易損斑塊動(dòng)物模型研究進(jìn)展

王雪羽 田進(jìn)偉

150001哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院心內(nèi)科，心肌缺血教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是心血管疾病最主要的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。冠心病是心血管疾病中最主要的疾病，急性冠狀動(dòng)脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)是冠心病的一種嚴(yán)重類型，其致死率高，而易損斑塊(vulnerable plaque，VP)破裂是不良心血管事件發(fā)生的首要原因。研究發(fā)現(xiàn)，約3/4的急性心肌梗死源于斑塊破裂[1-2]。理想的VP動(dòng)物模型能形成與人類晚期斑塊類似的病變，并能產(chǎn)生與人類相似的心血管事件。

1 人類VP的特點(diǎn)

關(guān)于AS形成的機(jī)制，目前廣泛認(rèn)為在早期，由于內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，脂質(zhì)和炎癥細(xì)胞在內(nèi)皮下沉積，巨噬細(xì)胞吞噬脂質(zhì)變?yōu)榕菽?xì)胞，隨著炎癥反應(yīng)加重斑塊逐漸進(jìn)展，形成了早期的脂質(zhì)條紋；而后大量的生長(zhǎng)因子和炎癥介質(zhì)產(chǎn)生，平滑肌細(xì)胞由中膜向內(nèi)膜遷移并增殖，攝取脂質(zhì)成為泡沫細(xì)胞，在炎癥作用下產(chǎn)生大量彈性蛋白和膠原纖維，脂質(zhì)條紋逐漸變?yōu)槔w維斑塊；AS晚期，斑塊增大，管腔變窄，血流動(dòng)力學(xué)改變，纖維帽變薄，斑塊破裂繼發(fā)血栓形成[3]。此外，基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)活性與細(xì)胞外基質(zhì)降解有關(guān)，如MMP-9可增加彈性蛋白的降解，促進(jìn)纖維帽破裂，在斑塊形成和破裂中發(fā)揮重要作用[4-5]。斑塊的穩(wěn)定性由多種因素決定，它與脂質(zhì)池大小、炎癥細(xì)胞數(shù)量呈負(fù)相關(guān)，與纖維帽厚度呈正相關(guān)[6]。人類的VP主要表現(xiàn)為纖維帽薄、脂質(zhì)核心大(通常占斑塊總面積的30%～40%)、斑塊內(nèi)新生血管形成、斑塊內(nèi)出血、血管壁彈性減低、管壁向外擴(kuò)張(外向重構(gòu))、炎癥細(xì)胞增加(主要為巨噬細(xì)胞)、平滑肌細(xì)胞和膠原纖維減少和鈣化減少[1，7]。

2 物種的選擇

以往的AS動(dòng)物模型包括猴、豬、狗、兔、鼠等。新西蘭白兔是研究AS常用的動(dòng)物之一，研究發(fā)現(xiàn)，新西蘭白兔在高膽固醇飲食喂養(yǎng)下能快速形成高膽固醇血癥，但其循環(huán)血脂主要以高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)為主，僅能形成早期脂質(zhì)條紋，不能形成纖維斑塊，且由于其肝脂肪酶活性低，容易形成肝脂肪沉積，因肝損傷導(dǎo)致死亡率增加[8]。盡管降低飲食中膽固醇比例、持續(xù)高脂喂養(yǎng)改為間斷高脂喂養(yǎng)后，可出現(xiàn)更接近于人的富含平滑肌細(xì)胞的斑塊[9]，但相較于猴和豬，其斑塊形態(tài)在各個(gè)階段上都與人有較大差異。由于猴和豬的基因組與人類具有高同源性，具有相似的脈管系統(tǒng)和相似的脂代謝過程，經(jīng)頸動(dòng)脈損傷和高脂喂養(yǎng)后能觀察到其內(nèi)皮退化、泡沫細(xì)胞沉積、內(nèi)膜逐漸增厚、纖維帽變薄等與人類AS相似的病理過程[10-12]。倉鼠由于其膽固醇合成和分泌途徑與人類相似，且是唯一表達(dá)膽固醇酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的嚙齒類動(dòng)物，近年來成為研究膽固醇代謝和AS廣泛應(yīng)用的模型之一[13]。應(yīng)用不同的物種構(gòu)建VP模型有其各自特點(diǎn)，具體參見表1。

