Ds插入突變體的遺傳學(xué)綜合性實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與探討

李楠，李亞娟，郭海濱，張向前

插入突變體的遺傳學(xué)綜合性實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與探討

李楠1，李亞娟1，郭海濱1，張向前2

1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)公共基礎(chǔ)課實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，廣州 510642 2. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院，廣州 510642

學(xué)生創(chuàng)新能力的培養(yǎng)已成為中國(guó)高等教育的重要導(dǎo)向，加強(qiáng)綜合設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)的應(yīng)用是提高大學(xué)生創(chuàng)新能力的有效途徑。文章以水稻插入突變體為實(shí)驗(yàn)材料，以突變體表型觀測(cè)作為實(shí)驗(yàn)切入點(diǎn)，以遺傳分析和轉(zhuǎn)座檢測(cè)為實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)重點(diǎn)，重新設(shè)計(jì)了一個(gè)分子遺傳學(xué)綜合性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)知識(shí)拓展環(huán)節(jié)引導(dǎo)學(xué)生利用開(kāi)放實(shí)驗(yàn)平臺(tái)學(xué)習(xí)TAIL-PCR技術(shù)，進(jìn)一步進(jìn)入研究性實(shí)驗(yàn)。通過(guò)綜合性實(shí)驗(yàn)到研究性實(shí)驗(yàn)的遞進(jìn)式教學(xué)體系，能夠使學(xué)生深入理解表型與基因的內(nèi)在聯(lián)系、跳躍基因的概念以及轉(zhuǎn)座子在基因功能研究中的重要作用，加深學(xué)生對(duì)基因概念及遺傳規(guī)律的認(rèn)識(shí)和理解，提升學(xué)生理論知識(shí)與實(shí)驗(yàn)技能的整合運(yùn)用能力。

綜合性實(shí)驗(yàn)；實(shí)驗(yàn)教學(xué)；基因突變

遺傳學(xué)是探究生物遺傳和變異規(guī)律的理論科學(xué)，是生命科學(xué)領(lǐng)域的基礎(chǔ)學(xué)科，研究?jī)?nèi)容豐富，小到基因結(jié)構(gòu)、功能及表達(dá)，大到生物群落的遺傳特征[1]。遺傳學(xué)理論與實(shí)踐關(guān)系密切，實(shí)驗(yàn)不僅是遺傳學(xué)的重要基礎(chǔ)，更是培養(yǎng)創(chuàng)新能力的重要環(huán)節(jié)[2]。為提升遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)質(zhì)量和促進(jìn)創(chuàng)新人才培養(yǎng)，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)于2007年構(gòu)建了“一般性實(shí)驗(yàn)—綜合性實(shí)驗(yàn)—研究性實(shí)驗(yàn)”的遞進(jìn)式遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)新體系，提出適合華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)科類(lèi)專(zhuān)業(yè)的“創(chuàng)新型混合教學(xué)模式”[3]。2012年，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)現(xiàn)了遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)的獨(dú)立設(shè)課，新編《遺傳學(xué)綜合性實(shí)驗(yàn)》教材和實(shí)驗(yàn)教學(xué)大綱，將遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)從16學(xué)時(shí)的一般性實(shí)驗(yàn)調(diào)整至32學(xué)時(shí)的普通遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)和48或64學(xué)時(shí)的遺傳學(xué)綜合設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)。

當(dāng)前華南農(nóng)業(yè)大學(xué)本科遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)主要分為3大類(lèi)綜合性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目：細(xì)胞遺傳學(xué)綜合性實(shí)驗(yàn)、經(jīng)典遺傳學(xué)綜合性實(shí)驗(yàn)及分子遺傳學(xué)綜合性實(shí)驗(yàn)。分子遺傳學(xué)綜合性實(shí)驗(yàn)從2012年應(yīng)用至今已有7年，以秈粳水稻葉片為材料，利用特定SSR引物擴(kuò)增秈粳水稻的DNA片段，實(shí)現(xiàn)對(duì)不同材料的區(qū)分。該實(shí)驗(yàn)主要以植物DNA提取、PCR擴(kuò)增和凝膠電泳檢測(cè)等分子標(biāo)記相關(guān)技術(shù)的學(xué)習(xí)為主，已遠(yuǎn)不能滿足創(chuàng)新型人才培養(yǎng)需要。

