過氧化氫在茉莉酸甲酯抑制擬南芥根生長中的作用研究

焦嬋，師彥潔

(河南開封大學(xué)，河南 開封 475000)

茉莉酸(JA)及茉莉酸甲酯(MeJA)是亞麻酸衍生的具有環(huán)戊酮基團(tuán)的化合物。茉莉酸廣泛分布于植物果實(shí)、花、種子、苗、胚芽、葉、莖、根尖等部位。大量的研究表明，茉莉酸類物質(zhì)對植物生長有廣泛的生理作用，歸納起來包括促進(jìn)，抑制和誘導(dǎo)三個(gè)方面，促進(jìn)呼吸作用、乙烯生物合成、氣孔關(guān)閉、葉片脫落、過氧化氫酶活性等，抑制根的生長、幼苗生長、光合作用、種子花粉萌發(fā)等，誘導(dǎo)逆境蛋白、蛋白酶抑制劑、苯丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶等。并且發(fā)現(xiàn)茉莉酸類物質(zhì)有類似脫落酸的效用，即在生理功能和代謝過程中起到激素的作用。研究表明，茉莉酸(酯)類物質(zhì)可以作為內(nèi)源信號分子與植物抗性密切相關(guān)，當(dāng)植物受到機(jī)械傷害、干旱、低溫、病蟲害、低溫等逆境時(shí)，植物體內(nèi)的茉莉酸類化合物含量會(huì)迅速增加，進(jìn)而誘導(dǎo)一系列與抗逆有關(guān)的基因表達(dá)，如苯丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、蛋白酶的抑制劑等，使未受到傷害的部位及時(shí)抵抗不良的環(huán)境。

Gorbineau等(1988)在研究JAMe對向日葵種子萌發(fā)和幼苗生長的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)10-5-10-3mol/L的JAMe可以顯著的抑制初生根根長，而且濃度越高，抑制作用越大。Ravnikar等(1992)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，外用不同濃度的JA可對馬鈴薯根系產(chǎn)生不同的影響，濃度高于10 μmol/L會(huì)對根系生長產(chǎn)生明顯的抑制作用。劉或等試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),高濃度的M J處理，能使小麥根中過氧化物酶的活性提高，防止細(xì)胞壁的延伸,從而達(dá)到阻礙小麥生長的作用。

在光合生物產(chǎn)生氧氣的同時(shí)，活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)即作為副產(chǎn)物隨之出現(xiàn)。生物體內(nèi)的ROS包括超氧物陰離子(O2-)、H2O2、單線態(tài)氧(O21)及羥自由基(·OH)等,它們均具有較高的活性和毒性。正常情況下植物光合作用和呼吸作用產(chǎn)生的ROS水平較低，但很多脅迫包括干旱、鹽害、冷害、重金屬、紫外輻射、臭氧、機(jī)械傷害、營養(yǎng)缺乏、病原體入侵、高光強(qiáng)等均導(dǎo)致光合電子傳遞鏈及呼吸鏈產(chǎn)生過量ROS，還誘導(dǎo)NADPH氧化酶產(chǎn)生ROS，對細(xì)胞造成氧化毒害。H2O2是活性氧的一種，是細(xì)胞有氧代謝的產(chǎn)物。越來越多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，H2O2不僅具有損傷生物大分子產(chǎn)生細(xì)胞毒害性作用的能力，而且具有多種多樣的生理功能。光、環(huán)境脅迫和植物激素ABA可以引起植物體內(nèi)H2O2升高，而H2O2作為一個(gè)較早進(jìn)化出來的信號分子，不僅在誘導(dǎo)氧化性光合作用中起了關(guān)鍵的作用，并且可以調(diào)節(jié)諸如氣孔運(yùn)動(dòng)、超敏反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和基因表達(dá)等許多過程。細(xì)胞內(nèi)H2O2濃度必須維持在一種精細(xì)平衡狀態(tài),它一方面可以通過質(zhì)膜氧化還原系統(tǒng)和光呼吸系統(tǒng)產(chǎn)生，另一方面也存在完善的清除機(jī)制。總之,H2O2作為信號分子調(diào)控基因的表達(dá),是一個(gè)十分有趣而值得探討的問題。綜上,H2O2作為植物的第二信使,已成為逆境生物學(xué)研究的重要課題,并且它作為信號分子的研究工作已取得了很大的進(jìn)展。

植物擬南芥基因組存在10個(gè)NADPH氧化酶的同源基因,但是直到最近才證明這些基因在產(chǎn)生H2O2中的作用和功能，但其中只有C、D、F這3個(gè)基因在擬南芥根中表達(dá)，所以本實(shí)驗(yàn)借助于擬南芥這3個(gè)基因的突變體，研究MeJA在抑制根生長中的生物學(xué)機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 材料。野生型擬南芥(Arabidopsis thaliana)種子經(jīng)0.1 %升汞表面消毒5-6 min,用無菌水沖洗3-5次,將其點(diǎn)種于MS固體培養(yǎng)基上,用封口膜封好,在4 ℃下春化2-3天后,置于光照充足的培養(yǎng)室中.生長條件為:光/暗周期16/8 h，溫度18-23 ℃,相對濕度80 %左右,光照強(qiáng)度90 μmol·m-2·s-1,晝夜溫度分別為23±2 ℃，生長期間無任何脅迫。

1.2 MS培養(yǎng)基。(1)按比例從母液中吸取大量元素(50×)，微量元素(1000×)，鐵鹽(200×)，鈣鹽(50×)，有機(jī)物(100×)。(2)加入蔗糖(3%)。(3)調(diào)PH至6.0。(4)加入瓊脂粉(0.6%)或(1.2%)。(5)高溫高壓滅菌(121 ℃，15 min)。(6)在超凈工作臺(tái)上將適量的MS培養(yǎng)基倒入已滅菌的潔凈培養(yǎng)皿中。