表1 選擇不同物種制備VP模型的優(yōu)缺點(diǎn)比較

3 建模方式選擇

3.1 影響代謝的因素

現(xiàn)在普遍認(rèn)為，AS由多種原因引起，其中高齡、高血壓、吸煙、血脂異常、糖耐量異常等均是AS的危險(xiǎn)因素。

3.1.1 血脂異常 高脂血癥，尤其高膽固醇血癥，是AS最重要的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。很早以前，人們便開始以高膽固醇或高脂飲食喂養(yǎng)來誘導(dǎo)AS形成，但由于動(dòng)物的血脂代謝與人不盡相同，比如新西蘭白兔所形成的高膽固醇血癥以HDL-C為主，且HDL-C被認(rèn)為是具有心血管保護(hù)作用的脂蛋白，而人類血循環(huán)脂蛋白以致AS的低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol， LDL-C)為主[9]。研究發(fā)現(xiàn)，僅在高膽固醇喂養(yǎng)條件下，盡管豚鼠血循環(huán)脂蛋白同人類相似，但其不能出現(xiàn)彌漫的內(nèi)膜增厚、明顯脂質(zhì)核心等AS病理改變。而對(duì)于大型動(dòng)物，單純的高脂喂養(yǎng)雖然可以出現(xiàn)與人類相似的AS，但由于其斑塊發(fā)生率低、可重復(fù)性差，成為構(gòu)建VP模型的主要限制[12-14]。

3.1.2 糖耐量異常 糖尿病也是心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。盡管糖尿病引起心血管疾病的機(jī)制尚未完全明確，但大量數(shù)據(jù)表明，空腹血糖每升高1.5 mmol/L或糖化血紅蛋白每升高1%，心血管風(fēng)險(xiǎn)就增加近20%[15-16]。研究發(fā)現(xiàn)，有高血糖的載脂蛋白E基因敲除(apolipoprotein E-deficient ，ApoE-/-)小鼠比血糖正常的ApoE-/-小鼠更早形成晚期斑塊。人們通過高糖飲食、腎上腺素刺激或通過應(yīng)用胰島β細(xì)胞毒性藥物如鏈脲霉素、四氧嘧啶等造成高血糖[17]，誘導(dǎo)AS的形成。近年有編碼胰島素基因(Ins2AKITA)突變鼠與血脂異常ApoE-/-鼠雜交鼠的產(chǎn)生高血糖和高血脂環(huán)境，明顯增加了VP的形成和心血管事件的發(fā)生[18]。

3.1.3 高血壓 高血壓能通過機(jī)械損傷血管內(nèi)皮，引起脂質(zhì)沉積、炎癥細(xì)胞粘附來引起AS的發(fā)生。有報(bào)道表明，高血脂患者如合并高血壓，其心血管事件的發(fā)生率將顯著增加。Ning等[19]通過手術(shù)摘除WHHL(Watanabe heritable hyperlipidemic)兔一側(cè)腎，并部分結(jié)扎另一側(cè)腎動(dòng)脈的方式成功構(gòu)建VP模型。

3.2 物理損傷

3.2.1 直接損傷血管內(nèi)皮 最常用的方法是球囊損傷，由于內(nèi)皮細(xì)胞連續(xù)性被破壞，分泌粘附因子增加，引起單核細(xì)胞等在內(nèi)皮下沉積變?yōu)榫奘杉?xì)胞并產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[20-21]，AS逐漸發(fā)生。相比于單純高膽固醇喂養(yǎng)的新西蘭兔形成的脂質(zhì)條紋，球囊損傷冠狀動(dòng)脈能形成具有大脂質(zhì)核心和纖維帽的晚期斑塊[9]。球囊損傷結(jié)合高膽固醇喂養(yǎng)動(dòng)物能在損傷部位觀察到更劇烈的炎癥反應(yīng)和平滑肌細(xì)胞增生，形成更類似于人類的AS。而球囊損傷的不足在于損傷后可能發(fā)生急性血栓栓塞事件，且機(jī)械損傷無法模擬人類AS形成到破裂的病理過程[8]。也有研究用氯化鐵成功誘導(dǎo)新西蘭兔頸動(dòng)脈內(nèi)膜損傷，并成功檢測(cè)到VP的形成[22]。