為提升遺傳學(xué)綜合設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的質(zhì)量，適應(yīng)當(dāng)代教學(xué)的需要，利用水稻插入突變體材料，以培養(yǎng)學(xué)生科研思維和研究方法作為實(shí)驗(yàn)教學(xué)目標(biāo)，以遺傳分析法和PCR檢測(cè)技術(shù)為學(xué)習(xí)重點(diǎn)，重新設(shè)計(jì)了分子遺傳學(xué)綜合性實(shí)驗(yàn)。使學(xué)生通過(guò)本實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的學(xué)習(xí)，能夠理解表型與基因的內(nèi)在聯(lián)系，了解跳躍基因的概念以及轉(zhuǎn)座子的重要應(yīng)用價(jià)值，掌握科學(xué)研究的思維方式與研究方法，提升對(duì)理論與實(shí)踐、知識(shí)與技術(shù)的整合運(yùn)用能力。

1 實(shí)驗(yàn)材料的背景

粒重是決定水稻產(chǎn)量的3個(gè)主要因素(即每株有效穗數(shù)、每穗粒數(shù)和粒重)之一，是粒長(zhǎng)、粒寬和粒厚的綜合指標(biāo)。而水稻粒長(zhǎng)、粒寬及長(zhǎng)寬比又稱(chēng)為水稻谷粒形狀，是衡量稻米外觀品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，同時(shí)還影響稻米的商品品質(zhì)和加工品質(zhì)(糙米率、精米率和整精米率)。近年來(lái)，水稻粒形相關(guān)基因的研究取得了突破性進(jìn)展。目前，至少已有93個(gè)水稻粒形相關(guān)基因被克隆，遍布水稻12條染色體[4~7]。本實(shí)驗(yàn)所用的突變體材料是一個(gè)轉(zhuǎn)座引起的粒型突變體，其谷殼大小與野生型無(wú)異，而穎果顯著縮小，該突變體表型為不完全顯性遺傳；利用轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法，采用TAIL-PCR[8](thermal asymmetric interlaced PCR)技術(shù)已獲知候選基因位于水稻第11號(hào)染色體，該基因?qū)儆陬?lèi)伸展蛋白基因家族，是一個(gè)控制水稻重要農(nóng)藝性狀的新基因。

該材料是由/雙因子轉(zhuǎn)座系統(tǒng)轉(zhuǎn)化至粳型品種中花11號(hào)獲得[9]，其中用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒為pDsBar1300，用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒為pUbiTs (圖1)[9]。pDsBar1300質(zhì)粒的T-DNA區(qū)中攜帶轉(zhuǎn)座子，的內(nèi)部插入基因，能提供對(duì)Basta (商用除草劑，有效成分為膦絲菌素PPT)的抗性，在的旁側(cè)插入潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hygromycin phostrans-ferase,)，能提供對(duì)潮霉素的抗性。將篩選得到的水稻轉(zhuǎn)化純合體和轉(zhuǎn)化純合體進(jìn)行雜交，構(gòu)建了多個(gè)雜交組合，通過(guò)轉(zhuǎn)座酶的反式活化使發(fā)生轉(zhuǎn)座[9]。

