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    67例住院腹瀉患者艱難梭菌感染情況分析

    2019-12-26 09:30:18盧瑩瑩錢(qián)景榮呂博文李文輝
    關(guān)鍵詞:梭菌喹諾酮患病率

    王 杰,盧瑩瑩,錢(qián)景榮,呂博文,李文輝

    (哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科,黑龍江哈爾濱 150081)

    艱難梭菌是一種革蘭陽(yáng)性、厭氧、產(chǎn)毒的芽孢桿菌,它反映了該物種在分類(lèi)學(xué)上與梭狀芽孢桿菌屬其他成員之間的差異[1-2]。艱難梭菌的孢子通過(guò)糞-口途徑傳播,病原體廣泛存在于環(huán)境中。大約5%的成年人和15%~70%的嬰兒存在艱難梭菌定植,在住院患者或療養(yǎng)院居民的定植患病率高出數(shù)倍[3]。1935年研究者首次從健康新生兒的糞便中將艱難梭菌分離出來(lái),直到20世紀(jì)70年代,它仍被認(rèn)為是一種罕見(jiàn)的微生物,但存在于正常的腸道微生物群中。抗菌藥物使用后,艱難梭菌在腸道疾病中有更高的發(fā)病率[4-5]。1974年有研究發(fā)現(xiàn),接受克林霉素治療的患者中有21%出現(xiàn)腹瀉,經(jīng)進(jìn)一步內(nèi)窺鏡檢查,50%的病例可見(jiàn)假膜[4]。在20世紀(jì)末,艱難梭菌感染(CDI)的發(fā)生率明顯增加[6]。目前,CDI已成為嚴(yán)重的醫(yī)院內(nèi)病原菌感染之一。

    CDI的危險(xiǎn)因素主要包括近一段時(shí)間使用抗菌藥物、高齡、應(yīng)用質(zhì)子泵抑制劑、長(zhǎng)時(shí)間住院、基礎(chǔ)疾病及免疫功能受損[7]。CDI是大型醫(yī)院爆發(fā)疫情的一個(gè)常見(jiàn)原因,治療費(fèi)用昂貴,造成醫(yī)療系統(tǒng)財(cái)政負(fù)擔(dān)沉重[8-9]。國(guó)內(nèi)對(duì)艱難梭菌引起相關(guān)疾病的報(bào)道不多,檢出的陽(yáng)性率存在差異。盡早識(shí)別與檢測(cè)艱難梭菌,了解其危險(xiǎn)因素,有針對(duì)性地防治,對(duì)減輕臨床診療和疾病負(fù)擔(dān)具有重要意義。因此,為了解哈爾濱地區(qū)CDI情況,對(duì)臨床資料進(jìn)行回顧性分析,對(duì)預(yù)防和控制CDI提供可靠依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1標(biāo)本來(lái)源 收集2018年1-12月哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院住院腹瀉患者的糞便標(biāo)本共67份,入組患者住院期間均應(yīng)用抗菌藥物治療,抗菌藥物使用時(shí)間最短1 d,最長(zhǎng)25 d,且住院期間發(fā)生腹瀉,即24 h內(nèi)有3次或3次以上未成形大便。將糞便標(biāo)本放置在無(wú)菌容器內(nèi),-80 ℃條件下儲(chǔ)存待檢。

    1.2儀器與試劑

    1.2.1細(xì)菌培養(yǎng)及鑒定試劑 環(huán)絲氨酸、頭孢西丁、果糖瓊脂選擇培養(yǎng)基、肉湯、厭氧袋;甘油、無(wú)水乙醇、蒸餾水;0.5 mL、1.5 mL eppedorf(EP)管。

    1.2.2儀器設(shè)備 系統(tǒng)顯微鏡;梅里埃質(zhì)譜儀、離心機(jī)、純水器、-80 ℃、-20 ℃冰箱、CO2恒溫培養(yǎng)箱、生物安全柜;振蕩器、高溫滅菌鍋;超凈工作臺(tái);凝膠成像系統(tǒng)分析儀;微量移液器,核酸電泳儀。

    1.3方法

    1.3.1細(xì)菌培養(yǎng) 挑取約0.5 g糞便標(biāo)本,將其置于EP管,等量添加無(wú)水乙醇,混合均勻,基于3 000 r/min展開(kāi)離心處理,10 min后,棄去上清,取糞便標(biāo)本沉淀物接種到環(huán)絲氨酸、頭孢西丁、果糖瓊脂培養(yǎng)基,在37 ℃條件下進(jìn)行厭氧培養(yǎng)48 h后挑選出表面粗糙、凸起、灰白色、邊緣不齊、有馬糞味的可疑菌落,革蘭染色,篩選后接種到血平板培養(yǎng)基,在37 ℃條件下厭氧培養(yǎng)、48 h進(jìn)行分離純化。使用飛行時(shí)間質(zhì)譜儀對(duì)分離純化后的細(xì)菌鑒定。

