Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化燙狗脊炮制工藝

李 丹，王小康，吳建偉，張志超，劉江紅

(深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院 藥學(xué)部，廣東 深圳 518110)

狗脊為蚌殼蕨科植物金毛狗脊Cibotiumbarometz(L.)J.Sm.的干燥根莖，其主要成分為酚酸類、黃酮類、皂苷類、揮發(fā)油及多糖[1-2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明狗脊具有抗骨質(zhì)疏松、抑菌抗炎、抗風(fēng)濕、抗氧化及保肝等多種藥理活性[3-6]。狗脊具有祛風(fēng)濕、補(bǔ)肝腎、強(qiáng)腰膝多種功效，臨床主要用于風(fēng)濕痹痛、腰膝酸軟、下肢無(wú)力等癥的治療[7]?！吨兴幣谥平?jīng)驗(yàn)集成》一書(shū)記載，狗脊的炮制方法主要有酒蒸、炒焦、砂燙、土炒、酒炒、酒砂炒、鹽水煮等[8]。燙狗脊為2015年版《中國(guó)藥典》狗脊項(xiàng)下唯一收載的炮制品，但是目前鮮見(jiàn)對(duì)燙狗脊炮制規(guī)范的研究報(bào)道。在已報(bào)道的文獻(xiàn)中存在關(guān)鍵炮制工藝參數(shù)尚不明確等問(wèn)題，如砂量比、砂燙時(shí)間、砂燙溫度等，并且炮制工藝參數(shù)在不同文獻(xiàn)中也有很大差異[9-10]，不利于燙狗脊的規(guī)范化生產(chǎn)。因此，本研究以燙狗脊中原兒茶酸的含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用單因素考察結(jié)合Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)的方法對(duì)燙狗脊的炮制工藝進(jìn)行研究，為規(guī)范燙狗脊的炮制工藝提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

Waters e2695高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)；Milli-Q Direct超純水儀(默克股份有限公司)；BP211D電子分析天平(德國(guó)賽多利斯公司)；KQ5000-DE超聲波清洗儀(昆山儀器股份有限公司)；乙腈、冰乙酸(默克股份有限公司，色譜純)；水為超純水；甲醇試劑為分析純(天津市富宇精細(xì)化工有限公司)；原兒茶酸對(duì)照品(批號(hào)2 110753-201817)，狗脊藥材采自廣東省肇慶市，由深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院藥學(xué)部劉江紅副主任藥師鑒定為蚌殼蕨科植物金毛狗脊Cibotiumbarometz(L.)J.Sm.的干燥根莖，用于燙狗脊的炮制研究。

2 方法與結(jié)果

2.1 原兒茶酸的定量分析方法

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-1%冰乙酸(5∶95)進(jìn)行等度洗脫；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.1.2 對(duì)照品溶液制備 取原兒茶酸對(duì)照品適量，精密稱定，置于容量瓶中，用甲醇-1%冰乙酸(70∶30)配制成質(zhì)量濃度為534.86 g·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，置于容量瓶中，加甲醇-1%冰乙酸(70∶30)配制成質(zhì)量濃度分別為267.43、133.72、66.86、33.43、16.71 g·mL-1的系列對(duì)照品溶液。

2.1.3 供試品溶液制備 取本品粉末(過(guò)三號(hào)篩)約1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇-1%冰醋酸溶液(70∶30)混合溶液25 mL，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇-1%冰醋酸溶液(70∶30)混合溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性關(guān)系考察 取“2.1.2”項(xiàng)下系列對(duì)照品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下的條件進(jìn)行測(cè)定，以質(zhì)量濃度C(g·mL-1)為橫坐標(biāo)，峰面積A為縱坐標(biāo)，計(jì)算原兒茶酸的線性回歸方程。結(jié)果顯示，回歸方程為Y=985.18X+931.25，r=0.999 5，表明原兒茶酸在16.71～534.86 g·mL-1的濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，見(jiàn)圖1。

2.2.2 精密度試驗(yàn) 取“2.1.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液1份，按照“2.1.1”項(xiàng)下條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示原兒茶酸峰面積RSD為0.34%，表明儀器精密度良好。

2.2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批燙狗脊樣品，按照“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，按“2.1.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算原兒茶酸的含量。結(jié)果顯示原兒茶酸的含量RSD為0.75%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批燙狗脊供試品溶液，分別于 放置0、3、6、9、18、24 h后，按“2.1.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果顯示原兒茶酸的峰面積RSD為0.65%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.2.5 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的燙狗脊樣品3份，每份 0.5 g，分別按供試品中原兒茶酸含量的50%、100%、150%精密加入對(duì)照品，每個(gè)質(zhì)量濃度平行測(cè)定3份，按“2.1.3”項(xiàng)下方法分別制備供試溶液，再按照“2.1.1”色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各成分的含量，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示原兒茶酸的平均加樣回收率為96.45%，RSD為1.01%，表明本方法加樣回收率良好。

