驢源沙門氏菌的分離鑒定、耐藥及毒力分析

孫陽陽　楊美　解曉莉　程凱慧　張亮　楚會萌　任亞初　楊宏軍

摘要：沙門氏菌是一種常見的食源性人畜共患腸道致病菌，兼性胞內(nèi)致病菌。山東省某養(yǎng)驢場頻發(fā)流產(chǎn)現(xiàn)象且無明顯征兆，本研究對驢流產(chǎn)胎兒內(nèi)臟及頭部感染細菌進行分離，并對分離株進行鑒定及耐藥、毒力分析。結(jié)果表明，獲得的7株分離株均為沙門氏菌，分別命名為SL1-SL7，其中SL1、SL2、SL3、SL5、SL6與鼠傷寒沙門氏菌的同源性分別為100%、99.93%、99.93%、99.79%、99.57%;SL4與愛丁堡沙門氏菌、湯姆遜沙門氏菌的同源性均為99.79%;SL7與阿邦尼沙門氏菌、愛丁堡沙門氏菌、湯姆遜沙門氏菌同源性分別為99.72%、99.72%、99.65%;耐藥表型結(jié)果顯示7株沙門氏菌對本試驗中所有藥物均比較敏感;毒力基因篩選結(jié)果顯示，除SL1、SL2、SL3、SL7 毒力島SPI-4上的ssb毒力基因未檢出外，7株分離菌均具有沙門氏菌典型毒力基因;7株沙門氏菌對小鼠的致病性較弱，小鼠喂食菌液后未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。

關(guān)鍵詞：沙門氏菌;驢;分離鑒定;耐藥分析;毒力基因

中圖分類號：S858.22 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2019）11-0143-06

Isolation， Identification， Drug Resistance and

Virulence Analysis of Salmonella from Donkey

Sun Yangyang， Yang Mei， Xie Xiaoli， Cheng Kaihui，

Zhang Liang， Chu Huimeng， Ren Yachu， Yang Hongjun

（Dairy Cattle Research Center， Shandong Academy of Agricultural Sciences， Jinan 250131， China）

Abstract Salmonella is a common foodborne zoonotic enteric pathogen and facultative intracellular pathogen. There was no obvious sign of frequent abortion in a donkey factory in Shandong Province. In this study， the infection bacteria in viscera and head were isolated， and identifying the isolates and analyzing their drug resistance and virulence. The results showed that all the 7 isolates identified were Salmonella and named as SL1-SL7. The homology rates of SL1， SL2， SL3， SL5 and SL6 with Salmonella typhimurium were 100%， 99.93%， 99.93%， 99.79% and 99.57%， respectively. The homology rates of SL4 with Salmonella edinburgh and Salmonella thomson were 99.79%. The homology rates of SL7 with Salmonella arbonini， Salmonella edinburgh and Salmonella thomson were 99.72%， 99.72% and 99.65%， respectively. The results of drug-resistant phenotype showed that 7 strains of Salmonella were sensitive to all the drugs in this study. The results of virulence gene screening showed that all the 7 isolates had typical virulence genes of Salmonella except the ssb virulence genes on SPI-4 of SL1， SL2， SL3 and SL7 virulence islands. The 7 strains of Salmonella were less pathogenic to mice， and the mice did not die after feeding the bacteria solution.

Keywords Salmonella; Donkey; Separation and identification; Resistance analysis; Virulence gene

沙門氏菌（Salmonella enteriditis，SE）屬腸桿菌科 （Enterobacteriaceae），革蘭氏陰性腸道桿菌，兼性胞內(nèi)致病菌，是一種常見的食源性人畜共患腸道致病菌，其中畜禽感染非常普遍，主要引起發(fā)熱、腹瀉、敗血癥、胃腸炎和腦膜炎等癥狀[1， 2]，造成懷孕母畜發(fā)生流產(chǎn)，嚴重時還可導(dǎo)致死亡，對人和動物的健康威脅巨大。因此，沙門氏菌的檢測和預(yù)防治療在醫(yī)學、獸醫(yī)學和公共衛(wèi)生方面都有十分重要的意義。豬、雞等動物沙門氏菌病較為常見，而關(guān)于馬屬動物特別是驢的沙門菌病國內(nèi)鮮少報道。馮培祥等[3]從流產(chǎn)胎兒中分離到沙門菌，確定是引起驢流產(chǎn)的致病菌。本研究通過剖檢采集到的驢流產(chǎn)胎兒樣本的組織及器官，并對從中分離出的細菌進行分離鑒定，確定為沙門氏菌，通過對其進行耐藥性分析為該病在臨床上的用藥選擇提供了依據(jù)，毒力基因的篩選為沙門氏菌侵襲機體的機制研究，尤其是如何突破血-腦屏障進入機體腦部的機制研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

