基于靜電紡絲人臍帶華通膠構(gòu)建組織工程軟骨的實(shí)驗(yàn)研究

李豪 徐勇 夏會(huì)堂 周廣東 姜格寧 李承德

由于體內(nèi)軟骨再生能力有限，使得創(chuàng)傷、腫瘤等引起的軟骨缺損成為臨床治療中的難題[1]。近年來，組織工程技術(shù)的興起為軟骨缺損的修復(fù)帶來了新的希望[2]。組織工程主要包括三大要素：支架材料、種子細(xì)胞和生長(zhǎng)因子。缺乏理想的支架材料是組織工程發(fā)展亟待解決的難點(diǎn)[3]。

天然材料具有生物相容性優(yōu)良，細(xì)胞毒性小，成分接近天然軟骨等優(yōu)點(diǎn)。軟骨細(xì)胞外基質(zhì)來源的支架基質(zhì)成分及其比例，與天然軟骨更為接近。但人源性軟骨細(xì)胞外基質(zhì)來源有限，且其結(jié)構(gòu)致密不利于脫細(xì)胞處理，嚴(yán)重限制了組織工程軟骨的應(yīng)用與發(fā)展[4]。

研究發(fā)現(xiàn)，臍帶華通膠富含膠原、透明質(zhì)酸和糖胺聚糖等成分，且無血管分布、神經(jīng)支配和淋巴回流。此外，華通膠保護(hù)臍帶血管，防止其受外力擠壓，從而保障了正常的臍帶血運(yùn)。該作用與關(guān)節(jié)軟骨緩沖受力，減少變形、損傷及摩擦的作用相似。由此可見，華通膠在成分、結(jié)構(gòu)、功能上均與軟骨組織非常類似。此外，臍帶華通膠還具有以下特點(diǎn)：①可支持華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖，故也可能支持其他干細(xì)胞增殖；②華通膠中透明質(zhì)酸廣泛表達(dá)CD44 受體，而軟骨細(xì)胞也表達(dá)CD44，使得軟骨細(xì)胞能很好地黏附在華通膠上；③華通膠是多肽生長(zhǎng)因子儲(chǔ)存庫(kù)，這些生長(zhǎng)因子有利于細(xì)胞的增殖分化及細(xì)胞外基質(zhì)的重塑；④臍帶是分娩廢棄物，不涉及倫理問題，來源豐富。因此，華通膠被認(rèn)為是軟骨組織工程支架材料的理想來源[5-7]。

本研究將臍帶華通膠混合聚己內(nèi)酯（Polycaprolactone，PCL）進(jìn)行靜電紡絲，以形成具有一定力學(xué)強(qiáng)度和孔隙率的納米纖維膜，并將該膜復(fù)合軟骨細(xì)胞后植入裸鼠皮下，擬在裸鼠體內(nèi)培養(yǎng)6 周，以期能成功構(gòu)建較成熟的組織工程軟骨組織。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

胰蛋白酶、高糖DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素-兩性霉素B、磷酸鹽緩沖液（Hyclone 公司，美國(guó)）；DNA 含量檢測(cè)試劑盒（天根生化科技有限公司），總膠原蛋白檢測(cè)試劑盒（北京博蕾德生物科技有限公司），透明質(zhì)酸染色試劑盒（北京雷根生物科技有限公司）。

磁力攪拌器（鞏義予華儀器有限責(zé)任公司）；精確微量注射泵（LSP01-1A，保定市蘭格恒流泵有限公司）；靜電紡絲儀器（KDS-100 型，美國(guó)Le-Parmer公司）；靜電紡絲高壓電源（天津市東文高壓電源廠）；真空冷凍干燥儀（上海實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司）；場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（S-4800 型，日本JEOL 公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6 周齡新西蘭白兔10 只（上海甲干生物科技有限公司），雌雄不限；5 只BALC/c 裸鼠，雌雄不限。本實(shí)驗(yàn)遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理原則。

1.3 制備脫細(xì)胞的人臍帶華通膠

在不違反醫(yī)學(xué)倫理的情況下，收集新鮮健康的人臍帶。無菌條件下，去除臍帶內(nèi)的動(dòng)靜脈，剝除臍帶外面的膜，可獲取膠凍樣組織。把獲得的華通膠置于1 N NaOH 溶液中，室溫條件下脫細(xì)胞處理4 h，冰醋酸調(diào)節(jié)pH 值至7.0 備用。

1.4 生物化學(xué)檢測(cè)

