頂空固相微萃取結(jié)合GC-MS分析花椒油香氣成分

張玉霖，周亮，陳莉，舒婷

（湖北科技學(xué)院藥學(xué)院，湖北咸寧437100）

花椒（Zanthoxylum bungeanum）系蕓香科花椒屬植物，分為紅花椒（Zanthoxylum Bungeanum Maxim）和青花椒（Zanthoxylum schinifolium Sieb．etZucc.）兩個(gè)類別，在我國(guó)的山東、四川以及陜西等地都有大面積種植[1-2]。在我國(guó)，花椒作為一種常用調(diào)味料使用已經(jīng)有兩千多年的歷史，它可以給菜品帶來麻香風(fēng)味，也可以用于去除各種肉類的腥氣，對(duì)個(gè)人而言則具有促進(jìn)唾液分泌增加食欲的作用[3]?；ń芬部梢杂米髦兴?，有溫中散寒、除濕止痛、殺蟲解毒、治療嘔吐、風(fēng)寒濕痹、齒痛等功效[4]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于花椒的研究主要集中在對(duì)生花椒的提取和分析，對(duì)花椒油的研究相對(duì)較少[5]。采用新鮮花椒制成的高品質(zhì)花椒油、鮮花椒油香氣濃郁，但其香氣大多通過嗅聞來測(cè)試。鑒于此，本研究采用頂空固相微萃?。╤eadspace solid phase microextraction，HS-SPME）結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術(shù)，對(duì)花椒油的揮發(fā)性香味物質(zhì)進(jìn)行提取、分析研究，以期為建立花椒油揮發(fā)性風(fēng)味成分圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)、評(píng)價(jià)花椒油的品質(zhì)提供數(shù)據(jù)支持[6]。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

花椒油：購(gòu)買于超市；氯化鈉（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器

7890A-5975C氣質(zhì)聯(lián)用儀：美國(guó)Agilent公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS 固相微萃取頭、65 μm PDMS/DVB固相微萃取頭、HP-5MS石英毛細(xì)柱（30 m×0.25 μm，0.25 μm）：美國(guó) Supelco公司；85-2恒溫?cái)?shù)顯磁力攪拌器：金壇市新航儀器廠；EL204電子天平：上海Mettler Toledo公司；KHW-D-4電熱恒溫水浴鍋：北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司。

1.3 揮發(fā)性成分的測(cè)定

1.3.1 揮發(fā)性物質(zhì)的萃取

在使用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭萃取花椒油揮發(fā)性香氣成分前，先將萃取頭進(jìn)行老化。老化的條件為：250℃，載氣流量為2 mL/min，老化時(shí)間為90min。無干擾峰的出現(xiàn)則作為老化結(jié)束的判斷依據(jù)[7]。準(zhǔn)確稱量5 mL的花椒油樣品于頂空瓶中，加蓋密封，將其置于50℃的恒溫水浴中進(jìn)行攪拌吸附，吸附時(shí)間為40 min。然后將固相微萃取萃取頭吸附于GC進(jìn)樣口，在250℃的條件下進(jìn)行解吸，解吸時(shí)間為5 min。試驗(yàn)平行重復(fù)3次，進(jìn)行數(shù)據(jù)采集與分析。

1.3.2 揮發(fā)性香氣成分半定量分析

結(jié)合Nist和Wiley軟件進(jìn)行質(zhì)譜檢索，正反匹配度均大于800時(shí)予以選擇。半定量分析：采用峰面積歸一法進(jìn)行相對(duì)含量定量。

式中：M為單組份香氣成分的峰面積；N為總峰面積。

1.4 固相微萃取條件的優(yōu)化

對(duì)花椒油揮發(fā)性香氣成分的萃取影響較大的是總峰面積以及主峰面積，因此選用總峰面積和主峰面積作為考察指標(biāo)，選擇烯、醇和酯類等主要揮發(fā)性香氣物質(zhì)的峰面積作為分析萃取效果的判斷依據(jù)。按照“1.3.1”方法，采用單因素試驗(yàn)，考察纖維萃取頭（50/30 μm DVB/CAR/PDMS、65 μm PDMS/DVB 固相微萃取頭）、磁力攪拌（有、無）、電解質(zhì)NaCl（有、無）、萃取時(shí)間（20、30、40、50、60 min）以及萃取溫度（30、40、50、60、70、80℃）對(duì)花椒油香氣成分的萃取的影響，進(jìn)行優(yōu)化選擇。

