干旱脅迫下H2S對板栗幼苗葉片抗氧化特性的影響

孫曉莉　付瑩　田壽樂　王金平　沈廣寧

摘要：為探討干旱脅迫下外源H2S對板栗葉片抗氧化特性的影響，本研究以黃棚板栗幼苗為試材，利用PEG模擬干旱環(huán)境，硫氫化鈉（NaHS）和次?；撬幔℉T）分別作為H2S供體和清除劑，設(shè)計NaHS、PEG、NaHS+PEG、PEG+HT、NaHS+PEG+HT、HT 6個處理，以澆灌Hoagland 營養(yǎng)液為對照（CK），分別測定不同處理下板栗幼苗葉片SOD、POD、CAT、APX活性和丙二醛（MDA）、過氧化氫（H2O2）、脯氨酸（Pro）含量。結(jié)果表明：0.5 mmol/L NaHS顯著增強葉片SOD、POD、CAT、APX活性，提高葉片Pro含量，顯著降低葉片MDA、H2O2含量，從而減輕干旱脅迫對植物造成的膜脂過氧化損失，提高板栗幼苗對干旱逆境的適應(yīng)能力，而添加清除劑HT則逆轉(zhuǎn)了其作用。

關(guān)鍵詞：板栗;硫化氫;干旱脅迫;抗氧化特性

中圖分類號：S664.201文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2019）11-0035-05

Effect of Exogenous Hydrogen Sulfide on Antioxidant

Characteristics in Leaves of Chestnut Seedlings under Drought Stress

Sun Xiaoli1， Fu Ying2， Tian Shoule1， Wang Jinping1， Shen Guangning1

（1. Shandong Institute of Pomology， Taian 271000， China;

2. Zoucheng National Resources and Planning Bureau， Zoucheng 273500， China）

Abstract Using Huangpeng chestnut seedlings as experimental materials， the activities of antioxidant enzymes such as SOD， POD， CAT and APX in leaves under drought stress simulated by PEG were measured by using H2S donor sodium thiohydrate （NaHS） and scavenging agent subtaurine （HT）. Six treatments were designed as NaHS， PEG， NaHS+PEG， PEG+HT， NaHS+PEG+HT and HT with the Hoagland solution as control （CK）. The contents of malondialdehyde （MDA）， hydrogen peroxide （H2O2），proline （Pro） and the activities of SOD， POD， CAT and APX were determined under different treatments. The results showed that the treatment of 0.5 mmol/L NaHS significantly increased the activities of SOD， POD， CAT and APX and the Pro content in leaves， but decreased the contents of MDA and H2O2 significantly， so the membrane lipid peroxidation damage was alleviated， and the tolerance of chestnut seedlings to drought stress was enhanced. However， the addition of H2S scavenger HT reversed the above effects.

Keywords Chinese chestnut; Hydrogen sulfide; Drought stress; Antioxidant characteristics

干旱是影響我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)最嚴重的氣象災(zāi)害，常導(dǎo)致植物生長代謝受阻、蛋白質(zhì)合成降低，影響作物的高質(zhì)高產(chǎn)。而葉片作為植物遭受干旱脅迫下反應(yīng)最敏銳的器官，對缺水非常敏感，因此探討干旱脅迫下葉片的相關(guān)生理指標變化對指導(dǎo)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重要的參考價值。硫化氫（hydrogen sulfide， H2S）無色易溶于水，具有明顯臭雞蛋氣味，是繼一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO）之后的第三大內(nèi)源性氣體信號分子[1]。它參與植物生長發(fā)育全過程，具有劑量效應(yīng)。生理濃度H2S可促進植物干物質(zhì)積累、胚乳利用及根系形態(tài)建成[2]，調(diào)節(jié)生理生化過程如物質(zhì)代謝、光合作用、抗衰老等[3-8]，保障植物抵御非生物脅迫如干旱、鹽、高溫、重金屬脅迫等[9-13]。

H2S對干旱脅迫的緩解作用已經(jīng)在多個樹種上得到證實。外源提供的H2S供體主要是NaHS和GYY4137，其釋放的H2S也可被植物體吸收，同樣引發(fā)植物耐逆性的形成[14，15]。試驗中多采用NaHS作為H2S供體進行科學(xué)研究。已有研究表明，NaHS處理可提高蠶豆和蘇丹鳳仙花的相對含水量來緩解干旱脅迫引起的損傷[3];外源H2S通過增強水解酶和抗氧化保護酶的活性可有效緩解干旱脅迫造成的傷害，提高黃瓜種子的萌發(fā)率[16];0.3 mmol/L NaHS可顯著提高玉米葉片及根系的相對含水量，增強光合能力與根系活力，提高玉米幼苗抗旱性[12];外源H2S通過調(diào)控菠菜可溶性多糖、多胺（polyamines）和甘氨酸甜菜堿（glycinebetaine）的生物合成提高葉片相對含水量等，從而增強菠菜的抗旱能力[17]。這充分表明H2S正向調(diào)控植物對干旱脅迫的響應(yīng)。