將樣品（脫細(xì)胞前后標(biāo)本）置于木瓜蛋白酶溶液（Sigma-Aldrich）中于65 ℃消化12 h。乙醇提取和吸附柱吸附后，在洗脫緩沖液中回收基因組DNA。用核酸蛋白質(zhì)定量檢測(cè)器（Nanodrop 2000）檢測(cè)DNA含量。用羥脯氨酸測(cè)定法檢測(cè)總膠原含量。通過堿水解制備樣品，根據(jù)先前描述的方法測(cè)定游離羥脯氨酸水解產(chǎn)物。以上所有樣品的分析重復(fù)3 次。

1.5 制備粉末狀人臍帶華通膠

將上述脫細(xì)胞后的華通膠加入勻漿機(jī)內(nèi)，然后加入5 倍體積的無菌三蒸水，4 ℃下充分?jǐn)嚢璺鬯?，即可制成華通膠勻漿。將勻漿放入-20 ℃冰箱冷凍過夜，再放入真空冷凍干燥箱中干燥48 h 后與胃蛋白酶按1:50 質(zhì)量比混合，溶于0.5 mol 醋酸溶液（pH 2.8～3.0），放入37 ℃搖床48 h；將溶液放入離心機(jī)，4 ℃、3 500 r/min 離心5 min，收集上清液于新的離心管中，緩慢滴加NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 到7 左右。將溶液-20 ℃冰箱冷凍過夜，再放入真空冷凍干燥箱中干燥48 h，得到華通膠粉末。

1.6 靜電紡絲

秤取等質(zhì)量的華通膠粉末與PCL 粉劑溶于六氟異丙醇，調(diào)節(jié)質(zhì)量體積比為12%，配置華通膠/PCL溶液。將該溶液置于精確微量注射泵中，連接靜電紡絲儀器，接通靜電紡絲高壓電源。調(diào)整靜電紡絲參數(shù)：電壓15 KV，推進(jìn)速度0.6 mL/h，接收距離15 cm，室溫25 ℃，環(huán)境濕度40%～50%；進(jìn)行混合靜電紡絲，以鋁箔接收。將上述所得靜電紡絲置入含有25%戊二醛蒸汽的密閉容器皿中熏蒸30 min，以達(dá)到充分交聯(lián)，最終真空凍干24 h 取出備用。

1.7 大體和微觀形貌表征

將納米纖維電紡膜裁減為直徑1 cm 的圓片，以觀察大體形態(tài)。將該納米纖維電紡膜噴金后，掃描電鏡觀察其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及納米纖維排布情況。

1.8 原代軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)及擴(kuò)增

無菌條件下取2 月齡新西蘭兔的耳軟骨，用眼科剪將軟骨塊剪至極小塊，加入Ⅱ型膠原酶，用吸管充分吹打混勻后，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中消化8 h；加入8 mL 的H-DMEM 培養(yǎng)液（含10% FBS，下同）終止消化，充分吹打混勻后收集至15 mL 的離心管中，以1 800 r/min 離心5 min，棄上清，加7 mL 培養(yǎng)液，充分吹打混勻，取混懸液，分裝至培養(yǎng)瓶中，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24 h 后進(jìn)行首次換液，此后隔日換液。顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)面積達(dá)到培養(yǎng)瓶底部的70%～80%后，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取第2 代細(xì)胞備用。

天理圖書館收藏17號(hào)敦煌寫卷，主要來自李盛鐸、許承堯、張大千等舊藏，其中張大千舊藏構(gòu)成了天理圖書館藏品的主體。這批文獻(xiàn)的主要內(nèi)容是漢文佛典，還有藏文、回鶻文等佛教、道教經(jīng)典，以及論語、詩經(jīng)、開蒙要訓(xùn)、社司轉(zhuǎn)帖、本草等殘卷等。除寫本外，該館還藏有大谷探險(xiǎn)隊(duì)帶回的敦煌紙本繪畫“玄奘三藏像”，但入藏途徑尚未明。

1.9 納米纖維膜的細(xì)胞相容性

將第2 代軟骨細(xì)胞制備成1.0×105cells/mL 的細(xì)胞混懸液，均勻接種于支架上，37 ℃、5%CO2、飽和濕度下放置4 h，隨后加入8 mL 的H-DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)，隔日換液。分別于體外培養(yǎng)的第1、5、9 天進(jìn)行活死細(xì)胞染色和CCK-8 定量檢測(cè)，檢測(cè)方法參照試劑盒說明書。

1.10 軟骨細(xì)胞-纖維膜復(fù)合物體內(nèi)培養(yǎng)