樣品：從山東省某養(yǎng)驢場采集6例流產(chǎn)驢胎兒（包括胎盤等流產(chǎn)物），對流產(chǎn)胎兒進行剖檢，取其心、肝、脾、肺、腎及腦部等器官，進行細菌分離培養(yǎng)檢測。

大腸埃希菌（Escherichia coli）ATCC25922質(zhì)控菌株，購于海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗試劑

藥敏片：頭孢他啶（CAZ）、頭孢噻肟（CAZ）、亞胺培南（IPM）、頭孢西?。‵OX）、美羅培南（MEM）、奧格門汀（ACA）、頭孢曲松（CRO）、頭孢呋辛（CXM）、頭孢唑林（CFZ） 、哌拉西林（PIP）、氨芐西林（AMP）、氨曲南（ATM）、諾氟沙星（NOR）、恩諾沙星（ENR）、環(huán)丙沙星（CIP）、阿米卡星（AMK）、慶大霉素（GEN）、卡那霉素（KAN）、四環(huán)素（TE）、磺胺異噁唑（G）、甲氧芐氨嘧啶（W）、呋喃妥因（FM）、氯霉素（C）、多黏菌素B（PB），均購于杭州微生物試劑有限公司。

試劑：普通營養(yǎng)肉湯，XLT4培養(yǎng)基，M-H瓊脂，普通營養(yǎng)瓊脂，沙門氏菌微量生化鑒定管，麥氏比濁管，脫纖維羊血，均為海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;顯色培養(yǎng)基，為法國科馬嘉（Chromagar）公司產(chǎn)品;2×Taq Master Mix，DL1000 Marker，為寶日醫(yī)（Takara）生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;EasyPure Bacteria Genomic DNA Kit，為北京全式金（TransGen Biotech）生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;引物合成均由華大基因股份有限公司完成。

培養(yǎng)基配制：普通營養(yǎng)肉湯、沙門氏菌顯色培養(yǎng)基、XLT4培養(yǎng)基、M-H瓊脂、普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基按照產(chǎn)品說明書進行操作;血瓊脂板配制時需在完成普通營養(yǎng)瓊脂配制后高壓滅菌冷卻至50℃左右加入5%的脫纖維羊血，混勻后倒入無菌平板。

試驗動物：6～8周齡昆明鼠，購于山東大學實驗動物中心。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌株分離、純化

將采集的流產(chǎn)胎兒置于超凈臺內(nèi)進行剖檢，無菌操作取其心、肝、脾、肺、腎以及胎盤，將以上組織器官剪碎后取少量接種至沙門氏菌顯色板、營養(yǎng)瓊脂板中，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，挑取可疑菌落，分四區(qū)劃線于XLT4平板、沙門氏菌顯色板以及瓊脂培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，挑取單菌落，接種于普通肉湯培養(yǎng)基中，37℃搖床過夜孵育增菌，菌液中加入20%無菌甘油，分裝保存于-20℃ 冰箱中;需長期保存的菌種，將增菌液分裝后按照1∶[KG-*2/3]1比例加入凍干保護劑，置于凍干機中凍干，密封后放置于-20℃冰箱中儲存。

1.3.2 分離菌鑒定

（1） 鏡檢：挑取單菌落，通過革蘭氏染色，顯微鏡下觀察細菌的革蘭氏屬性以及細菌的形態(tài)、大小。

（2） 16S rDNA鑒定：取分離株肉湯菌液，送華大基因股份有限公司進行16S rDNA測序，利用NCBI的Blast功能得出與其同源性較近的菌株。

（3）PCR鑒定：采用引物F：5′-CTTTGGTCGTAAAATAAGGCG-3′、R：5′-TGCCCAAAGCAGAGAGATTC-3′[4]擴增沙門氏菌的保守型特異性基因stn。利用細菌DNA提取試劑盒（EasyPure Bacteria Genomic DNA Kit）提取純化后的分離菌菌液DNA（具體操作步驟可參考試劑盒說明書），PCR反應(yīng)體系：Master Mix 12.5 μL，10 μmol/L的上下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，加入滅菌水配制成25 μL體系;PCR反應(yīng)程序：94℃ 5 min;94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，共35個循環(huán);72℃ 10 min。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，并在凝膠成像系統(tǒng)上觀察、拍照。

