三種常見枸杞子中多糖提取方法研究進(jìn)展

王梓軒，李婭琦，郭慧清，張澤坤，衛(wèi)亞潔，馬長華

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京100102）

枸杞子是茄科植物（Solanaceae）枸杞的成熟果實，主要分布在中國西北部干旱和半干旱地區(qū)如甘肅、寧夏、青海和新疆等地[1]。枸杞子始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有非常重要的藥用和食用價值[2]，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明：枸杞具有抗氧化[3]、抗衰老[4]、護(hù)肝[5]、降血糖[6]等多種藥理活性[7-8]。其中，枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharides，LBP）與其諸多生理活性密切相關(guān)，是枸杞中的主要有效成分[9-11]，因此盡可能多地提取枸杞子中的多糖成分對枸杞的開發(fā)利用尤為重要。枸杞多糖常用提取方法有水提法[12-13]、超聲法[14-16]，酶法[17-18]、微波法[19-20]等，有關(guān)綜述僅對不同提取方法中影響其提取率的因素進(jìn)行了總結(jié)，提取方法也局限于傳統(tǒng)方法，而本文以枸杞子的種類為落腳點，不僅對目前研究較多的3種枸杞子即新疆枸杞（L.dasystemum Pojark.）、黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）和寧夏枸杞（Lycium barbarum L.）的多糖提取方法研究進(jìn)行了總結(jié)，而且對一些新興提取技術(shù)也進(jìn)行了分析對比，以期能為提取不同枸杞子中枸杞多糖，枸杞有效合理開發(fā)利用以及枸杞資源產(chǎn)業(yè)鏈發(fā)展提供科學(xué)參考。

1 新疆枸杞子中枸杞多糖的提取方法

1.1 熱水浸提法

熱水浸提法操作簡易，但提取效率和純度偏低。在該法中，溫度是影響枸杞多糖提取率的首要因素[21-22]。升高溫度會提高多糖得率，但過高會引起多糖水解而破壞多糖結(jié)構(gòu)，因此控制提取溫度是關(guān)鍵。黃文書等[21]研究發(fā)現(xiàn)：采用熱水提取法提取枸杞多糖時，影響提取率的各因素主次順序為溫度、時間、水料比、pH。最佳提取工藝為提取溫度98℃，水料比10∶1，提取時間2 h，pH 11。并且證明了堿性條件會提高枸杞多糖的得率，其原因可能是加強了對植物細(xì)胞壁及細(xì)胞膜的破壞而增加了細(xì)胞內(nèi)多糖的溶出度。但在堿性環(huán)境下，多糖糖苷鍵易發(fā)生斷裂而使枸杞多糖的生物活性受到影響，并且提取過程生成的物質(zhì)不易消除，提取后液體需要中和，后期處理繁瑣，因此堿液提取的研究較少[23]。而許程劍等[22]實驗結(jié)果表明影響得率的因素順序為浸提溫度＞浸提時間＞浸提次數(shù)＞料液比，最佳提取參數(shù)為料液比1∶20，浸提溫度80℃，浸提次數(shù)3次，浸提時間3 h。許程劍等沒有將pH作為一個影響因素進(jìn)行考察，而是考慮了浸提次數(shù)對提取率的影響。此外，李丹丹等[24]通過進(jìn)行單因素實驗和響應(yīng)面優(yōu)化分析，確定了熱水浸提枸杞多糖的最佳工藝條件：料液比為1∶27，提取溫度81℃，提取時間為2.5 h，并通過三次驗證實驗得出LBP平均得率為5.03%，與模型預(yù)測值比較接近，說明優(yōu)化出的實驗條件較為可靠。