1.5 氣相色譜和質(zhì)譜條件

1.5.1 色譜條件

HP-5MS石英毛細(xì)柱；載氣：He，0.9 mL/min恒速流動(dòng)。進(jìn)樣口溫度250℃。進(jìn)樣：不分流；程序升溫：初始溫度設(shè)置為40℃，保持2 min，以4℃/min速度上升至160℃，再以10℃/min上升至250℃，保持5 min。

1.5.2 質(zhì)譜條件

EI+，EI離子源溫度200℃，電子能量70 eV，燈絲發(fā)射電流200 μA，接口溫度250℃，掃描質(zhì)量范圍：30 amu～400 amu。

2 結(jié)果與分析

2.1 市售花椒油揮發(fā)性香氣成分萃取條件的優(yōu)化

2.1.1 纖維萃取頭的選擇

萃取頭是香氣成分萃取的關(guān)鍵，不同型號(hào)的萃取頭表面涂層有差別，對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)的吸附富集能力也不同。本試驗(yàn)選擇2種商業(yè)SPME萃取頭（50/30 μm DVB/CAR/PDMS和65 μm PDMS/DVB 涂層），對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化選擇。其中，65 μm PDMS/DVB主要是用于揮發(fā)性物質(zhì)、胺類、硝基芳香類化合物的分析，50/30 μm DVB/CAR/PDMS主要用于香味物質(zhì)（揮發(fā)性和半揮發(fā)性C3～C20）的分析。萃取頭對(duì)萃取效果的影響見圖1。

圖1 萃取頭對(duì)萃取效果的影響Fig.1 Comparison of different SPME fibers on extraction of volatiles incommercially Zanthoxylum essential oil

由圖1可以看出，在花椒油GC-MS分析結(jié)果中，PDMS/DVB萃取頭的總峰面積和主峰面積均小于DVB/CAR/PDMS萃取頭。這主要因?yàn)?0/30 μm DVB/CAR/PDMS是雙極性的，復(fù)合涂層對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)具有多重的選擇性和吸附性[8]。因此，本試驗(yàn)選用50/30 μm DVB/CAR/PDMS作為花椒油揮發(fā)性香氣成分分析的萃取頭。

2.1.2 攪拌對(duì)萃取效果的影響

使用磁力攪拌可使待測(cè)揮發(fā)性香氣物質(zhì)加速揮發(fā)，因此考察磁力攪拌對(duì)市售花椒油揮發(fā)性香氣成分萃取效果的影響。磁力攪拌對(duì)萃取效果的影響見圖2。

圖2 磁力攪拌對(duì)萃取效果的影響Fig.2 Effect of stirring on extraction of volatiles in commercially Zanthoxylum essential oil

由圖2可以看出，經(jīng)過攪拌后的市售花椒油揮發(fā)性香氣成分的總峰面積比未攪拌的花椒油揮發(fā)性成分的總峰面積變化要大，但是主峰面積變化相對(duì)不大。這說明，在花椒油中，某些低含量或者低揮發(fā)性的成分可以通過磁力攪拌促進(jìn)揮發(fā)，進(jìn)而被萃取頭吸附。為盡可能保證對(duì)花椒油特征性香氣成分進(jìn)行完整的分析，本試驗(yàn)選擇磁力攪拌的方式。

2.1.3 添加電解質(zhì)（NaCl）對(duì)萃取效果的影響

NaCl作為一種電解質(zhì)，對(duì)于一些香氣物質(zhì)來說可以促進(jìn)其揮發(fā)度，從而提高萃取頭對(duì)目標(biāo)揮發(fā)性物質(zhì)的萃取效率。因此考察電解質(zhì)NaCl（0.2 g/mL）的加入對(duì)花椒油香氣成分萃取效果的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 無機(jī)鹽（NaCl）添加對(duì)萃取效果的影響Fig.3 Effect of NaCl on extraction of volatiles in commercially Zanthoxylum essential oil

由圖3可見，NaCl的加入對(duì)花椒油揮發(fā)性香氣成分萃取效果的影響不顯著，這可能是由于NaCl作為一種無機(jī)鹽易溶于水相，而花椒油作為油相限制了NaCl對(duì)花椒油揮發(fā)性香氣物質(zhì)的萃取。