將第2 代軟骨細(xì)胞制備成1.0×108cells/mL 的細(xì)胞混懸液，均勻接種于支架上。采用“三明治”模型將軟骨細(xì)胞-纖維膜疊加4 層，于37 ℃、5%CO2、飽和濕度下放置4 h。5 只BACL/c 裸鼠麻醉后，將4 層結(jié)構(gòu)的軟骨細(xì)胞-纖維膜復(fù)合物植入背部腔隙中，縫合傷口。術(shù)后分籠飼養(yǎng)，自由活動(dòng)。于術(shù)后6 周取材檢測(cè)。

1.11 組織學(xué)檢測(cè)

大體觀察脫細(xì)胞前后的標(biāo)本和體內(nèi)培養(yǎng)6 周的標(biāo)本，然后將標(biāo)本以4%多聚甲醛固定24 h，脫水、石蠟包埋、切片（厚度為5 μm）。分別行透明質(zhì)酸和天狼猩紅染色，觀察華通膠是否富含透明質(zhì)酸成分和膠原成分；HE 染色及Safranin-O 染色，觀察組織結(jié)構(gòu)及細(xì)胞外基質(zhì)分泌情況。免疫組化檢測(cè)Ⅱ型膠原的表達(dá)情況，進(jìn)一步證明構(gòu)建組織的軟骨表型。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 軟件（Version 5.00，Graph-Pad Software，美國(guó)），數(shù)據(jù)以（）表示，組間比較采用非配對(duì)t 檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人臍帶華通膠成分

臍帶是胎兒和胎盤之間的連系結(jié)構(gòu)，形狀如繩索，表面光滑透明，內(nèi)含結(jié)締組織和1 支臍靜脈、2根臍動(dòng)脈（圖1a）。Safranin-O 染色顯示華通膠富含GAG 成分（圖1b）；透明質(zhì)酸染色顯示華通膠富含透明質(zhì)酸成分（圖1c）；天狼猩紅染色顯示華通膠富含膠原成分（圖1d）。

圖1 人臍帶大體觀察和華通膠組織學(xué)觀察Fig.1 Gross observation of human umbilical cord and histological observation of human Wharton's jelly

2.2 人臍帶華通膠基質(zhì)脫細(xì)胞處理

剪碎后的華通膠基質(zhì)呈白色膠凍樣（圖2a），經(jīng)脫細(xì)胞處理后，華通膠基質(zhì)大體形狀基本不變，色澤變?yōu)闇\黃色（圖2b）。DNA 定量檢測(cè)顯示，脫細(xì)胞后DNA 含量比脫細(xì)胞前明顯減少，證實(shí)細(xì)胞成分基本去除（圖3c）。同時(shí)，膠原含量檢測(cè)顯示脫細(xì)胞后膠原成分略有下降（圖2d）。

圖2 人臍帶華通膠脫細(xì)胞前后對(duì)比Fig.2 Comparison of Wharton's jelly before and after decellularization

2.3 靜電紡絲

圖3 靜電紡絲Fig.3 Electrospun

2.4 細(xì)胞相容性

軟骨細(xì)胞接種于纖維膜后，活死細(xì)胞染色顯示細(xì)胞可以黏附、存活，并且穩(wěn)定增殖（圖4a）。CCK-8細(xì)胞增殖曲線結(jié)果顯示細(xì)胞可穩(wěn)定增殖（圖4b）。

圖4 靜電紡絲纖維膜的細(xì)胞相容性Fig.4 Biocompatibility of electrospinning membrane with chondrocytes

2.5 體內(nèi)軟骨再生

裸鼠皮下培養(yǎng)6 周后的組織學(xué)顯示，在纖維膜之間有大量軟骨細(xì)胞外基質(zhì)和特異性軟骨陷窩形成，并且纖維膜有一定程度的降解（圖5a、b）。Ⅱ型膠原免疫組化證實(shí)新生組織為軟骨組織（圖5c）。

圖5 體內(nèi)軟骨再生Fig.5 Cartilage regeneration in vivo

3 討論

軟骨損傷在臨床較為常見，但軟骨自我修復(fù)能力有限，而目前的一些傳統(tǒng)方法尚無法獲得滿意的治療效果。應(yīng)用組織工程技術(shù)構(gòu)建組織工程軟骨被認(rèn)為是目前較有前景的治療手段。但迄今為止，構(gòu)建的組織工程軟骨仍無法真正地應(yīng)用于臨床治療。