1.2 超聲提取法

超聲提取法是最常用也是最節(jié)約成本的方法之一，與熱水浸提法相比，提取效率較高，提取條件較溫和，提取結(jié)果較穩(wěn)定，且不影響水溶性多糖的生物活性等，是理想的多糖提取方法[25-26]。超聲波的空化作用、機械效應(yīng)和熱作用使植物細(xì)胞壁更加通透，加速了胞內(nèi)多糖釋放、擴散和溶解，提高了提取效率[27]。因為超聲功率影響成分的溶出效率，因此該法中也要考察超聲功率對枸杞多糖提取率的影響，謝曉霞等[14]探討了溫度、料液比、時間和超聲功率對多糖得率的影響，結(jié)果表明影響枸杞多糖得率的因素主次順序為浸提溫度＞料液比＞浸提時間＞浸提功率，在單因素實驗的基礎(chǔ)上進(jìn)行了正交試驗，得出最佳工藝條件為溫度75℃、料液比1∶20、時間2 h、超聲功率160 W，得率可達(dá)11.03%。王航宇等[28]采用熱水浸提法和超聲提取法兩種不同的方法對相同種類相同質(zhì)量的枸杞進(jìn)行提取，研究對比了枸杞多糖提取工藝和提取率。結(jié)果表明，與熱水浸提法相比較，采用超聲法提取時間縮短了5倍以上，提取率提高30%以上。與謝曉霞等研究不同，為了避免枸杞多糖的分解，王航宇等采用超聲提取法時未將提取溫度作為影響因素，提取全過程沒有加熱。

1.3 酶解提取法

酶解提取法是應(yīng)用于中藥提取的一項生物工程技術(shù)，利用酶降解植物細(xì)胞壁成分而破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，使多糖溶出度增加，從而實現(xiàn)提高多糖提取率的目的。所用的酶依據(jù)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)成分來選擇，例如纖維素酶，蛋白酶，果膠酶等，其中纖維素酶最為常用。與傳統(tǒng)的熱水浸提法相比，酶解提取條件溫和，提取效率高，還能保持多糖原有生物活性[29]。同時，酶解法會減少化學(xué)試劑的使用，對環(huán)境和資源的保護(hù)具有一定意義。但是酶法提取成本相對較大，使該法在工業(yè)化生產(chǎn)中的應(yīng)用有一定的局限性[30]。倪慧等[17]將提取溫度，提取次數(shù)，沉淀時所用的乙醇體積及果膠酶作為影響提取率的因素，以枸杞多糖粗粉產(chǎn)量為指標(biāo)，采用正交設(shè)計對提取工藝進(jìn)行了優(yōu)選，結(jié)果表明，若將產(chǎn)量作為首要指標(biāo)而純度作為次要指標(biāo)并且考慮成本，則90℃、提取3次、每次2 h，加4倍量95%的乙醇沉淀為最佳提取工藝。此外，在對果膠酶影響的研究中發(fā)現(xiàn)，在枸杞試驗量為20 g時，加入適量果膠酶的試驗結(jié)果粗粉得量為（1.356±0.342 5）g，而未加果膠酶試驗的結(jié)果粗粉得量為（1.132±0.369 8）g?？梢钥闯黾尤牍z酶后枸杞多糖粗粉得量有一定的提高，但由于試驗所用枸杞量較小，此因素是否具有顯著性的差異還有待進(jìn)一步的考察。