2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.1 設(shè)計(jì)思路

利用該材料進(jìn)行綜合性實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，先將以上科學(xué)研究的實(shí)驗(yàn)材料與野生型雜交獲得F1，并自交獲得F2分離群體，以該突變體、野生型、F1雜合體、F2群體的成熟谷粒及對(duì)應(yīng)水稻葉片作為課程實(shí)驗(yàn)材料。首先讓學(xué)生通過(guò)觀察與考種實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)突變體、野生型和F1雜合體在谷殼和米粒上的異同；其次提供F2群體米粒，通過(guò)米粒寬度測(cè)量及方差分析，引導(dǎo)學(xué)生對(duì)該材料進(jìn)行表型觀察和遺傳分析；再次提供學(xué)生F2群體水稻葉片，利用PCR檢測(cè)技術(shù)，分析突變體表型與插入之間的關(guān)系，驗(yàn)證表型調(diào)查結(jié)果。最后通過(guò)知識(shí)拓展環(huán)節(jié)，結(jié)合理論教學(xué)讓學(xué)生深入了解轉(zhuǎn)座因子在基因功能研究中的應(yīng)用價(jià)值。并以突變體為例，探討如何實(shí)現(xiàn)該類(lèi)型材料(例如T-DNA或轉(zhuǎn)座子插入突變體)的基因克隆及功能分析。該實(shí)驗(yàn)整個(gè)教學(xué)設(shè)計(jì)基于問(wèn)題引導(dǎo)式教學(xué)模式(problem-based learning)，以問(wèn)題為導(dǎo)向，引導(dǎo)學(xué)生在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)問(wèn)題、分析問(wèn)題、提出問(wèn)題、研究問(wèn)題并解決問(wèn)題，最后得出科學(xué)研究結(jié)論，進(jìn)而培養(yǎng)學(xué)生科學(xué)研究的思維方式，提升學(xué)生對(duì)理論與實(shí)踐、知識(shí)與技術(shù)的整合運(yùn)用能力和創(chuàng)新實(shí)踐能力。

圖1 質(zhì)粒T-DNA區(qū)和TAIL-PCR引物所在位置示意圖

A：質(zhì)粒pDsBar1300中T-DNA區(qū)及PCR檢測(cè)引物位置示意圖。：潮霉素抗性基因；35S-Pro：35S啟動(dòng)子；：基因能提供對(duì)Basta的抗性；tra4、P5和P10：轉(zhuǎn)座檢測(cè)的3條引物。B：質(zhì)粒pUbiTs中T-DNA區(qū)示意圖。Ubi-Pro：Ubi啟動(dòng)子；Nos-Pro：Nos啟動(dòng)子；：基因編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶，能賦予細(xì)胞抗卡那霉素的能力。LB和RB：T-DNA的左右邊界。C：TAIL-PCR引物所在位置示意圖。

2.2 實(shí)驗(yàn)涉及的主要理論知識(shí)與實(shí)驗(yàn)技術(shù)

該實(shí)驗(yàn)涉及的理論知識(shí)點(diǎn)與實(shí)驗(yàn)技術(shù)主要包括孟德?tīng)栠z傳定律、轉(zhuǎn)座子及TAIL-PCR技術(shù)。分離定律是孟德?tīng)栠z傳定律之一。在雜合子細(xì)胞中，位于一對(duì)同源染色體上的等位基因，在進(jìn)行減數(shù)分裂時(shí)等位基因會(huì)隨著同源染色體的分開(kāi)而分離，分別進(jìn)入兩個(gè)配子中，獨(dú)立地隨配子遺傳給后代，在F2代性狀發(fā)生3∶1或1∶2∶1的分離[10]。

轉(zhuǎn)座子(transposon)是染色體上可復(fù)制和位移的一段DNA序列。轉(zhuǎn)座子可以通過(guò)切割、重新整合等一系列過(guò)程從基因組的一個(gè)位置“跳躍”到另一個(gè)位置。在各種功能基因組學(xué)研究方法中，利用轉(zhuǎn)座子插入誘變的方法被認(rèn)為是進(jìn)行大規(guī)?；蚬δ荑b定的有力工具[11]，目前已有多例用/轉(zhuǎn)座系統(tǒng)成功分離水稻基因的報(bào)道[12,13]。

TAIL-PCR技術(shù)，即交錯(cuò)式熱不對(duì)稱(chēng)PCR，通過(guò)利用已知的DNA序列設(shè)計(jì)一組特異性引物，并結(jié)合隨機(jī)簡(jiǎn)并引物，采用高溫特異性擴(kuò)增與低溫隨機(jī)擴(kuò)增相結(jié)合的方法，獲得轉(zhuǎn)座子插入側(cè)翼區(qū)特異擴(kuò)增片段，相應(yīng)擴(kuò)增片段可直接測(cè)序分析，篩選分離基因。