2.1.4 萃取溫度對(duì)萃取效果的影響

溫度升高一方面可以促進(jìn)樣品揮發(fā)性香氣成分揮發(fā)，另一方面也會(huì)使得萃取頭吸附的揮發(fā)性香氣成分吸附量減少。因此考察不同萃取溫度對(duì)花椒油揮發(fā)性香氣成分萃取效果的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 萃取溫度對(duì)萃取效果的影響Fig.4 Effect of temperature on extraction of volatiles in commercially Zanthoxylum essential oil

由圖4可以看出，隨著萃取溫度的升高，花椒油揮發(fā)性香氣成分的氣相色譜圖的總峰面積和主峰面積均呈現(xiàn)先增后降的趨勢(shì)。在50℃時(shí)達(dá)到最大值，因此選用50℃作為市售花椒油揮發(fā)性香氣物質(zhì)的最適萃取溫度。

2.1.5 萃取時(shí)間對(duì)萃取效果的影響

萃取時(shí)間是指揮發(fā)性物質(zhì)在萃取頭吸附薄膜、頂空和樣液中處于三項(xiàng)平衡分配所需的時(shí)間，也就是從萃取到萃取完畢所需的時(shí)間。考察萃取時(shí)間對(duì)花椒油揮發(fā)性香氣成分萃取效果的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 萃取時(shí)間對(duì)萃取效果的影響Fig.5 Effect of time on extraction of volatiles in commercially Zanthoxylum essential oil

由圖5可以看出，萃取時(shí)間在20 min～40 min之間時(shí)，隨著萃取時(shí)間的增加，萃取頭不斷對(duì)花椒油中揮發(fā)性香氣成分進(jìn)行富集，氣相色譜圖中的總峰面積和主峰面積均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在40 min時(shí)主峰面積和總峰面積達(dá)到最大值。因此，選取40 min作為花椒油揮發(fā)性香氣成分的最佳萃取時(shí)間。

2.2 花椒油揮發(fā)性成分的GC-MS檢測(cè)結(jié)果

采用優(yōu)化后的市售花椒油萃取條件對(duì)市售花椒油揮發(fā)性香氣成分進(jìn)行萃取，得到了總離子流色譜圖，如圖6所示。

經(jīng)過計(jì)算機(jī)與質(zhì)譜庫(kù)的匹配以及人工分析，確定相應(yīng)化合物的名稱[9]，將花椒油中的揮發(fā)性香氣成分匯總，見表1。

圖6 市售花椒油揮發(fā)性香氣成分的GC-MS總離子流圖Fig.6 Total ion current chromatogram of GC-MS of aroma compounds in Zanthoxylum essential oil

表1 市售花椒油揮發(fā)性香氣成分GC-MS鑒定結(jié)果Table 1 Identification of aroma compounds in Zanthoxylum essential oil by GC-MS

續(xù)表1 市售花椒油揮發(fā)性香氣成分GC-MS鑒定結(jié)果Continue table 1 Identification of aroma compounds in Zanthoxylum essential oil by GC-MS

植物油的風(fēng)味主要取決于品種、成熟度、氣候條件、種植區(qū)域、加工工藝以及貯藏條件等因素，市售花椒油應(yīng)該具有其固有的香氣成分[10-13]。在花椒油中共檢測(cè)出47種揮發(fā)性成分，占總峰面積的99.65%。含量在5%以上的單體香氣成分共有4種，其中檜烯（13.05%），（E）-β-羅勒烯（14.65%），桉油精（12.16%），乙酸芳樟酯（17.65%），占總含量的57.51%。含量在1%～5%的單體香氣成分共有14種，其中α-蒎烯（2.01%），α-側(cè)柏烯（3.45%），β-蒎烯（1.08%），α-松油烯（1.18%），γ-松油烯（2.05%），異松油烯（1.21%），別羅勒烯（2.65%），反式水化香檜烯（2.77%），β-石竹烯（2.47%），小茴香醇（3.55%），乙酸橙花酯（1.08%），乙酸香葉酯（1.76%），側(cè)柏酮（1.17%），胡椒酮（2.47%），占總含量的28.90%。其余單體香氣成分的含量均在1%以下，共29種占總含量的13.59%[14-15]。