板栗（Castanea mollissima）是我國優(yōu)勢特色經(jīng)濟林樹種、農(nóng)業(yè)部地理標志農(nóng)產(chǎn)品，對支撐山區(qū)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟和生態(tài)建設(shè)作用顯著[18]，研究板栗的抗旱能力對其穩(wěn)定發(fā)展具有重要現(xiàn)實意義。本研究用PEG模擬干旱環(huán)境，以硫氫化鈉（NaHS）、次?；撬幔℉T）作為H2S供體、清除劑，對黃棚板栗一年生實生幼苗進行不同處理，探討硫化氫提高板栗抗逆性的生理機理，以期為解決板栗春季干旱問題提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試板栗為黃棚板栗，由山東省果樹研究所萬吉山試驗基地提供。

1.2 試驗方法

試驗于2016年5—7月在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝試驗站進行。將飽滿整齊的黃棚板栗種子播種至陶盆內(nèi)，其基質(zhì)內(nèi)含石英砂。澆灌Hoagland營養(yǎng)液，至幼苗3～4片真葉時，選擇生長整齊的植株進行處理。具體處理如下，其中對照CK：Hoagland 營養(yǎng)液;NaHS處理：Hoagland 營養(yǎng)液+0.5 mmol/L NaHS; PEG處理：Hoagland營養(yǎng)液+15% PEG;NaHS+PEG處理：Hoagland 營養(yǎng)液+15% PEG+0.5 mmol/L NaHS;PEG+HT處理：Hoagland營養(yǎng)液+15% PEG+0.3 mmol/L HT;NaHS+PEG+HT處理：Hoagland 營養(yǎng)液+15%PEG +0.5 mmol/L NaHS+0.3 mmol/L HT;HT處理：Hoagland營養(yǎng)液+0.3 mmol/L HT。每處理重復(fù)3次，溶液總體積100 mL。處理24 h后分別取葉片液氮速凍，存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 測定指標及方法

過氧化氫（H2O2）含量和超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性采用南京建成生物工程研究所試劑盒測定;脯氨酸（Pro）含量采用磺基水楊酸提取、茚三酮顯色法測定;丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸法測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)用DPS v7.05統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，Microsoft Excel 2003軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫下H2S對板栗幼苗葉片SOD、POD、CAT、APX活性的影響

由圖1可以看出，與CK相比，單獨H2S處理略上調(diào)板栗葉片4種抗氧化酶活性，但不顯著;單獨HT（H2S抑制劑）處理的POD活性顯著高于CK，SOD、CAT活性略高于CK;PEG脅迫引起板栗葉片SOD、POD、CAT、APX活性顯著升高，較CK分別提高65.60%、72.80%、159.14%、18.21%;與單獨PEG脅迫相比，PEG+NaHS處理下SOD、POD、CAT、APX活性分別提高37.68%、21.53%、29.99%、13.28%，差異顯著;PEG+HT處理與PEG處理相比，SOD、POD、APX活性下降明顯，CAT活性略微上升，但不顯著; PEG+NaHS+HT處理下SOD、POD、CAT活性略高于PEG處理，差異不顯著。表明添加H2S可提高抗氧化酶的活性，增強干旱脅迫下細胞對ROS的清除能力，從而增強板栗幼苗抗旱能力，而添加HT處理使NaHS的效果被抑制。

2.2 干旱脅迫下H2S對板栗幼苗葉片MDA、H2O2含量的影響

由圖2、3可以看出，與正常生長條件下的CK相比，NaHS處理及HT處理下板栗葉片MDA、 H2O2含量略有上下浮動但不顯著。而PEG處理導(dǎo)致MDA、H2O2含量顯著升高，分別較CK升高79.09%、42.38%，差異顯著;與PEG處理相比，PEG+NaHS處理顯著降低板栗葉片MDA、H2O2含量，分別降低23.13%、20.95%，差異顯著;PEG+NaHS+HT及PEG+HT處理下MDA、H2O2含量與PEG處理相比略有上下浮動但差異不顯著。表明外源H2S處理明顯抑制干旱脅迫下ROS的積累，緩解干旱脅迫引起的氧化損傷，而添加HT抑制了H2S的功能，未能有效緩解細胞膜脂過氧化傷害。

2.3 干旱脅迫下H2S對板栗幼苗葉片Pro含量的影響

由圖4可以看出，NaHS和HT處理下板栗葉片脯氨酸含量與CK差異不顯著;PEG處理下葉片脯氨酸含量顯著升高，相比CK增加39.11%;與PEG處理相比，PEG+NaHS處理顯著提高干旱脅迫下板栗葉片脯氨酸含量，升幅為27.65%，兩者差異顯著;PEG+NaHS+HT、PEG+HT處理的板栗葉片脯氨酸含量略有提高，差異不顯著。表明H2S顯著提高干旱脅迫下板栗葉片脯氨酸含量，而添加清除劑HT處理對脯氨酸含量變化無明顯效果。