2.3 實(shí)驗(yàn)材料與方法

2.3.1 實(shí)驗(yàn)材料

將突變體與野生型雜交，并將F1自交獲得的F2群體，以突變體、野生型、F1雜合體及F2群體的成熟谷粒，F(xiàn)2群體谷粒對(duì)應(yīng)的水稻葉片作為課程實(shí)驗(yàn)材料。所有材料均種植于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)場(chǎng)，單株種植，常規(guī)管理。

2.3.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.3.2.1 突變體的鑒定和遺傳分析

一個(gè)實(shí)驗(yàn)班人均約30人，將學(xué)生以5人為一組，提供給每組同學(xué)野生型、突變純合體、突變雜合體谷粒各1袋，每袋100粒。F2群體210株對(duì)應(yīng)收獲種子210袋，每袋100粒?？挤N方法為10粒為1組，3次重復(fù)，整齊擺放，配置游標(biāo)卡尺與分析天平測(cè)量。利用ImageJ軟件獲取考種數(shù)據(jù)，并運(yùn)用SPSS18.0軟件進(jìn)行卡方檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)。

2.3.2.2轉(zhuǎn)座的PCR檢測(cè)

轉(zhuǎn)座的PCR檢測(cè)參照劉芳等[9]方法。因子切離的PCR檢測(cè)利用引物P10、Tra4和P5同時(shí)擴(kuò)增。如果未發(fā)生切離，稱(chēng)為滿載供體位點(diǎn)(full donor site, FDS)，通過(guò)引物P10和P5可以擴(kuò)增出約400 bp的特異帶；如果從T-DNA上切離，稱(chēng)為空載供體位點(diǎn)(empty donor site, EDS)引物Tra4和P5可以擴(kuò)增出約870 bp的特異帶；如果既存在EDS又存在FDS，則利用3條引物可以同時(shí)擴(kuò)增出兩條特異帶。

具體實(shí)驗(yàn)步驟包括基因組DNA提取、PCR擴(kuò)增、電泳分離、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析等。每年在田間種植兩親本各20株、F120株和F2群體210株。待上課前1周取F2群體每株上部葉片置于超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

水稻DNA提?。喝?~4 cm長(zhǎng)的葉片用液氮研磨至粉末，加入TPS抽提液(100 mmol/L Tris-HCl pH8.0，10 mmol/L EDTA，1 mol/L KCl)1000 μL，75℃水浴30 min；13 000r/min離心12 min，吸上清約500 μL轉(zhuǎn)入1.5 ml離心管中，加入等體積遇冷的異丙醇，?20℃放置10 min，13 000 r/min離心5 min，棄上清，干燥沉淀，加200 μL滅菌水溶解，4℃冰箱冷藏備用。

PCR擴(kuò)增及瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)：學(xué)生使用自己提取的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)模板使用3條引物(P10、Tra4和P5)同時(shí)擴(kuò)增。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察電泳結(jié)果，記錄樣品基因型。

2.3.2.3 突變體基因克隆

利用水稻的/雙因子轉(zhuǎn)座系統(tǒng)，篩選轉(zhuǎn)座插入純合體植株為材料，采用TAIL-PCR[8]的方法擴(kuò)增元件旁側(cè)的水稻基因組序列，分析插入位點(diǎn)旁鄰序列，通過(guò)序列比對(duì)確定該基因在水稻染色體上的具體位置，并對(duì)候選基因進(jìn)行了分析。TAIL-PCR反應(yīng)所用引物見(jiàn)表1，其位置示意圖如圖1所示，特異擴(kuò)增得到的第3輪PCR產(chǎn)物用來(lái)測(cè)序。在水稻基因組中的插入位置運(yùn)用BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)分析工具完成。因子插入所在位點(diǎn)相關(guān)基因預(yù)測(cè)信息可以在水稻基因組注釋數(shù)據(jù)庫(kù)獲得(http://rice.plantbiology.msu. edu/)。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物

DsR-primer：元件3′末端特異的嵌套引物；AD primer：熔解溫度較低的隨機(jī)簡(jiǎn)并引物；W：“A/T”堿基；N：“A/C/G/T”堿基；S：“C/G”堿基。