    1.3.2菌株保存 分離純化得到的菌株洗脫到含20%甘油肉湯培養(yǎng)基中,-80 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3.3煮沸法提取DNA 艱難梭菌在血平板中進(jìn)行接種,在37 ℃條件下進(jìn)行厭氧培養(yǎng)48 h后,使用無(wú)菌棉簽洗脫到含有1 mL的蒸餾水EP管中。在沸水中處理10 min,基于12 000 r/min展開(kāi)離心處理,10 min后在上清液中提取細(xì)菌DNA,并儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱中。

    1.3.4PCR檢測(cè)艱難梭菌毒素基因 檢測(cè)艱難梭菌毒素基因tcdA、tcdB,擴(kuò)增目的基因?yàn)? 265 bp及203 bp。檢測(cè)艱難梭菌二元毒素cdtA、cdtB,擴(kuò)增目的基因?yàn)?75 bp及510 bp。PCR反應(yīng)體系25 μL,依次加入0.2 μL上下游引物;緩沖液10×2.5 μL;dNTPs 2 μL;DNA模板2 μL;Tap酶1.5 μL;無(wú)菌ddH2O 18.45 μL。所有擴(kuò)增產(chǎn)物展開(kāi)1.5%瓊脂糖凝膠電泳,電泳條件為200 V、90 mA,10 min后將膠塊放置在凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

    1.3.5多位點(diǎn)序列分型(MLST) 選取adk、atpA、dxr、glyA、recA、sodA、tpi7個(gè)管家基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR反應(yīng)體系50 μL,依次加入上下游引物各0.5 μL;緩沖液10×5 μL;dNTPs 4 μL;DNA模板3 μL;Tap酶0.25 μL;無(wú)菌ddH2O 36.75 μL。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送北京康普森生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。擴(kuò)增位點(diǎn)序列與數(shù)據(jù)庫(kù)(http://pubmlst.org/cdifficile)比對(duì),在每個(gè)位點(diǎn)獲得特異的等位基因數(shù),形成對(duì)應(yīng)的等位基因譜,確定相應(yīng)的序列類(lèi)型。

    1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn);計(jì)量資料中正態(tài)分布采用t檢驗(yàn),非正態(tài)分布采用秩和檢驗(yàn);CDI危險(xiǎn)因素分析采用Logistic回歸;P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1艱難梭菌菌株分離、毒素檢測(cè)結(jié)果 67例糞便標(biāo)本通過(guò)厭氧培養(yǎng)共獲得10株艱難梭菌,艱難梭菌陽(yáng)性率14.9%。產(chǎn)毒菌株共有10株,毒素A基因和毒素B基因全部為陽(yáng)性的共8株,檢出率為80.0%,1株為二元毒素基因陽(yáng)性;10株中,2株僅有毒素B基因陽(yáng)性,檢出率為20.0%。

    表1 患者基本資料分析

    表2 CDI危險(xiǎn)因素分析

    2.2艱難梭菌MLST分型結(jié)果 MLST分型:共有5個(gè)ST型,5株ST2型,2株ST3型,1株ST102型,1株54型,1株201型?;蚍中徒Y(jié)果顯示,本地區(qū)艱難梭菌基因型別較為分散,但是ST2型為主要的基因型別(50%)。

    2.3CDI危險(xiǎn)因素 67例患者中,CDI組12例,非艱難梭菌院內(nèi)腹瀉組(CDN組)55例。兩組患者平均年齡分別為(59.1±15.05)歲和(64.67±13.8)歲,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表1。分析兩組患者的危險(xiǎn)因素表明,使用氟喹諾酮類(lèi)抗菌藥物是CDI的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(OR值=3.12,P=0.036),患者性別、基礎(chǔ)疾病、胃腸道手術(shù)、侵入性檢查、化療藥物、質(zhì)子泵抑制劑的使用等均與CDI發(fā)生無(wú)關(guān)(P>0.05)。CDN、CDI兩組患者血紅細(xì)胞、血紅蛋白、白細(xì)胞、清蛋白、血清肌酐、尿素氮等實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表2。