2 黑果枸杞子中枸杞多糖的提取方法

2.1 熱水浸提法

熱水浸提法雖然提取時間長，但成本低，且干擾物質(zhì)少，易消除，尤其適用于游離態(tài)植物多糖的提取[31]。汪建紅等[12]只研究了提取溫度、提取次數(shù)和提取時間對黑果枸杞多糖提取的影響，并未將料液比作為影響因素來考察，直接將料液比確定為1∶20，通過正交試驗分析，各因子對多糖提取率的作用由強到弱依次為提取溫度，提取次數(shù)，提取時間，其中提取溫度是影響多糖提取率的顯著因子（P＜0.05），而提取次數(shù)和提取時間是非顯著因子（P＞0.05）。研究確定了提取黑果枸杞多糖的最優(yōu)條件為：提取溫度90℃，提取時間1 h，提取3次。在最優(yōu)條件下，3次提取黑果枸杞多糖平均得率為（3.67±0.31）%，黑果枸杞粗多糖含量為46.62%。魯小靜等[32]通過單因素試驗只考察了水浸提溫度，時間，料液比對多糖提取率的影響，利用Box-Behnken中心組合設(shè)計，采用響應(yīng)面法優(yōu)化枸杞多糖最佳提取工藝，最終確定提取條件為熱水溫度90℃，時間66min，料液比1∶25（g/mL）；在此條件下黑果枸杞多糖得率為29.36%。汪建紅和魯小靜分別沒有考慮料液比和提取次數(shù)對枸杞多糖提取率的影響，可能是因為這兩個因素對提取率的影響并不顯著[21-22]。婁濤濤等[33]對提取溫度，提取時間，料液比和提取次數(shù)進(jìn)行了單因素考察，對3個對枸杞多糖提取率影響顯著的因素進(jìn)行了響應(yīng)面分析，結(jié)果表明影響因素的主次順序為提取溫度＞料液比＞提取時間，最終確定了枸杞多糖最佳提取工藝為提取時間1.95 h，溫度90℃，液料比29.59∶1，為了方便應(yīng)用，將其校正為提取時間2 h，溫度90℃，液料比30∶1。平行3次實驗，測得多糖的平均提取率為3.21%，與模型預(yù)測值基本相符。

2.2 超聲提取法

陳亮等[15]采用超聲法對黑果枸杞多糖進(jìn)行提取，研究了提取溫度，提取時間，超聲功率，料液比對提取率的影響，結(jié)果表明各因素的影響大小為：料液比＞超聲功率＞提取時間＞提取溫度，經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化，確定了提取枸杞多糖最佳工藝為液固比30 mL/g、提取溫度72℃、超聲功率198 W、提取時間29 min，多糖得率理論最大值為12.91%。杜丁等[34]進(jìn)行了單因素試驗，并用正交試驗優(yōu)化提取枸杞多糖的工藝，正交試驗表明，4個因子對枸杞多糖提取率的影響程度順序為：料液比＞提取時間＞超聲功率＞提取溫度。確定了最佳提取工藝為料液比1∶20（g/mL），超聲功率150 W、浸提溫度70℃、浸提時長30 min，該條件下的粗多糖得率是10.69%。與陳亮等所確定的各因素影響大?。弦罕龋境暪β剩咎崛r間＞提取溫度）存在差異，其原因可能是枸杞來源及提取用量不同而導(dǎo)致一系列誤差；枸杞多糖與細(xì)胞組織結(jié)合力較弱，使超聲功率對提取率的影響減弱，而提取時間對提取率的影響增大。不過，料液比依舊是影響枸杞提取率的首要因素，而提取溫度對提取率的影響最不顯著，此與熱水提取法恰好相反[31]。彭強等[35]以料液比 1∶4，提取溫度70℃，超聲波頻率40 kHz，功率50 W的條件對枸杞多糖提取了2次，第一次提取2 h，第二次提取1 h，合并兩次的提取液，平行提取3次，枸杞多糖平均得率為2.11%，枸杞多糖含量為46.62%。此條件下，枸杞多糖得率雖低，但含量較高。

2.3 超聲-微波協(xié)同萃取法

微波輔助提取法是利用微波來增加提取強度，提高提取效率。微波提取時間短，溶劑用量少，環(huán)保高效，可以避免長時間高溫對多糖結(jié)構(gòu)的破壞[36]。微波具有波動性、熱特性和高頻性，適用于某種成分的提取[37]。微波提取結(jié)合超聲，進(jìn)一步增強了提取效果。白紅進(jìn)等[19]以枸杞多糖提取率為指標(biāo)，對常規(guī)水浴提取法、超聲波提取法、微波提取法和超聲-微波協(xié)同萃取法進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：超聲-微波協(xié)同萃取法對枸杞多糖的提取率最高，提取率大小依次為超聲-微波協(xié)同萃取法、常規(guī)水浴提取法、微波提取法和超聲波提取法。