2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.4.1 突變體鑒定與遺傳分析

水稻是1個(gè)轉(zhuǎn)座子插入引起的穎果明顯變小，而谷粒大小沒(méi)有改變的突變體(圖2A)。進(jìn)一步分析表明，突變純合體穎果(20.25±0.26 mm，10粒)比野生型穎果寬(27.10± 0.43 mm，10粒)減少了25.3%，而其百粒重較野生型減少了33.6%；雜合體穎果比野生型寬度減少了18.5%，百粒重減少了25.2%。

為了研究突變體表型遺傳特性，我們構(gòu)建了F2分離群體。在F2群體中，不同植株的穎果表型明顯不同，其中60株穎果寬度類(lèi)似野生型，103株穎果寬度達(dá)22.09± 0.21 mm (10粒)，47株穎果寬度則與突變純合體無(wú)異。卡方測(cè)驗(yàn)表明其分離比符合1∶2∶1 (2= 1.68<20.05,2= 5.99)，說(shuō)明突變表型由1對(duì)不完全顯性基因調(diào)控。

2.4.2 突變性狀與共分離分析

為了分析突變體表型與之間的關(guān)系，并驗(yàn)證表型調(diào)查結(jié)果，對(duì)F2分離群體做了轉(zhuǎn)座的PCR檢測(cè)(圖2B)。在F2代的210個(gè)單株的分離群體中，60株野生型植株均為未轉(zhuǎn)座類(lèi)型，47株突變體植株為轉(zhuǎn)座純合類(lèi)型，其余為轉(zhuǎn)座雜合類(lèi)型，三者之間的比率同樣符合1∶1∶2。根據(jù)上述結(jié)果可以認(rèn)為，該突變體的產(chǎn)生是由于轉(zhuǎn)座的插入所引起的，遺傳行為符合1對(duì)不完全顯性基因的分離模式，表明該突變表型與插入共分離，與F2群體穎果表型調(diào)查結(jié)果相吻合。

3 實(shí)踐教學(xué)中的課堂組織方式

3.1 以科研思路為導(dǎo)向，創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)內(nèi)容、教學(xué)方法與組織方式

本實(shí)驗(yàn)作為分子遺傳學(xué)綜合性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目以培養(yǎng)學(xué)生創(chuàng)新思維與方法作為教學(xué)目標(biāo)，將研究中發(fā)現(xiàn)的水稻插入粒型突變體作為實(shí)驗(yàn)材料，以遺傳分析和PCR檢測(cè)技術(shù)為實(shí)操學(xué)習(xí)重點(diǎn)，并通過(guò)以下4步來(lái)完成實(shí)驗(yàn)教學(xué)：(1)引導(dǎo)學(xué)生發(fā)現(xiàn)問(wèn)題；(2)通過(guò)表型調(diào)查和方差分析分析問(wèn)題；(3)將表型觀測(cè)與PCR檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合，對(duì)突變體進(jìn)行鑒定與遺傳分析提出問(wèn)題；(4)通過(guò)知識(shí)拓展環(huán)節(jié)，結(jié)合轉(zhuǎn)座因子內(nèi)容，以該材料為例深入講解轉(zhuǎn)座子的特征及應(yīng)用價(jià)值，加深學(xué)生對(duì)跳躍基因概念的理解，進(jìn)一步研究問(wèn)題。

本實(shí)驗(yàn)可分4次課完成，每周1次課，每次課4個(gè)學(xué)時(shí)，分為以下3大部分：

圖2 水稻pex1突變體表型及其分子檢測(cè)

A：水稻突變體谷粒和穎果表型。WT：野生型；：突變雜合體；：突變純合體。B：轉(zhuǎn)座的PCR檢測(cè)。M：100 bp DNA Ladder；1~7：檢測(cè)植株，其中植株4、7的未發(fā)生轉(zhuǎn)座，僅存在FDS，1和6為轉(zhuǎn)座純合體，僅存在EDS；2, 3, 5為轉(zhuǎn)座雜合體，既存在EDS又存在FDS。C：插入突變體TAIL-PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳分析。M：100 bp DNA Ladder; Ⅱ, Ⅲ：分別為T(mén)AIL-PCR第二、三輪產(chǎn)物。