1.3.3 耐藥表型檢測

通過Kirby-Bauer法（紙片瓊脂擴散法），以E. coli（ATCC25922）為質(zhì)控菌株，檢測7株分離菌對8類24種抗生素的藥物敏感性。將分離純化的單菌落接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃振蕩孵育6 h，取出后調(diào)整濃度至0.5麥氏濁度;用無菌棉棒將配制好的菌懸液均勻涂布于M-H瓊脂培養(yǎng)基上，15 min內(nèi)將藥敏片貼于培養(yǎng)基表面，每一皿中最多貼4個藥敏紙片，將貼好藥敏片的培養(yǎng)皿15 min內(nèi)置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，取出后用游標卡尺測量抑菌圈直徑。

1.3.4 毒力基因檢測

查閱文獻，選取不同毒力島上代表性的毒力基因（SPI-1：invA、sipA;SPI-2：sseA、ttrA;SPI-3：mgtCB;SPI-4：ssb、soxSR;SPI-5：sopB、sigD;菌毛基因：fimW），從GenBank中查閱收錄的毒力基因序列，通過Primer Premier 5軟件分別設(shè)計10對引物，以試劑盒提取的7株細菌的DNA為模板，進行細菌毒力基因的PCR擴增，引物序列及PCR反應(yīng)條件見表1。PCR反應(yīng)體系同特異性基因stn。

通過細菌DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒，回收7株分離菌中檢出條帶，送華大基因股份有限公司測序。

1.3.5 小鼠致病性試驗

復(fù)活分離菌，劃線接種于普通瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24 h后，挑取單菌落，接種于營養(yǎng)肉湯，37℃搖床過夜孵育，用PBS培養(yǎng)基將菌液稀釋為0.5麥氏濁度（約1×108 cfu/mL）。將小鼠分為9組，其中1個空白對照組，1個陰性對照組，7個試驗組，每組5只小鼠，空白對照組不喂食菌液，陰性對照組喂食0.4 mL PBS，試驗組分別喂食7株分離菌懸液0.4 mL。記錄接種后兩周內(nèi)小鼠臨床表現(xiàn)，如有小鼠死亡，解剖觀察內(nèi)臟狀態(tài)并檢測內(nèi)臟染菌情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌鑒定結(jié)果

從肺中分離出6株菌，腦中分離出1株菌，分別命名為SL1（肺）、SL2（肺）、SL3（肺）、SL4（腦）、SL5（肺）、SL6（肺）、SL7（肺）。培養(yǎng)基鑒定結(jié)果（圖1）顯示，顯色培養(yǎng)基上呈現(xiàn)紫色、邊緣整齊、濕潤的露滴樣菌落;瓊脂培養(yǎng)基上顯示灰白色、圓形、邊緣整齊的菌落;XLT4培養(yǎng)基上出現(xiàn)中心黑色、圓形邊緣鋸齒狀的菌落。不同培養(yǎng)基上出現(xiàn)的菌落形態(tài)均符合沙門氏菌特性。革蘭氏染色結(jié)果表明，細菌無莢膜，無芽孢，為均勻散布的革蘭氏陰性短桿菌（圖2）。

16S rDNA測序結(jié)果與GenBank中登錄序列進行Blast比對，SL1、SL2、SL3、SL5、SL6與鼠傷寒沙門氏菌（S. typhimurium）的同源性分別為100%、99.93%、99.93%、99.79%、99.57%;SL4與愛丁堡沙門氏菌（S. edinburg）、湯姆遜沙門氏菌（S. thomoson）的同源性均為99.79%;SL7與阿邦尼沙門氏菌（S. abony）、S. edinburg、S. thomoson同源性分別為99.72%、99.72%、99.65%。PCR鑒定結(jié)果中均檢測到沙門氏菌特異性基因stn（圖3）。綜合培養(yǎng)基鑒定結(jié)果、16S rDNA及PCR鑒定結(jié)果可確定分離菌為沙門氏菌。

2.2 耐藥性檢測結(jié)果

耐藥表型結(jié)果（表2）顯示7株驢源沙門氏菌對所有藥物均較為敏感，包括β內(nèi)酰胺酶類、呋喃類、喹諾酮類、磺胺類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、氯霉素類及多肽類，說明牧場未給驢大量使用抗生素治療，若及時檢出，沙門氏菌病相對容易治愈。