3 討論與結(jié)論

干旱脅迫常會導(dǎo)致植物光合電子傳遞鏈的過度還原，并在葉綠體及線粒體中產(chǎn)生大量活性氧[19]，從而引起細胞膜系統(tǒng)損傷，破壞代謝平衡，促使植物自身啟動抗氧化防御系統(tǒng)，其中SOD、CAT、POD、APX等抗氧化酶類在活性氧的清除過程中起重要作用[20]，可防御干旱脅迫引起的ROS傷害[21]。 H2S作為一種氣體信號分子可直接或間接地參與細胞、組織、器官等的信號傳遞[22]，它可以提高SOD、CAT、POD、APX活性，緩解干旱、鹽及重金屬脅迫引起的損傷，提高植物抗逆能力[23-28]。因此，H2S在提高植株抵抗逆境脅迫中起積極作用，主要通過提高抗氧化酶的活性實現(xiàn)。本研究表明，干旱脅迫導(dǎo)致板栗幼苗葉片的氧化還原平衡被破壞，體內(nèi)SOD、CAT、POD、APX活性顯著升高以消除活性氧帶來的傷害;與單獨PEG處理相比，PEG+NaHS處理顯著提高板栗葉片抗氧化酶活性，增強抗氧化系統(tǒng)的防御能力，維持植物體穩(wěn)態(tài)，緩解干旱脅迫引起的細胞膜結(jié)構(gòu)和功能損傷;而PEG+NaHS+HT與PEG+HT處理下抗氧化酶活性相對PEG處理上下略有浮動，差異不顯著，表明HT使NaHS的效果被解除。這充分表明硫化氫在抵御干旱脅迫過程中發(fā)揮積極作用。

逆境脅迫下MDA、H2O2含量可有效反映植物膜受損和膜脂過氧化程度[29，30]。MDA是植物體內(nèi)膜脂過氧化反應(yīng)的最終分解產(chǎn)物，其含量高低能反映膜脂受傷害的程度。H2O2是植物有氧代謝的副產(chǎn)物，可調(diào)節(jié)植物對環(huán)境的適應(yīng)能力。逆境下脯氨酸可作為植物合成的滲透調(diào)節(jié)相關(guān)物質(zhì)提高植物滲透調(diào)節(jié)能力，其偶極性可以維持膜蛋白形態(tài)完好，降低植物水分散失[31];干旱脅迫下，細胞能主動積累脯氨酸以維持組織內(nèi)各種酶類和細胞膜結(jié)構(gòu)的正常功能[32]。因此，MDA、H2O2、Pro可作為評價植物抗旱能力的重要指標。本試驗中，干旱脅迫導(dǎo)致板栗幼苗葉片MDA、H2O2、Pro含量顯著升高，而添加NaHS處理顯著降低葉片MDA、H2O2含量，進而減弱膜脂過氧化水平并穩(wěn)定膜結(jié)構(gòu)，此外，還顯著增加葉片脯氨酸含量，從而增大細胞質(zhì)濃度、降低滲透勢，調(diào)節(jié)細胞的滲透平衡，使細胞在低滲透勢條件下仍能從胞外吸水，維持細胞和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，最終增強了板栗的抗旱性。這與趙敏等[33]關(guān)于高山離子芥的研究一致。而添加HT處理則抑制了H2S的有效功能，對MDA、H2O2、Pro含量影響較大。

綜上所述，干旱脅迫導(dǎo)致板栗幼苗葉片SOD、POD、CAT、APX活性顯著提高，MDA、H2O2、脯氨酸含量顯著增加。添加外源H2S可顯著提高葉片抗氧化酶活性，增加Pro含量，顯著降低MDA、H2O2含量，從而減輕干旱脅迫對植物造成的膜脂過氧化損失，提高板栗幼苗對干旱逆境的適應(yīng)能力，而添加H2S清除劑HT的處理，則逆轉(zhuǎn)了上述緩解作用。由此表明H2S在提高植物抗旱性過程中起積極作用，從而為深入研究H2S提高植物抗旱性提供了依據(jù)。

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收稿日期：2019-05-28

基金項目：山東省農(nóng)業(yè)良種工程項目（2016LZGC012）;山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年科研基金項目（2016YQN29）;山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程項目（CXGC2018F03，CXGC2018E22，CXGC2016A03）;山東省林業(yè)科技創(chuàng)新項目（LYCX05-2018-27）

作者簡介：孫曉莉（1986—），女，碩士，研究實習(xí)員，主要從事板栗栽培育種研究。E-mail：runxiaoli@163.com

通訊作者：沈廣寧（1979—），男，碩士，副研究員，主要從事板栗育種研究。E-mail： gnshens@163.com