(1)遺傳分析實(shí)驗(yàn)部分1次課。1~2學(xué)時(shí)：首先提供給學(xué)生野生型突變體谷粒材料，引導(dǎo)學(xué)生對(duì)谷殼和米粒進(jìn)行仔細(xì)觀察并發(fā)現(xiàn)問(wèn)題。教師再講解考種的方法，指導(dǎo)學(xué)生用統(tǒng)計(jì)方法研究突變體表型特征。3~4學(xué)時(shí)：提供給每組F2群體谷粒，要求學(xué)生測(cè)量谷粒表型，利用卡方檢驗(yàn)對(duì)突變體進(jìn)行遺傳分析。在該節(jié)課中，所有學(xué)生均表現(xiàn)出對(duì)實(shí)驗(yàn)的濃厚興趣，并能按時(shí)完成實(shí)驗(yàn)。

(2)轉(zhuǎn)座的PCR檢測(cè)部分2次課，第一次課的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容為提取水稻葉片DNA；第二次課的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容為PCR擴(kuò)增及電泳，拍照記錄帶型，要求學(xué)生課后對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。該部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容相對(duì)復(fù)雜，會(huì)有個(gè)別學(xué)生需要通過(guò)重復(fù)實(shí)驗(yàn)才能完成。

(3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果討論與教學(xué)延伸部分1次課。首先組織學(xué)生匯報(bào)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，了解學(xué)生對(duì)科學(xué)研究的思路、方法及結(jié)果分析的掌握情況。其次，教師結(jié)合理論知識(shí)講解轉(zhuǎn)座子對(duì)其他基因表達(dá)調(diào)控及其在基因組進(jìn)化和基因功能研究方面的重要應(yīng)用價(jià)值。并以突變體為例，與學(xué)生探討D插入突變體的基因克隆技術(shù)和功能分析方法，拓展學(xué)生遺傳知識(shí)的深度與寬度。通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的討論不僅有助于提升學(xué)生實(shí)驗(yàn)總結(jié)能力，更能激發(fā)學(xué)生進(jìn)一步探索的興趣，課后一般會(huì)有超過(guò)半數(shù)的同學(xué)主動(dòng)聯(lián)系老師進(jìn)行研究性實(shí)驗(yàn)或創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目拓展。

3.2 引導(dǎo)學(xué)生進(jìn)行研究性實(shí)驗(yàn)

針對(duì)部分對(duì)該突變材料和基因克隆感興趣的同學(xué)，引導(dǎo)他們利用開(kāi)放實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，自行開(kāi)展材料的基因克隆研究。教學(xué)方法為：

首先老師與學(xué)生通過(guò)課堂討論和文獻(xiàn)資料查閱了解插入突變體材料的基因克隆方法，與基因的圖位克隆方法相比較，并設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案。圖位克隆又稱(chēng)定位克隆，用該方法分離基因的實(shí)質(zhì)是尋找與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，無(wú)需預(yù)先知道基因的DNA順序，但因需要構(gòu)建遺傳分離群體而耗時(shí)較長(zhǎng)。就插入突變體而言，由于插入序列是已知的，可以作為插入位點(diǎn)的分子標(biāo)簽采用其他途徑克隆目的基因。在此基礎(chǔ)上，要求學(xué)生進(jìn)一步查閱資料、閱讀文獻(xiàn)拿出插入突變體基因克隆可供選擇的多種方案(例如反向PCR和TAIL-PCR等)，通過(guò)比較分析，選用其中一種方法開(kāi)展研究。在此過(guò)程中，教師需及時(shí)跟進(jìn)、解疑答惑，并做好引導(dǎo)。教學(xué)實(shí)踐表明，幾乎所有學(xué)生均會(huì)優(yōu)先考慮選用TAIL-PCR方法進(jìn)行該突變體的基因克隆。