1.3 不同濃度的JAMe處理。先配置MS固體培養(yǎng)基,在倒平板時(shí)分別向各個(gè)培養(yǎng)皿中加入不同濃度(0、0.5、5、50 μmol/L)的JAMe和無菌水(對照)，每個(gè)濃度各兩個(gè)平皿，然后將野生型擬南芥(wt)和3種擬南芥過氧化氫酶突變體(C、D、F)的種子分別整齊得點(diǎn)于各個(gè)不同濃度的培養(yǎng)皿中,然后用封口膜封好，在4 ℃下春化2-3天后，置于光照充足的培養(yǎng)室培養(yǎng)3天。

1.4 測量根長。對各個(gè)JAMe不同濃度的培養(yǎng)皿中擬南芥的根長進(jìn)行測量，并記錄相關(guān)數(shù)據(jù)，連續(xù)測量7天，然后對每個(gè)培養(yǎng)皿的相關(guān)數(shù)據(jù)求其平均值及平行實(shí)驗(yàn)中的方差，并做出圖表，比較不同濃度下根長的大小，進(jìn)一步得出實(shí)驗(yàn)結(jié)論。

1.5 DAB染色

DAB：二胺基聯(lián)苯胺

DAB溶液的配制：稱取100 mgDAB于避光的有色瓶中，利用已經(jīng)稀釋的HCL溶液調(diào)節(jié)PH至3.8或其以下，用玻璃棒不斷攪拌，在溶解過程中溶液的PH值不斷升高，所以需要不時(shí)地調(diào)節(jié)pH值，使其充分溶解。

染色過程：取適量DAB染液，用NaOH調(diào)節(jié)pH值至5.8，然后分裝于被錫箔紙包裹的EP管中，將擬南芥的幼苗放入其中，用錫箔紙包好后放置于28 ℃恒溫箱中，避光染色8 h。

脫色過程：吸去DAB染液，加入80 %的乙醇1 ml，放置于沸水中10 min

吸去液體，加入無水乙醇1 ml，放置于沸水中至葉片綠色完全脫去

吸去液體，加入無水乙醇1 ml，放置于4 ℃冰箱中保存

1.6 NBT染色

NBT：itroblue tetrazolium 氮藍(lán)四唑

NBT染液的配制：稱取1.1915 g Hepes，將其溶解于ddH2O中，定容至100 ml，然后調(diào)節(jié)pH值到7.6，用25 ml Hepes緩沖液(pH7.6)，并加入0.1 %TritonX-100配制成終濃度為0.1 mg/ml的溶液。

染色過程：取適量NBT染液，然后分裝于被錫箔紙包裹的EP管中，將擬南芥的幼苗放入其中，用錫箔紙包好后放置于28 ℃恒溫箱中，避光染色2 h。

脫色過程：吸去NBT染液，加入80 %的乙醇1 ml，放置于沸水中10 min

吸去液體，加入無水乙醇1 ml，放置于沸水中至葉片綠色完全脫去

吸去液體，加入無水乙醇1 ml，放置于4 ℃冰箱中保存

2 結(jié)果分析

2.1 不同濃度的茉莉酸甲酯對野生型擬南芥(wt)根生長的影響

由圖1可明顯看出，與對照相比，外施不同濃度的茉莉酸甲酯(0.5、5、50 μmol/L)均可以抑制野生型擬南芥根的生長,且隨著茉莉酸甲酯濃度的增加,根生長受抑制的程度也逐漸增大。

圖1在茉莉酸甲酯的不同濃度下(0、0.5、5、50 μmol/L)野生型擬南芥(wt)的根6天的生長情況

2.2 茉莉酸甲酯對野生型擬南芥(wt)和突變體(C、D、F)根生長的影響

由圖2數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果可以看出茉莉酸甲酯不同濃度對野生型擬南芥(wt)和突變體(C、D、F)根生長的影響差異并不大。

圖2擬南芥(C、wt、D、F)在不同濃度的茉莉酸甲酯(0、5、50 μmol/L)的作用下第七天的生長情況

2.3 DAB染色結(jié)果

未經(jīng)茉莉酸甲酯處理和經(jīng)過茉莉酸甲酯處理過的擬南芥在DAB染色后,根的染色結(jié)果差異并不大，所以可以認(rèn)為H2O2在茉莉酸甲酯抑制擬南芥根生長的過程中在根部不發(fā)揮作用。

圖3 DAB染色結(jié)果

2.4 NBT染色結(jié)果

未經(jīng)茉莉酸甲酯處理和經(jīng)過茉莉酸甲酯處理過的擬南芥在經(jīng)過NBT染色后,根的染色結(jié)果差異并不大，所以可以認(rèn)為H2O2在茉莉酸甲酯抑制擬南芥根生長的過程中不發(fā)揮作用。

圖4 NBT染色結(jié)果

3 討論

鑒于ABA與茉莉酸甲酯的功能相似性，已有的研究表明它們在執(zhí)行功能時(shí)信號途徑類似，如在誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉時(shí)都可以產(chǎn)生活性氧，所以我們關(guān)注在抑制根生長時(shí)它們的機(jī)制是否一致，由于有研究表明活性氧在ABA抑制根生長的過程中是發(fā)揮作用的，所以我們可以認(rèn)為JAs和ABA抑制擬南芥根的生長機(jī)制是不同的。

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