3 寧夏枸杞子中枸杞多糖的提取方法

目前，已經(jīng)有多種方法被用于提取寧夏枸杞中的枸杞多糖，例如熱水回流法、超聲提取法、酶法、微波輔助提取法等，還包括高壓脈沖電場提取法、高速剪切技術(shù)輔助提取法和超聲輔助亞臨界水提取法這些新方法。以提取工藝參數(shù)和提取率為指標(biāo)，將目前已經(jīng)用來提取寧夏枸杞子中枸杞多糖提取方法匯總，結(jié)果見表1。

表1 不同提取方法對寧夏枸杞中多糖的提取參數(shù)對比分析Table 1 Comparison of extraction parameters of polysaccharides from Lycium barbarum L.by different methods

續(xù)表1 不同提取方法對寧夏枸杞中多糖的提取參數(shù)對比分析Continue table 1 Comparison of extraction parameters of polysaccharides from Lycium barbarum L.by different methods

3.1 相同方法對寧夏枸杞中多提取對比

孫平等[38]、張崇堅等[13]、韓紅等[39]、高春燕等[41]（分別為表中序號1、2、3、8）都采用了熱水回流法對枸杞多糖進(jìn)行了提取，以提取率為指標(biāo)通過單因素和正交試驗對提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，實驗結(jié)果對比如下：（1）各因素對提取率影響大小不同，孫平和高春燕實驗結(jié)果一致，為提取溫度＞提取時間＞料液比＞提取次數(shù)，張崇堅實驗結(jié)果為pH值＞提取溫度＞提取時間＞提取次數(shù)＞料液比，而韓紅的實驗結(jié)果為提取溫度＞提取次數(shù)＞提取時間＞料液比。由此可見，提取溫度和提取時間為熱水提取法重要考察因素。（2）提取率存在差異。存在同樣情況還有師婷婷等[18]（序號5）和高春燕等[41]（序號8）使用復(fù)合酶（纖維素酶∶果膠酶∶木瓜蛋白酶=1∶1∶1）提取枸杞多糖，關(guān)于因素影響順序，師婷婷的實驗結(jié)果為酶用量＞酶解溫度＞酶解時間，而高春燕的實驗結(jié)果為pH值＞時間＞提取溫度＞混合酶用量，提取率也有較大的差異。此外，王月囡等[40]（序號6）和邱志敏等[20]（序號7）用微波輔助提取法提取枸杞多糖，也存在上述問題。對同種枸杞采用同樣的提取方法對枸杞多糖進(jìn)行提取，結(jié)果卻存在較大差異，這可能與枸杞的前處理步驟和枸杞多糖含量測定方法有關(guān)，還可能受到原料質(zhì)量，環(huán)境等主客觀因素的干擾，需要進(jìn)一步考察證實。

