皂角刺配方顆粒HPLC指紋圖譜研究

姚 娜，黃燕明，陳桂生，李雪銀，康志英

(1.廣州市香雪制藥股份有限公司，廣東 廣州 510663；2.寧夏隆德縣六盤山中藥資源開發(fā)有限公司，寧夏 固原 756300)

皂角刺為豆科植物皂莢GleditsiasinensisLam.的干燥棘刺。全年均可采收，干燥或趁鮮切片干燥。其具有消腫托毒、排膿、殺蟲的功效。臨床上用于癰疽初起或膿成不潰；外治疥癬麻風[1]。皂角刺中的主要化學成分研究有相關報道，其中皂角刺飲片含有黃酮類、皂莢皂苷類、氨基酸類、酚類、棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞甾醇、谷甾醇以及二十九碳烷等成分[2-4]；皂角刺的水提取液中含有黃酮、皂苷、酚類、有機酸、糖或苷類等化合物[5]。據(jù)文獻可知，皂角刺具有抑菌、抗病毒、提高免疫力、抗氧化、抗腫瘤、抗凝血、抑制血栓形成、抑制靜脈血管內(nèi)皮細胞增殖等作用[6-7]。中藥配方顆粒也叫免煎中藥飲片，它具有安全、穩(wěn)定、方便、快捷的特點。皂角刺配方顆粒是以皂角刺飲片為原料，經(jīng)水提、分離、濃縮、干燥、制粒、包裝等工藝制備而成。由于皂角刺配方顆粒是經(jīng)過多道工序制備而成，已不再具備飲片的性狀與結構特征。為了更全面、準確地評價皂角刺配方顆粒的質(zhì)量，本文采用HPLC-DAD法對其指紋圖譜方法進行研究，結果該方法穩(wěn)定性、重復性好，可作為皂角刺配方顆粒質(zhì)量控制方法。

1 儀器與試藥

十萬分之一電子分析天平(MS205DU，瑞士Mettler toledo公司)；超純水器(Simplicity，美國密理博Millipore公司)；數(shù)控超聲波清洗器(KQ500DE，昆山市超聲儀器有限公司)；Ultimate3000 DIONEX高效液相色譜儀；Agilent 1200高效液相色譜儀。

皂角刺對照藥材(中國食品藥品檢定研究院，121210-201003，規(guī)格：1 g/瓶)；乙腈為色譜級；甲醇、正丁醇、氨水均為分析純。

10批皂角刺配方顆粒均來自廣州市香雪制藥股份有限公司(批號依次為01～10)；麥芽糊精來自中糧生化能源(公主嶺)有限公司。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(柱長為25 cm，內(nèi)徑為4.6 mm，粒徑為5 μm)；以乙腈為流動相A，以水為流動相B，按下表中的規(guī)定進行梯度洗脫；檢測波長為203 nm；柱溫30 ℃。見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序

2.2 參照物溶液的制備

取皂角刺對照藥材適量，精密稱定，加水適量，回流提取1 h，過濾，濾液蒸干，殘渣加甲醇使溶解，轉移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取皂角刺配方顆粒約1 g，研細，精密稱定，置錐形瓶中，加入1 g硅藻土，混勻，精密加入甲醇10 mL，超聲處理30 min(功率300 W，頻率40 kHz)，過濾，濾液蒸干，殘渣加水10 mL使溶解，轉移至分液漏斗中，加入氨水10 mL、正丁醇20 mL，充分振搖，靜置，分層，分取正丁醇層，蒸干，殘渣加甲醇使溶解，轉移至10 mL量瓶，加甲醇至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4 測定法

分別精密吸取參照物溶液與供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀，測定，記錄色譜。

2.5 10批樣品的檢測結果

分別取10批皂角刺配方顆粒，按“2.3”項下方法制備10份供試品溶液，按“2.1”項下的色譜條件測定，得到10批皂角刺配方顆粒的色譜疊加圖，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012.1版》對10批皂角刺配方顆粒指紋圖譜進行計算，相似度達0.997以上。結果見圖1-圖2和表2。