    3 討 論

    近年來(lái),艱難梭菌已成為引起院內(nèi)感染性腹瀉和腸炎的主要病原體。由于抗菌藥物濫用,造成腸道菌群紊亂,艱難梭菌大量增殖,同時(shí)釋放毒素,導(dǎo)致感染性疾病的出現(xiàn),其主要的表現(xiàn)就是腸道病理性損傷[10-11]。我國(guó)CDI患病率不斷上升,2009年我國(guó)上海市一家醫(yī)院研究發(fā)現(xiàn)中國(guó)住院患者CDI患病率僅為1.7/10 000住院患者。在一篇薈萃分析中顯示,我國(guó)2009—2015年CDI引起的住院患者腹瀉率是19%,高于歐美國(guó)家報(bào)道。本研究中CDI患病率是14.9%,與國(guó)外研究報(bào)道接近[12]。

    CDI危險(xiǎn)因素較多,可分為宿主因素如年齡、基礎(chǔ)性疾病、長(zhǎng)期住院、免疫抑制使用等和醫(yī)源性因素如使用抗菌藥物、胃腸道手術(shù)、使用質(zhì)子泵抑制劑、腫瘤化療等[13]。高齡、長(zhǎng)時(shí)間住院和應(yīng)用抗菌藥物是CDI主要危險(xiǎn)因素[13]。盡管本研究未發(fā)現(xiàn)高齡與CDI有關(guān),但研究表明,艱難梭菌在老年人群中易受感染。相比于年齡<65歲的患者,患者年齡大于或等于65歲發(fā)生CDI的風(fēng)險(xiǎn)增加5~10倍,年齡大于或等于65歲不僅是CDI本身的重要危險(xiǎn)因素,也是包括CDI嚴(yán)重程度和病死率在內(nèi)不良臨床結(jié)局的重要危險(xiǎn)因素[8]。

    住院患者艱難梭菌定植的比例因國(guó)家、患者年齡和住院時(shí)間的不同而不同[14-15]。本研究中未發(fā)現(xiàn)住院時(shí)間與CDI有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)在住院的第1天,艱難梭菌的患病率在2.1%~20.0%,并且隨著住院時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,例如HUANG等[16]的一項(xiàng)研究表明,CDI患病率上升到20.0%~45.4%。PONNADA等[17]的一項(xiàng)研究表明,住院1個(gè)月后CDI患病率從2.1%增加到50.0%。在KHANNA等[18]的一項(xiàng)研究中,住院時(shí)間超過(guò)1個(gè)月CDI患病率在1%~50%。

    幾乎每一種抗菌藥物都與CDI有關(guān),包括用于治療CDI的藥物甲硝唑和萬(wàn)古霉素。與其他抗菌藥物對(duì)比,碳青霉烯類(lèi)、頭孢菌素類(lèi)、克林霉素及氟喹諾酮類(lèi)抗菌藥物誘發(fā)CDI的可能性要更高一些[19-20]。該研究發(fā)現(xiàn)氟喹諾酮類(lèi)藥物通常被認(rèn)為是CDI的危險(xiǎn)因素,優(yōu)勢(shì)比(OR值)為5.651 4[20]。降低住院患者氟喹諾酮類(lèi)藥物用量,4年內(nèi)CDI患病率下降了17.45%[20]。在抗菌治療期間和治療4周后,發(fā)生CDI的風(fēng)險(xiǎn)是治療前的8~10倍,在接下來(lái)的2個(gè)月會(huì)增加3倍[4]。正如BROWNE等[21]的一項(xiàng)研究,在過(guò)去30 d中,近期使用抗菌藥物的患者CDI患病率高出2.41倍,抗菌藥物使用的增加與抗菌藥物相關(guān)性腹瀉的流行具有一致性[12,21]。在本研究中僅發(fā)現(xiàn)氟喹諾酮類(lèi)藥物與CDI有關(guān),因此抗菌藥物使用在本次研究中未能全面體現(xiàn)出來(lái)。

    4 結(jié) 論

    現(xiàn)階段,艱難梭菌醫(yī)院感染患病率不斷增加,CDI問(wèn)題獲得社會(huì)廣泛關(guān)注。本研究中發(fā)現(xiàn)氟喹諾酮類(lèi)藥物的使用是CDI獨(dú)立危險(xiǎn)因素,住院患者中存在部分CDI情況。研究當(dāng)?shù)亓餍胁W(xué)情況和危險(xiǎn)因素,對(duì)后續(xù)針對(duì)性治療提供依據(jù)。在實(shí)際工作當(dāng)中,應(yīng)合理使用抗菌藥物,控制醫(yī)療機(jī)構(gòu)內(nèi)艱難梭菌傳播。

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