3.2 不同方法對寧夏枸杞中多糖提取對比

張自萍等[16]（序號4）對熱水回流法和超聲提取法這兩種方法提取枸杞多糖進(jìn)行了比較，而王月囡等[40]（序號6）與邱志敏等[20]（序號7）都分別對比了微波輔助提取法和熱水回流法提取枸杞多糖，其中王月囡（序號6）的實驗結(jié)果表明與熱水回流法相比，微波法提取多糖提取率提高近40%。從提取條件和提取結(jié)果來看，超聲提取法和微波輔助提取法都可以提高枸杞多糖的提取率使藥材的利用度被提高，而且都有效縮短了提取時間使提取更高效。與微波輔助提取法不同的是，超聲提取法對提取溫度要求不高，可以避免高溫枸杞多糖結(jié)構(gòu)的破壞。師婷婷等[18]（序號5）應(yīng)用酶高度專一性，選擇不同的酶降解植物細(xì)胞壁不同的組成成分以提高多糖的提取率這一原理，采用不同酶輔助提取法和熱水回流法提取枸杞多糖，通過單因素，正交試驗或均勻設(shè)計對各個提取方法進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明酶輔助提取法確實使枸杞多糖的提取率顯著增加，各方法提取率順序為：混合酶（果膠酶，纖維素酶，木瓜蛋白酶各30 mg混合均勻）輔助提取法＞果膠酶輔助提取法＞纖維素酶輔助提取法＞木瓜蛋白酶輔助提取法＞木聚糖酶輔助提取法＞熱水回流法。高春燕等[41]（序號8）等對熱水回流法，超聲輔助提取法和酶輔助提取法進(jìn)行了對比，不同方法多糖提取率大小為酶輔助提?。境曒o助提?。緹崴崛?；枸杞多糖溶解性和外觀形態(tài)：酶法提取所得枸杞多糖最差；色素溶出量：超聲提取最大。實驗發(fā)現(xiàn)酶輔助提取枸杞多糖，加入乙醇要醇沉?xí)r，多糖沉于燒杯底部而不是浮于液面，這可能是因為酸性條件下，酶作用改變了多糖的結(jié)構(gòu)。因此，研究多糖生理功能時要避免使用酶法提取多糖。超聲法可能是因為超聲波的剪切力作用，使原料極度粉粹而使色素溶出量增多，使多糖顏色加深，增加了后續(xù)脫色的難度。

3.3 新方法

3.3.1 高壓脈沖電場提取法

高壓脈沖電場（high-voltage pulsed electric field，HPEF）提取是利用細(xì)胞膜電穿孔原理使細(xì)胞壁瞬間破裂以致內(nèi)容物流出，細(xì)胞膜電位被破壞，與傳統(tǒng)破壁方法不同，是一種新興提取方法[45]。高壓脈沖電場提取法耗時短，試劑用量少，已廣泛應(yīng)用于食品加工和天然產(chǎn)物提取等方面，但在枸杞多糖提取上報道較少，也沒有與其他提取方法的對比數(shù)據(jù)[42]。蔡光華等[42]（序號9）采用高壓脈沖電場法對枸杞多糖進(jìn)行提取，通過星點設(shè)計-響應(yīng)面法對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，在溫度61.76℃，電場強度20.49 kV/cm，pH 8.98，脈沖頻率 10 520 Hz，液料比 9.43 ∶1（mL/g）的條件下，枸杞多糖的提取率達(dá)到最大值為13.26%。

3.3.2 高速剪切技術(shù)輔助提取

高速剪切技術(shù)（High-speed shear dispersing emulsifier，HSDE），其原理是將樣品置于高剪切分散乳化機上，使樣品受到液力剪切、液層摩擦、撞擊撕裂、離心擠壓及湍流等各種機械力作用[46]，該技術(shù)不僅能提高提取效率，改善提取結(jié)果，降低生產(chǎn)成本，還具有綠色環(huán)保的特點[47-48]，已被應(yīng)用于植物有效成分的提取分離中[49]。杜津昊等[43]（序號10）用高速剪切技術(shù)提取了枸杞多糖，以提取率為指標(biāo)對提取工藝通過單因素和正交試驗進(jìn)行優(yōu)化并與其他提取方法進(jìn)行比較，結(jié)果表明各因素的影響依次為剪切時間＞料液比＞剪切速率＞提取時間，在提取溫度60℃，剪切時間2 min，剪切速率12 000 r/min，料液比1∶12（g/mL），提取時間2 h，提取1次的條件下枸杞多糖提取率最高為27.86%。與熱回流提取法、酶輔助提取法、超聲輔助提取法相比，不僅大大提高了多糖的提取率，且提取溫度較低，提取時間較短，多糖活性受到保護(hù)，產(chǎn)品純度較高，是多糖提取的有效方法。