圖1 10批皂角刺配方顆粒HPLC特征圖譜疊加

圖2 皂角刺配方顆粒HPLC指紋圖譜共有模式

表2 10批皂角刺配方顆粒HPLC指紋圖譜的相似度評價結果

2.6 指紋圖譜中共有峰的確認

通過對10批皂角刺配方顆粒的HPLC指紋圖譜進行分析，有9個色譜峰能穩(wěn)定重現(xiàn)，故確立了9個共有峰。經(jīng)與皂角刺對照藥材進行比對，4-9號共有峰的保留時間及紫外光譜與皂角刺對照藥材均吻合。Zhou L等[8]從皂角刺中分離得到黃酮類成分——表兒茶素。黃桂華[9]對皂角刺的飲片進行了紫外光譜掃描，鄒盛勤等[10]和徐春玉[11]對表兒茶素進行了紫外光譜掃描，其圖譜形狀以及最大吸收波長均與上述共有峰的紫外光譜相似。故推測上述共有峰為皂角刺的表兒茶素類成分，且其峰面積均大于總峰面積的3%，因此擬定4～9號共有峰為特征峰1～6號。

2.7 特征圖譜方法學考察

2.7.1 專屬性試驗 取皂角刺配方顆粒、麥芽糊精及皂角刺對照藥材分別按“2.3”項下方法制備，按“2.1”項下的色譜條件測定，見圖3，結果表明，6個共有色譜峰的鑒定均不受溶劑及輔料等因素干擾，具有良好的專屬性。

A．皂角刺配方顆粒，B．陰性對照，C．空白溶劑，D．皂角刺對照藥材

2.7.2 精密度試驗 取同一批皂角刺配方顆粒供試品溶液，按“2.1”項下的色譜條件于高效液相色譜儀上連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012.1版》進行相似度評價，結果各圖譜共有峰與對照指紋圖相似度均達1.000，表明該儀器精密度良好。

2.7.3 重復性試驗 取同一批皂角刺配方顆粒樣品，平行6份，按“2.3”項下方法制備，按“2.1”項下的色譜條件分別進樣，記錄色譜圖。結果各圖譜特征峰的相似度均達0.999以上，表明該方法重復性良好。

2.7.4 穩(wěn)定性試驗 取同一份皂角刺配方顆粒供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，分別在0、2、4、6、8、12、24、48 h進樣，記錄色譜圖，結果各圖譜共有峰的相似度均達0.999以上，表明該供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7.5 中間精密度試驗 分別考察不同分析人員、不同日期、不同設備對精密度的影響，結果各圖譜共有峰的相似度均達0.998以上，表明該方法中間精密度良好，隨機變動因素不影響該方法精密度。

2.7.6 耐用性實驗 取同一批皂角刺配方顆粒供試品，按“2.3”項下方法處理樣品，分別使用Agilent Zorbax Eclipse Plus C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Dikma Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Welch Ultimate XB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)三種型號的色譜柱，按上述色譜條件分別進樣，記錄色譜圖。結果在不同色譜柱因素變動的條件下，各圖譜共有峰的相似度均達0.980以上，表明該方法耐用性良好。

3 討論

本研究對不同實驗條件進行優(yōu)化，考察了不同的流動相體系，包括乙腈-0.5%磷酸，乙腈-0.1%磷酸，乙腈-水等；全波長掃描考察了不同波長下供試品的指紋圖譜。最終選取在203 nm下，乙腈-水梯度洗脫，該條件下譜圖色譜峰信息豐富，分離度好，穩(wěn)定性好，適合指紋圖譜研究要求。

根據(jù)相似度計算軟件得到10批皂角刺配方顆粒的對照圖譜及各批樣品與對照圖譜之間的相似度，結果均大于0.98，表明各批次樣品之間相關性較好，投料所用皂角刺原藥材質(zhì)量較穩(wěn)定，皂角刺配方顆粒工藝穩(wěn)定。

綜上所述，本實驗中建立的采用HPLC法檢測皂角刺配方顆粒指紋圖譜方法的穩(wěn)定性、重復性好，為皂角刺配方顆粒質(zhì)量控制和評價提供了參考。