2.3 毒力基因篩選

如圖4所示，除SL1、SL2、SL3、SL7 毒力島SPI-4上的ssb毒力基因未檢出外，7株分離菌均具有沙門氏菌典型毒力基因。雖然ssb未檢出，但SPI-4上除ssb具有參與調(diào)控沙門氏菌在宿主細胞內(nèi)環(huán)境中適應(yīng)、存活的作用，soxSR也具有該功能，因此ssb的缺失對沙門氏菌的毒力影響不大。

2.4 小鼠致病性結(jié)果

7 d后試驗組小鼠出現(xiàn)不同程度的腹瀉現(xiàn)象，對照組未有任何異常，10～14 d后試驗組小鼠腹瀉現(xiàn)象減輕，基本自愈，并無死亡現(xiàn)象發(fā)生。該沙門氏菌致病性較弱，自身的免疫能力可以將其控制，但因沙門氏菌為胞內(nèi)寄生菌，可潛伏于體內(nèi)，因此并不能夠確定沙門氏菌被完全清除。

3 討論與結(jié)論

目前發(fā)現(xiàn)沙門氏菌有2 500多種血清型，絕大多數(shù)血清型能在人和動物間交叉感染[5]。本試驗中分離株SL1、SL2、SL3、SL5、SL6可確定為鼠傷寒沙門氏菌，SL4與愛丁堡沙門氏菌、湯姆遜沙門氏菌同源性更近，SL7與阿邦尼沙門氏菌、愛丁堡沙門氏菌同源性較近。愛丁堡沙門氏菌是一種極為罕見的沙門氏菌血清型，湯姆遜沙門氏菌是雞養(yǎng)殖中常被感染的一種血清型，而阿邦尼沙門氏菌細菌毒性較強，可引起類似于傷寒沙門氏菌的癥狀[6-8]。本試驗中發(fā)生流產(chǎn)的母驢未出現(xiàn)明顯的不適癥狀，由此可以看出沙門氏菌在不同動物體內(nèi)的寄生作用可能不同，在驢體內(nèi)寄生未引起腸道癥狀，但對胎兒影響較大，可對牧場造成巨大損失。但本試驗中分離株的耐藥性并不強，幾乎對所有藥物均較為敏感，說明牧場并未大量用藥，如染菌情況發(fā)現(xiàn)及時，可避免不必要的經(jīng)濟損失。

SPI-1編碼的Ⅲ型分泌系統(tǒng)與細菌的侵襲力有關(guān)，inv、sip只是其編碼的較為典型的基因;SPI-2在鼠傷寒沙門氏菌中很穩(wěn)定，不易缺失，與沙門氏菌的全身性感染無關(guān)，但與沙門氏菌在細胞內(nèi)存活及擴散有關(guān)，可以輔助沙門氏菌逃避巨噬細胞的殺傷作用;SPI-3的典型毒力基因是mgtCB，其主要介導(dǎo)沙門氏菌在宿主巨噬細胞和低Mg2+環(huán)境中的存活;ssb和soxSR分別位于SPI-4的上下游，主要負責編碼與介導(dǎo)毒素分泌的Ⅰ型分泌系統(tǒng)類似的蛋白，并參與調(diào)控沙門氏菌在宿主巨噬細胞內(nèi)環(huán)境中的適應(yīng)、存活，因此ssb未表達并不一定影響SPI-4功能;SPI-5編碼參與腸黏膜液體分泌和炎癥反應(yīng)的相關(guān)蛋白，但不參與全身性感染，sopB、sigD的表達與細胞炎性因子的分泌相關(guān)[9-12];fimW是Ⅰ型菌毛基因簇成員，Ⅰ型菌毛基因簇的表達受蛋白 FimW、FimY、FimZ以及imU編碼的tRNA調(diào)控，由7個基因組成 （fimAICDHF），作用于多種細胞表面特異的α-D-mannose受體，有利于細菌的吸附[13]，張成棟[14]研究證實Ⅰ型菌毛特異性介導(dǎo)鼠傷寒沙門氏菌粘附上皮細胞和骨髓源樹突狀細胞，灌胃感染小鼠表明，I 型菌毛能明顯降低鼠傷寒沙門氏菌的毒力，而尾靜脈侵襲小鼠發(fā)現(xiàn)結(jié)果恰好相反，并且細菌在體內(nèi)擴散途徑也相反。