3.2.2 間接損傷血管內(nèi)皮 主要通過改變血流動(dòng)力學(xué)達(dá)成。AS斑塊多發(fā)生在動(dòng)脈分叉、狹窄或彎曲處，這些部位血流由層流變?yōu)闇u流，使血流對(duì)管壁的剪切力改變[23]。血流動(dòng)力學(xué)改變被認(rèn)為是致AS的關(guān)鍵因素，其干預(yù)方式有以下幾種：(1)完全結(jié)扎動(dòng)脈：研究表明低血管剪切力與斑塊形成有關(guān)，結(jié)扎頸總動(dòng)脈分支近端[24]，由于結(jié)扎部位遠(yuǎn)端血流中斷，近端血壓仍存在，血流剪切力極低，可在結(jié)扎近端觀察到快速發(fā)生的內(nèi)膜增厚、斑塊形成等，在血管緊張素Ⅱ的作用下可發(fā)生斑塊破裂，此方法多用于血管重構(gòu)分析、藥物治療、影像技術(shù)檢測(cè)等研究；(2)部分結(jié)扎動(dòng)脈：部分結(jié)扎ApoE-/-鼠頸動(dòng)脈后1～4周，可逐漸觀察到內(nèi)皮功能障礙、AS形成、新生血管形成等病理過程[25]，在部分結(jié)扎頸動(dòng)脈基礎(chǔ)上再結(jié)扎腎動(dòng)脈引起繼發(fā)血壓增高可觀察到斑塊破裂；(3)血管鑄型：即用特定鑄型改變管腔幾何形狀，可在鑄型位置觀察到纖維增生、泡沫細(xì)胞形成、脂質(zhì)沉積等[26]，同時(shí)也能觀察到MMP活性的增加[27]，有緊縮鑄型、錐形、凸點(diǎn)形鑄型等。在許多使用緊縮鑄型的小鼠模型中皆觀察到含少量脂質(zhì)、多膠原和平滑肌的斑塊，而在豬的緊縮鑄型模型中卻有無斑塊形成、斑塊形成、血栓栓塞等多種情形，具體原因有待研究；錐形鑄型近端大，遠(yuǎn)端小，多用于研究血管剪切力在斑塊形成中的作用，鑄型兩端皆可形成斑塊：近端血管剪切力高，形成大而同心的斑塊，而鑄型遠(yuǎn)端剪切力低且波動(dòng)，則形成偏心含大量炎癥細(xì)胞的斑塊[28]；(4)動(dòng)靜脈瘺：此法最初用于血液透析患者的透析治療，由于靜脈內(nèi)膜的增生常導(dǎo)致動(dòng)靜脈瘺的失敗，其原因可能是瘺成形后血流速度和血管剪切力的增加，使相應(yīng)的炎癥基因和蛋白表達(dá)變化，引起內(nèi)皮功能紊亂、平滑肌增生、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和內(nèi)膜增生，此模型多用于血管重構(gòu)和斑塊進(jìn)展的研究[29]；(5)靜脈橋：靜脈橋用于血管閉塞性疾病的治療，常由于內(nèi)膜增生斑塊形成導(dǎo)致冠脈搭橋失敗。在靜脈橋內(nèi)發(fā)現(xiàn)彌漫的、同心的、具有大壞死核、纖維帽不完整的斑塊，而人類的AS則為局灶的、偏心的、纖維帽覆蓋良好，具體原因未明，可能由于管腔面積變化，靜脈內(nèi)血流速度減慢引起相應(yīng)改變。這種模型用于對(duì)冠狀動(dòng)脈搭橋失敗原因的研究，而不適用于AS發(fā)生發(fā)展的研究[7，29]。

3.3 藥物作用

由于組胺、血管緊張素Ⅱ等有縮血管作用，可升高血壓，增加斑塊表面壓力，用于誘導(dǎo)VP的破裂[30]。Xiong等[31]通過皮下注射P277短肽的方法誘導(dǎo)兔VP形成，P277是熱休克蛋白60的一個(gè)短肽片段，可作為一種自身抗原，能引起多種免疫相關(guān)性疾病如自身免疫性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化和AS等[32]。而在感染、應(yīng)激、血流動(dòng)力學(xué)改變等情況下，血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)HSP增加。皮下注射P277可誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的發(fā)生，使CD4+T細(xì)胞攻擊高脂喂養(yǎng)的動(dòng)物血管內(nèi)皮細(xì)胞，誘導(dǎo)VP的形成。盡管外源性給藥方式能誘導(dǎo)VP破裂，但其與人類VP自發(fā)破裂的發(fā)生仍存在差異。