確定采用TAIL-PCR方法后，師生共同討論、制定并修改完善實(shí)驗(yàn)方案，根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案開(kāi)展基因克隆研究，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中教師實(shí)時(shí)跟進(jìn)指導(dǎo)。雖然TAIL-PCR擴(kuò)增核酸的基本原理與普通PCR無(wú)異，但是需要研究者對(duì)基本的PCR擴(kuò)增原理和影響因素有深刻的理解和把握。TAIL-PCR需3輪擴(kuò)增，前一輪產(chǎn)物稀釋后用作后一輪擴(kuò)增的模板，而且每輪的擴(kuò)增尤其第一輪PCR擴(kuò)增程序比普通PCR復(fù)雜；同時(shí)TAIL-PCR引物又有退火溫度較高的嵌套式特異性引物和退火溫度較低的兼并引物之別(圖1)。這些都是有別于普通PCR的地方，也是該研究型實(shí)驗(yàn)教學(xué)的重點(diǎn)和難點(diǎn)。

TAIL-PCR 擴(kuò)增3′旁鄰序列如圖2C所示，特異擴(kuò)增的第三輪PCR產(chǎn)物可直接用于測(cè)序。獲得測(cè)序結(jié)果后，可指導(dǎo)學(xué)生利用公共核酸數(shù)據(jù)庫(kù)(National Center for Biotechnology Information)進(jìn)行初步的生物信息學(xué)分析，例如BLAST比對(duì)等便可獲取目的基因的基本信息。本例的目的基因位于水稻第11染色體，屬于類(lèi)伸展蛋白基因家族。至此，插入突變體基因分離最關(guān)鍵的一步已完成。但是在實(shí)際教學(xué)中發(fā)現(xiàn)大多數(shù)學(xué)生需要重復(fù)多次才能獲得理想擴(kuò)增，在此過(guò)程中老師耐心指導(dǎo)尤為重要。實(shí)驗(yàn)最后，老師可結(jié)合TAIL-PCR電泳結(jié)果(如圖2C)提出如何判斷TAIL-PCR產(chǎn)物是否為特異擴(kuò)增產(chǎn)物(由于特異引物是嵌套式的，第三輪產(chǎn)物比第二輪產(chǎn)物要小，可據(jù)此判別是否為特異擴(kuò)增產(chǎn)物)，分析研究結(jié)果及問(wèn)題，撰寫(xiě)研究論文及研究報(bào)告。當(dāng)然，后續(xù)有關(guān)基因功能的研究還有很多方面可以引導(dǎo)學(xué)生作進(jìn)一步的思考。

4 教學(xué)中的思考與探索

該綜合性實(shí)驗(yàn)融合了種子科學(xué)、經(jīng)典遺傳學(xué)的孟德?tīng)栠z傳規(guī)律、基因組學(xué)的轉(zhuǎn)座因子和統(tǒng)計(jì)學(xué)方差分析等理論知識(shí)內(nèi)容，結(jié)合了表型觀測(cè)、PCR檢測(cè)技術(shù)、TAIL-PCR技術(shù)、基因克隆技術(shù)和方差分析法等實(shí)驗(yàn)內(nèi)容。該綜合性實(shí)驗(yàn)運(yùn)用“綜合性實(shí)驗(yàn)–研究性實(shí)驗(yàn)”的遞進(jìn)式教學(xué)體系，融合了“問(wèn)題引導(dǎo)式—傳授式—分組合作式—討論分析式”混合教學(xué)法[14,15]，以培養(yǎng)學(xué)生創(chuàng)新思維和方法為教學(xué)目標(biāo)，讓學(xué)生學(xué)會(huì)如何在科學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)問(wèn)題、分析問(wèn)題、提出問(wèn)題、研究問(wèn)題，最后得出科學(xué)研究結(jié)論；讓學(xué)生明白知識(shí)之間的聯(lián)系性和整體性，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)知識(shí)融會(huì)貫通；有助于學(xué)生在團(tuán)隊(duì)協(xié)作中提升解決問(wèn)題和創(chuàng)新實(shí)踐的能力，這也是科研成果轉(zhuǎn)化為本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)的一個(gè)有益探索。