3.3.3 超聲輔助亞臨界水提取法

亞臨界水是指高壓熱水或過熱水，仍保持為液體狀態(tài)，通過加壓使水溫達(dá)到100℃以上、臨界溫度374℃以下[50]。隨著溫度的升高，介電常數(shù)降低，相應(yīng)地降低了水的極性，從而使水表現(xiàn)出與有機溶劑一樣的性質(zhì)[51]。此外，亞臨界水還可以降低表面張力和固液兩相間液膜強度，從而改善溶質(zhì)的傳質(zhì)動力學(xué)，增加提取物在水中的溶解和擴散能力[52]。在亞臨界水的基礎(chǔ)上，超聲輔助進(jìn)一步加強了植物多糖的溶解和擴散，同時也增大了枸杞多糖的提取率。Zhao Chao等[44]（序號11）采用超聲輔助亞臨界水提取法提取枸杞多糖，并通過單因素和響應(yīng)面法對提取參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，還與熱水回流法，超聲法和亞臨界水提取法進(jìn)行對比，結(jié)果表明，由超聲輔助亞臨界水提取法提取所得枸杞多糖提取率最大。

采用新方法提取枸杞多糖雖然能獲得較高的提取率且提取時間較短，但在實際提取過程中并非首選提取方法，其原因可能是所用提取設(shè)備在實驗室較不普及，提取條件較難把控，常用方法可以滿足實驗需求等。

4 總結(jié)和展望

枸杞多糖作為評價枸杞質(zhì)量和功效的一大重要指標(biāo)，其提取方法需要深入探討，為以后枸杞多糖的研究提供基礎(chǔ)。針對不同種類的枸杞，其枸杞多糖含量和活性存在差異，同一種提取方法的最佳提取工藝也不盡相同。根據(jù)對新疆枸杞，黑果枸杞和寧夏枸杞3種枸杞提取方法的分析，在目前已知的所用提取方法中，對新疆枸杞而言，酶輔助提取法對其枸杞多糖提取率最大；對黑果枸杞而言，微波-超聲輔助萃取法對其枸杞多糖的提取率最大；對寧夏枸杞而言，高速剪切技術(shù)輔助提取法所得提取率最大。

經(jīng)分析可以看出：不同研究人員采用同一方法對同種枸杞的多糖進(jìn)行提取，所考慮的影響因素略有不同，因素的影響次序也有差別，優(yōu)化所得的最佳提取工藝參數(shù)和提取率也存在差異，可能與前處理，提取儀器和操作不同有關(guān)。還需進(jìn)一步對影響因素進(jìn)行逐個篩查，選擇出對提取率有明顯影響的因素，再進(jìn)行單因素和正交試驗，或通過響應(yīng)面設(shè)計，優(yōu)化出更科學(xué)的提取工藝。

采用相同方法對不同種枸杞多糖進(jìn)行提取，提取率和提取條件雖然存在差異，但會在一定范圍之內(nèi)，不會顯著不同。從宏觀上來看，提取率的大小會依賴于提取方法的不同，但也會受到枸杞種類的影響。所以，對于不同種類的枸杞，要結(jié)合自身特點找到適合自己的最佳提取方法尤為關(guān)鍵。

若僅僅以提取枸杞多糖為目的，從枸杞多糖含量最高的枸杞中提取即可，但要研究其他種類的枸杞多糖，則要結(jié)合枸杞的種類考慮，考察最優(yōu)提取方法。

不同種類的提取方法依然處于實驗室研究階段，應(yīng)從工業(yè)化生產(chǎn)的角度考慮，進(jìn)一步優(yōu)化提取工藝，為從實驗室提取轉(zhuǎn)變到工業(yè)生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)，更加深層次開發(fā)研究，以便更大限度的發(fā)揮枸杞的市場價值。