雖然本試驗得到的分離株毒力基因均被檢出，但在小鼠致病性試驗中發(fā)現(xiàn)其致病性并不強，可得出沙門氏菌的毒力基因與致病性強弱并無必然聯(lián)系。有文獻報道[15]，沙門氏菌的耐藥性與毒力有一定聯(lián)系，因此，其耐藥性、毒性以及致病性之間的關(guān)系需進一步研究。

另外從胎驢腦部可分離到沙門氏菌，該沙門氏菌如何通過血腦屏障進入腦部、哪些毒力基因在起作用以及作用機制等問題都需要進一步深入研究。

參 考 文 獻：

[1]賈愛卿. 豬沙門氏菌的臨床分離鑒定及耐藥性消除研究[D]. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學， 2006.

[2]趙蕊. 非傷寒沙門氏菌腦膜炎[J]. 傳染病信息， 1995（2）：67-68.

[3]馮培祥， 楊莉， 趙付偉， 等. 驢沙門菌的分離鑒定及藥敏試驗[J]. 中國獸醫(yī)雜志， 2018， 54（8）：81-84.

[4]田雅楠. 不同源腸炎沙門菌耐藥表型與耐藥基因型分析[D]. 揚州：揚州大學， 2017.

[5]劉新靜. 河北省雞沙門氏菌的分離鑒定及耐藥性分析[D]. 泰安：山東農(nóng)業(yè)大學， 2015.

[6]Lavy C B， Lavy V R， Anderson I. Salmonella septic arthritis of the shoulder in Zambian children[J]. Journal of the Royal College of Surgeons of Edinburgh， 1996， 41（3）：197-199.

[7]Lalonde R G. Salmonella thomson outbreak in a Canadian newborn nursery[J]. Canadian Journal of Infectious Diseases， 1993， 4（4）： 209-212.

[8]Kauffmann F. Untersuchungen über s. abortus bovis， s. sch-leissheim sowie zwei neue salmonella‐typen s. abony und s. tel-aviv.[J]. Acta Pathologica Et Microbiologica Scandinavica， 2009， 17（1）：1-8.

[9]Golubeva Y A， Ellermeier J R， Cott J C， et al. Intestinal long-chain fatty acids act as a direct signal to modulate expression of the Salmonella pathogenicity island 1 type III secretion system[J]. Mbio.， 2016， 7（1）：e02170-15.

[10]Yin J L， Chen Y， Xie X L， et al. Influence of Salmonella enterica serovar pullorum pathogenicity island 2 on type Ⅲ secretion system effector gene expression in chicken macrophage HD11 cells[J]. Avian Pathology， 2017， 46（2）：209-214.

[11]Amavisit P， Lightfoot D， Browning G F， et al. Variation between pathogenic serovars within Salmonella pathogenicity islands[J]. Journal of Bacteriology， 2003， 185（12）： 3624-3635.

[12]Figueroa Ochoa I M， Verdugo Rodríguez A. Molecular mechanism for pathogenicity of Salmonella spv[J]. Rev. Latinoam. Microbiol.， 2005， 47（1/2）： 25-42.

[13]Saini S， Pearl J A， Rao C V. Role of FimW， FimY， and FimZ in regulating the expression of type Ⅰ fimbriae in Salmonella enterica serovar typhimurium[J]. Journal of Bacteriology， 2009， 191（9）： 3003-3010.

[14]張成棟. Ⅰ型菌毛介導(dǎo)鼠傷寒沙門氏菌對小鼠的毒力及對抗原遞呈細胞侵襲力的研究[D]. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學， 2009.

[15]Foley S L， Lynne A M. Food animal-associated Salmonella challenges： pathogenicity and antimicrobial resistance[J]. J. Anim. Sci.， 2008， 86（14）： 173-187.

收稿日期：2019-07-08

基金項目：“十三五”國家重點研發(fā)計劃項目“牛羊重要疫病診斷與檢測新技術(shù)研究”（2016YFD0500900）;現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（奶牛）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系科學家崗位項目（CARS-36）;山東省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程項目“主要畜禽疫病監(jiān)測和預(yù)警”（CXGC2016A10）

作者簡介：孫陽陽（1989—），女，山東淄博人，碩士，助理研究員，研究方向：分子生物學。E-mail：13688639022@163.com

通訊作者：楊宏軍，男，山東濟寧人，博士，研究員，研究方向：分子生物學。E-mail：longfei1997@sina.com