但在教學(xué)實(shí)踐中，要使本課程達(dá)到最佳教學(xué)效果，還需要思考以下兩點(diǎn)：首先，本實(shí)驗(yàn)所使用的材料來(lái)源于科學(xué)研究，與其相關(guān)的理論背景知識(shí)涉及不完全顯性遺傳與基因突變中的轉(zhuǎn)座因子，然而這部分理論知識(shí)在遺傳學(xué)理論教學(xué)中不是重點(diǎn)講解內(nèi)容，容易被學(xué)生忽視。因此在實(shí)驗(yàn)教學(xué)的過(guò)程中，需要將這部分理論知識(shí)整合進(jìn)去，不僅讓學(xué)生通過(guò)實(shí)驗(yàn)可以理解，更希望能引導(dǎo)學(xué)生將顯性與不完全顯性遺傳、跳躍基因與轉(zhuǎn)座子、轉(zhuǎn)座因子的分類(lèi)及其與基因突變進(jìn)行對(duì)比分析，并將它們?nèi)跁?huì)貫通；其次，綜合性實(shí)驗(yàn)和研究性實(shí)驗(yàn)在教學(xué)中是層層遞進(jìn)式關(guān)系，在培養(yǎng)學(xué)生綜合創(chuàng)新能力上發(fā)揮著不可替代的作用。綜合性實(shí)驗(yàn)是學(xué)生進(jìn)入科學(xué)研究領(lǐng)域前的傳送帶，旨在激發(fā)學(xué)生的研究興趣，并使其掌握基本的研究方法和實(shí)驗(yàn)技能。研究性實(shí)驗(yàn)是學(xué)生進(jìn)入科學(xué)研究領(lǐng)域的縮影，旨在讓學(xué)生經(jīng)歷科學(xué)研究的過(guò)程，了解科學(xué)研究方法，進(jìn)而培養(yǎng)學(xué)生創(chuàng)新思維及解決問(wèn)題的能力。在綜合性實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與教學(xué)過(guò)程中，如何加強(qiáng)綜合性實(shí)驗(yàn)與研究性實(shí)驗(yàn)的關(guān)聯(lián)性與整體性，激發(fā)學(xué)生研究的興趣，引導(dǎo)學(xué)生進(jìn)入研究性實(shí)驗(yàn)，一直是我們教學(xué)過(guò)程中需要不斷思考與創(chuàng)新的地方。

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Design and exploration of genetic comprehensive experiments based oninsertion mutants

Nan Li1, Yajuan Li1, Haibin Guo1, Xiangqian Zhang2

The cultivation of innovative abilities has become an important guide for higher education in China. Strengthening the integrated knowledge to design experiments is an effective way to improve undergraduate students’ innovative abilities. Herein we designed a comprehensive experiment for molecular genetics by utilizing a riceinsertion mutant identified previously in our research project. In the comprehensive experiment, we adopt the method of scientific research as the main line of teaching and take the interesting phenotype of the rice mutant as the breakthrough point to reform and innovate genetics laboratory teaching. On the basis of this, we combined the progressive teaching method and guided the students to learn the TAIL-PCR skill and conduct an innovative experiment through expanding their knowledge. The comprehensive experiment will deepen students’ understandings of the relationship between genotypes and phenotypes, help them master the effective way of thinking and technologies for scientific research to further improve their ability of the integrated application capability of theory and practices.

comprehensive experiment; experimental teaching; gene mutation

2019-09-26;

2019-11-01

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(編號(hào)：30900884，31671594)和華南農(nóng)業(yè)大學(xué)2017年教學(xué)改革與研究項(xiàng)目(編號(hào)：JG17093)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos. 30900884, 31671594) and Teaching Reform and Research Projects of SCAU in 2017 (No. JG17093)]

李楠，碩士，實(shí)驗(yàn)師，研究方向：遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)與管理。E-mail: 523155900@qq.com

張向前，博士，副教授，研究方向：植物分子育種。E-mail: aacrav@163.com

10.16288/j.yczz.19-149

2019/11/7 14:34:00

URI: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20191107.1151.002.html

(責(zé)任編委: 陳德富)