3.4 基因技術(shù)應(yīng)用

小鼠因其繁殖期短、花費(fèi)低等優(yōu)點(diǎn)成為研究AS最受歡迎的動(dòng)物之一。但與人類血脂成分不同，小鼠含有高水平的具有心血管保護(hù)作用的HDL-C，而致AS作用的LDL-C和極低密度脂蛋白膽固醇(very low-density lipoprotein，VLDL)含量低，因而小鼠不易形成斑塊，但可利用基因敲除技術(shù)通過影響血脂代謝建立AS動(dòng)物模型，如ApoE-/-小鼠模型和低密度脂蛋白受體(low-density lipoprotein receptor， LDLR)基因敲除小鼠模型(LDLR-/-)。ApoE存在于除LDL-C以外的脂蛋白中，作為細(xì)胞表面脂蛋白受體的配體，參與乳糜微粒和VLDL的清除。LDLR可識(shí)別LDL-C顆粒上脂蛋白B100，參與LDL-C的胞吞作用，也可以促進(jìn)ApoB、ApoE的胞吞。ApoE-/-和LDLR-/-小鼠均是以C57BL/6小鼠為背景的基因敲除鼠，由于C57BL/6為近交品系鼠，相較于普通小鼠，其患冠心病的可能更高[33]，且因其基因組高度一致性，這兩種鼠經(jīng)高脂喂養(yǎng)后均能形成重復(fù)性高的VP。不同之處在于ApoE-/-小鼠在正常飲食下也能形成高脂血癥，其血HDL-C水平也較正常小鼠和LDLR-/-低，可自發(fā)形成AS，高脂飲食可加速、加重其病變，而LDLR-/-小鼠在正常飲食下，僅能引起輕微的血膽固醇升高，需在高脂喂養(yǎng)后才出現(xiàn)AS[34]。 此外還有LDLR基因敲除兔，在正常飲食喂養(yǎng)下，其膽固醇水平16～20倍高于正常兔，也可形成大壞死核的斑塊[35]。

彈性蛋白是血管壁和動(dòng)脈粥樣硬化斑塊細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成部分，彈性纖維的破壞可引起動(dòng)脈硬化，血管彈性減低[36]，而動(dòng)脈硬化是心血管事件的危險(xiǎn)因素。原纖蛋白1是合成微原纖維的重要成分，后者為彈性蛋白的沉積和交聯(lián)提供支架。為明確原纖蛋白1在AS中的作用，研究人員利用ApoE-/-小鼠和原纖蛋白1基因中雜合突變的C1039G+/-小鼠雜交獲得ApoE-/-C1039G+/-鼠，并發(fā)現(xiàn)ApoE-/-C1039G+/-鼠不論是否高脂喂養(yǎng)，均能觀察到彈性纖維破裂、血管壁增厚、外向擴(kuò)張等病理過程，均能形成至少兩倍于高脂喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠的斑塊面積[37]，而高脂喂養(yǎng)20周后ApoE-/-C1039G+/-鼠可觀察到典型的VP特點(diǎn)：3倍于高脂喂養(yǎng)的ApoE-/-鼠的大脂質(zhì)核心、大量的炎癥細(xì)胞、典型薄纖維帽、豐富的新生血管和斑塊內(nèi)出血、斑塊破裂和猝死；此外，MMP-12、MMP-2、MMP-9的表達(dá)也明顯增高[37]。這種鼠較ApoE-/-鼠最大的優(yōu)點(diǎn)為可形成有自發(fā)破裂傾向的VP，為減少心血管事件的研究提供新的動(dòng)物模型。

4 展望

目前，研究人員已經(jīng)建立了多種AS動(dòng)物模型，但由于動(dòng)物的基因組與人類存在本質(zhì)的不同和干預(yù)方式的不同，目前仍然沒有能完全符合人類AS過程的動(dòng)物模型。但隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和基因技術(shù)的運(yùn)用，建立能產(chǎn)生與人類VP相似的動(dòng)物模型有助于減少動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與人體實(shí)際的差異，為藥物研究、器械耗材改進(jìn)提供良好的動(dòng)物基礎(chǔ)，從而促進(jìn)心血管事件的減少。

利益沖突：無