理想的支架材料是制約軟骨組織工程臨床轉(zhuǎn)化的核心難點(diǎn)。理想的支架材料應(yīng)該最大程度模仿軟骨細(xì)胞外基質(zhì)[8-9]。因此，同種異體軟骨脫細(xì)胞處理的軟骨細(xì)胞外基質(zhì)被認(rèn)為是組織工程最佳的成分仿生軟骨組織工程支架材料。但是，由于來源受限，且結(jié)構(gòu)致密不利于脫細(xì)胞處理以去除其免疫原性，一定程度影響了其臨床應(yīng)用。

人臍帶華通膠富含透明質(zhì)酸、糖胺多糖及膠原等，還包含很多生長(zhǎng)因子，諸如胰島素生長(zhǎng)因子、堿性成纖維生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β、血小板生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子和其他細(xì)胞外基質(zhì)蛋白。這些生長(zhǎng)因子和細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM）蛋白為種子細(xì)胞提供結(jié)構(gòu)支撐，促進(jìn)其黏附、增殖，還能提供保持細(xì)胞表型的微環(huán)境。人臍帶華通膠成分與天然軟骨ECM 類似，而且人臍帶華通膠來源的間充質(zhì)干細(xì)胞具有向軟骨細(xì)胞分化的能力[10]。研究發(fā)現(xiàn)，臍帶和軟骨組織有許多相似之處：組織內(nèi)無毛細(xì)血管，營(yíng)養(yǎng)獲得來源于組織滲透；基質(zhì)中含有大量GAG、膠原及透明質(zhì)酸成分，這與本研究結(jié)果一致。因此，可以推測(cè)人臍帶細(xì)胞外基質(zhì)和人軟骨ECM 一樣，能很好地促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖和細(xì)胞表型的維持。本研究通過NaOH 溶液對(duì)臍帶華通膠進(jìn)行脫細(xì)胞處理，結(jié)果顯示，在保證去除絕大部分DNA 的情況下，保留了大量的膠原成分，可作為軟骨再生的支架材料[11]。

我們的前期研究表明，華通膠的力學(xué)性能較弱（經(jīng)過脫細(xì)胞處理后力學(xué)性能變得更弱），且降解速度過快，與軟骨基質(zhì)生長(zhǎng)速度不匹配。PCL 是最常用的合成材料之一，已被FDA 批準(zhǔn)在臨床中運(yùn)用[12-13]。PCL 具有機(jī)械性能強(qiáng)、降解慢、生物相容差的特點(diǎn)。因此，PCL 與華通膠混合后可取長(zhǎng)補(bǔ)短，最大限度發(fā)揮各自的優(yōu)點(diǎn)。

靜電紡絲納米纖維具有以下特點(diǎn)：①與天然軟骨ECM 相近的微觀構(gòu)造，使制備的支架能夠仿生天然ECM 的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)；②極高的比表面積，為活性因子的有效釋放提供了理想平臺(tái)；③簡(jiǎn)便快捷、成本低廉、結(jié)構(gòu)可控。因此，靜電紡絲納米纖維被認(rèn)為是理想的組織工程支架材料。本研究采用華通膠與PCL混合后進(jìn)行靜電紡絲，制成的混合纖維膜結(jié)構(gòu)上更加接近天然ECM，更有利于種子細(xì)胞的黏附、增殖及分化[14-16]。

理想的軟骨組織工程支架材料應(yīng)該具有良好的細(xì)胞相容性，并且能支持軟骨再生。本研究將軟骨細(xì)胞接種于華通膠/PCL 靜電紡絲纖維膜，體外活死細(xì)胞染色及CCK-8 細(xì)胞增殖曲線均證實(shí)該纖維膜具有良好的細(xì)胞相容性，能夠支持軟骨細(xì)胞的黏附、生長(zhǎng)及增殖。將軟骨細(xì)胞-纖維膜復(fù)合物植入裸鼠皮下6 周后，組織學(xué)證實(shí)可再生出典型的軟骨組織。以上結(jié)果均證實(shí)華通膠/PCL 靜電紡絲纖維膜適合作為組織工程軟骨再生的支架材料。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)制備的華通膠/PCL 靜電紡絲纖維膜免疫原性低、無細(xì)胞毒性作用，有細(xì)胞生長(zhǎng)需要的糖胺聚糖、膠原和生長(zhǎng)因子等成分，能夠很好地促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖。此外，由于華通膠屬于臍帶的廢棄物，來源廣泛，操作簡(jiǎn)便，而且不存在倫理學(xué)問題，因此是一種理想的軟骨組織工程支架材料來源。下一步我們將應(yīng)用該纖維膜對(duì)軟骨缺損進(jìn)行修復(fù)，以期探索其功能性修復(fù)軟骨缺損的可行性。