7EGFR基因突變與FISH檢測(cè)結(jié)果之間的關(guān)系 208例Ⅰ/Ⅱ期NSCLC患者組織中，EGFR突變患者FISH檢測(cè)陽性率更高(P<0.05)，見表4。

表4 EGFR基因突變與FISH檢測(cè)結(jié)果之間關(guān)系(n)

3 討 論

EGFR基因位于第7號(hào)染色體，共有28個(gè)外顯子。突變主要發(fā)生在18～21號(hào)外顯子，其中19和21號(hào)外顯子突變更為重要[9]。研究表明，亞洲患者的EGFR突變率顯著高于西方患者[10]，女性患者EGFR突變率顯著高于男性患者，不吸煙患者的EGFR突變率顯著高于吸煙患者[11- 12]。本研究發(fā)現(xiàn)EGFR在Ⅰ/Ⅱ期NSCLC患者中的突變率為41.8%，男性患者(30.2%)的EGFR突變率顯著低于女性患者(59.8 %)，吸煙史患者的EGFR突變率(19.2%)顯著低于不吸煙患者(54.1%)，這與以前研究報(bào)道的結(jié)果基本一致[13]。

目前已有部分臨床特性被發(fā)現(xiàn)與NSCLC的預(yù)后有關(guān)，例如：TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、貧血、年齡、吸煙等[14- 15]。但這些預(yù)后因素的特異性不高、敏感性差，同組患者個(gè)體差異大。除上述臨床指標(biāo)外，一些腫瘤分子標(biāo)記物也被發(fā)現(xiàn)與預(yù)后相關(guān)。例如白細(xì)胞介素- 17(interleukin- 17，IL- 17)[16]、IL- 2[17]、C反應(yīng)蛋白(C- reactive protein，CRP)[18]和腫瘤標(biāo)記物癌胚抗原(CEA)[19]等，但仍存在特異性和敏感性不足的缺點(diǎn)。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，EGFR基因作為NSCLC的主要驅(qū)動(dòng)基因成為研究的熱點(diǎn)[20]。研究表明，NSCLC患者的總生存期(OS)延長與EGFR基因第19號(hào)外顯子缺失突變存在相關(guān)性[21]，提示EGFR敏感型突變與NSCLC患者的預(yù)后存在相關(guān)性。

目前EGFR基因敏感型突變與NSCLC預(yù)后相關(guān)研究主要集中在中晚期NSCLC患者，但在TNM Ⅰ/Ⅱ期NSCLC患者預(yù)后中研究較少。既往對(duì)Ⅰ期NSCLC患者研究發(fā)現(xiàn)，與EGFR基因野生型患者比較，EGFR突變型患者的復(fù)發(fā)率更低，5年無病生存期(DFS)和OS更長，這表明EGFR突變可作為Ⅰ期NSCLC患者的預(yù)后預(yù)測(cè)指標(biāo)[22]。還有研究對(duì)TNM Ⅰ期根治術(shù)后的NSCLC患者隨訪發(fā)現(xiàn)，EGFR基因突變型患者的OS和DFS要顯著高于野生型患者[23]。本研究通過對(duì)208例根治術(shù)后的Ⅰ/Ⅱ期NSCLC患者EGFR突變情況及PFS的分析來研究EGFR突變?cè)冖?Ⅱ期NSCLC根治術(shù)后預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值和臨床意義。研究發(fā)現(xiàn)，EGFR基因突變型患者的PFS高于野生型患者，這與既往研究結(jié)果基本一致，不同之處在于本研究的研究對(duì)象包含了74例Ⅱ期NSCLC，而在Ⅱ期患者中也發(fā)現(xiàn)EGFR基因突變的患者具有更長的PFS。同時(shí)，Cox模型分析顯示，EGFR突變是影響PFS的獨(dú)立因素，這與以往的研究結(jié)果也是相一致的[23]。

有研究發(fā)現(xiàn)，EGFR擴(kuò)增情況能夠用于預(yù)測(cè)EGFR- TKIs藥物吉非替尼的療效，Ⅱ/Ⅲ期患者應(yīng)用EGFR- TKIs類藥物可顯著延長生存期[5]。由此可見，EGFR基因擴(kuò)增也是影響NSCLC患者預(yù)后的重要指標(biāo)，但目前缺乏EGFR擴(kuò)增與Ⅰ/Ⅱ期NSCLC患者預(yù)后的相關(guān)性研究。在本研究中，EGFR基因FISH檢測(cè)結(jié)果與患者的年齡、性別、吸煙情況、臨床分期不相關(guān)(P>0.05)。在EGFR突變患者中73.6%(64/87)FISH檢測(cè)陽性，在FISH檢測(cè)陽性患者中65.3%(64/98)EGFR突變，二者存在相關(guān)性。本研究還發(fā)現(xiàn)EGFR基因FISH檢測(cè)陰性患者比EGFR基因FISH檢測(cè)陽性患者PFS更長。

本研究屬于回顧性分析，存在納入研究的病例數(shù)較少，隨訪時(shí)間較短等局限，需更多研究關(guān)注到EGFR基因突變、擴(kuò)增與NSCLC根治術(shù)預(yù)后方面，為NSCLC中EGFR基因突變、基因擴(kuò)增應(yīng)用于臨床指導(dǎo)提供更多可靠的依據(jù)。