烯烴類化合物是市售花椒油香氣組分中種類以及相對(duì)含量最多的一類物質(zhì)，共19種，相對(duì)含量為50.85%。主要是以（E）-β-羅勒烯、檜烯、α-蒎烯、β-蒎烯、α-松油烯、β-松油烯、石竹烯、異松油烯為代表的萜類及倍萜類物質(zhì)。這類物質(zhì)普遍較易揮發(fā)，具有強(qiáng)烈的木青氣息、花香和藥草香氣。在這些烯烴類化合物中（E）-β-羅勒烯、檜烯的相對(duì)含量達(dá)到了10%以上。（E）-β-羅勒烯屬于單萜化合物，在自然界作為一種引發(fā)信息素可以抑制工蜂卵巢，加速工蜂行為成熟。檜烯又稱沙賓烯，也是一種單萜烯，具有消炎的作用。α-蒎烯呈現(xiàn)類似松木、針葉及樹脂似的氣息；α-石竹烯、β-石竹烯則有似丁香油的辛香和木香的氣息，在香料中通常被用作辛香的修飾劑，對(duì)香味具有增效的性能；具有明顯檸檬特征的果香和青香的檸檬烯以及具有辛辣的茴香氣味的β-欖香烯也參與了花椒油揮發(fā)性烯烴類香氣成分的組成。在市售花椒油中檢測(cè)到的酯類化合物5種，均為乙酯類化合物，相對(duì)含量為21.35%。其中乙酸方樟酯的相對(duì)含量高達(dá)17.65%。乙酸芳樟酯又名乙酸沉香酯，有令人愉快的花香和果香，香氣似香檸檬和薰衣草，是制備高級(jí)香精不可缺少的香料。乙酸橙花酯則有橙花和玫瑰樣香氣；乙酸香葉酯有清甜的香檸檬果香及甜潤(rùn)的玫瑰、薰衣草樣香氣；乙酸苯乙酯具有玫瑰、海仙花、蜂蜜樣極甜的香氣和甜的水果味。醇類化合物多呈現(xiàn)出清新的花草香氣。在花椒油揮發(fā)性香氣成分中共檢測(cè)出9種醇類物質(zhì)，相對(duì)含量為18.94%；其中以桉油精和小茴香醇的含量較高。桉油精有與樟腦相似的氣味，小茴香醇則呈現(xiàn)木香、草香、柑橘或某些花香。醛類化合物一般會(huì)產(chǎn)生清香的風(fēng)味，主要有油脂味、堅(jiān)果味和青草味，多數(shù)醛類對(duì)油脂風(fēng)味起到積極貢獻(xiàn)作用[15-16]。在花椒油中檢測(cè)到醛類共8種，相對(duì)含量為3.42%；Brunschwig等[17]研究發(fā)現(xiàn)植物油中C5～C9的醛類化合物多數(shù)呈現(xiàn)出脂肪味、水果味或者青草味等；Nieto等[18]研究表明，油脂中的油酸、亞油酸和花生四烯酸經(jīng)過氧化會(huì)產(chǎn)生己醛，2，4-癸二烯醛也可降解得到己醛。己醛呈現(xiàn)生的油脂味和青草氣及蘋果香味，（E）-2-庚烯醛具青草香氣及刺激臭，戊醛具有特殊香味等。在花椒油中共檢測(cè)出酮類6種，相對(duì)含量為5.09%。在酮類物質(zhì)中胡椒酮具有類似樟腦和薄荷的香氣，香芹酮具有留蘭香味。

3 結(jié)論

1）采用單因素試驗(yàn)對(duì)纖維萃取頭、磁力攪拌、NaCl、萃取時(shí)間以及萃取溫度進(jìn)行優(yōu)化得到市售花椒油揮發(fā)性香氣成分最佳萃取條件。結(jié)果表明：采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，在磁力攪拌條件下，萃取溫度為50℃，萃取時(shí)間為40 min時(shí)花椒油中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)能最大程度地?fù)]發(fā)、吸附。

2）在市售花椒油中共檢測(cè)到47種揮發(fā)性香氣成分，占總峰面積的91.26%。這些香氣成分中主要以烯烴類為主，相對(duì)含量占50.85%，酯類、醇類次之，分別占有相對(duì)含量21.35%和18.94%，其他類揮發(fā)性香氣成分的含量較低。檜烯（13.05%），（E）-β-羅勒烯（14.65%），桉油精（12.16%），乙酸芳樟酯（17.65%）是其主要的揮發(fā)性香氣成分。