圖1 原兒茶酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線

a.原兒茶酸

2.3 單因素試驗(yàn)

2.3.1 不同砂量比 準(zhǔn)確稱取狗脊藥材6份，每份50 g，固定其他條件，考察砂量比1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1對(duì)原兒茶酸含量的影響。砂量比的大小將會(huì)影響藥材的均勻受熱，因此最終會(huì)影響藥材的炮制質(zhì)量。由圖3可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)砂量倍數(shù)為4∶1時(shí)，原兒茶酸的含量達(dá)到最大，然而隨著砂量比的增大，原兒茶酸的含量趨于飽和。

圖3 砂量比對(duì)原兒茶酸含量的影響(n=3)

2.3.2 不同砂燙時(shí)間 準(zhǔn)確稱取狗脊藥材5份，每份50 g，固定其他條件，考察砂燙時(shí)間2、4、6、8、10 min對(duì)原兒茶酸含量的影響。由圖4可以發(fā)現(xiàn)，砂燙6 min時(shí)原兒茶酸的含量達(dá)到最大，隨著砂燙時(shí)間的增加，原兒茶酸的含量反而有減小的趨勢(shì)。這可能是隨著炮制時(shí)間的增加，炮制品斷面顏色逐漸加深出現(xiàn)焦糊，導(dǎo)致有效成分碳化分解[11]。

圖4 砂燙時(shí)間對(duì)原兒茶酸含量的影響(n=3)

2.3.3 不同砂燙溫度 準(zhǔn)確稱取狗脊藥材5份，每份50 g，固定其他條件，考察砂燙溫度150、180、210、240、270、300 ℃對(duì)原兒茶酸含量的影響。由圖5可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溫度為210 ℃時(shí)原兒茶酸的含量達(dá)到最大，隨著溫度的增加，原兒茶酸的含量反而減小。推測(cè)為隨著溫度的升高，炮制品容易焦化，導(dǎo)致有效成分碳化分解[11]。

圖5 砂燙溫度對(duì)原兒茶酸含量的影響(n=3)

2.4 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.4.1 建立模型及方差分析 為了得到燙狗脊的最佳炮制工藝參數(shù)，繼續(xù)采用Box-Behnken響應(yīng)面法對(duì)單因素考察結(jié)果再進(jìn)一步優(yōu)化。以砂量比(A)、砂燙時(shí)間(B)和砂燙溫度(C)作為自變量，選取3個(gè)水平(0，±1)建立模型對(duì)燙狗脊的炮制工藝進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)因素及水平

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

續(xù)表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 回歸模型方差分析

注：**P<0.01，差異顯著；*P<0.05，差異顯著。

2.5 最優(yōu)炮制工藝預(yù)測(cè)及驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)建立二次回歸方程模型及響應(yīng)面圖，預(yù)測(cè)到燙狗脊的最佳炮制工藝為砂量比4.67∶1、砂燙時(shí)間為5.87 min、砂燙溫度177.99 ℃，預(yù)測(cè)原兒茶酸的含量為0.931 mg/g?？紤]到實(shí)際操作，炮制工藝調(diào)整為砂量比4.5∶1、砂燙時(shí)間為6 min和砂燙溫度180 ℃，其中預(yù)測(cè)的砂燙溫度在2015版《中國(guó)藥典》四部通則推薦的溫度范圍之內(nèi)，證明該優(yōu)化條件的合理性。此外，根據(jù)以上條件進(jìn)行3次炮制工藝平行驗(yàn)證，原兒茶酸的含量分別為0.941 mg/g、0.949 mg/g、0.952 mg/g，含量均值為0.947 mg/g，RSD為0.66%。實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值基本一致，偏差率小于1%，說(shuō)明所建立模型基本可靠。

圖6 砂量比(A)、砂燙時(shí)間(B)和砂燙溫度(C)對(duì)原兒茶酸含量(Y)交互作用響應(yīng)面

3 結(jié)論

2015年版《中國(guó)藥典》以原兒茶酸作為燙狗脊的含量測(cè)定指標(biāo)。本研究前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)炮制過(guò)程中燙狗脊原兒茶酸的含量主要受砂量比、砂燙時(shí)間、砂燙溫度的影響較大，各因素之間對(duì)原兒茶酸的含量也存在著交叉影響。砂燙時(shí)間過(guò)久或溫度過(guò)高均會(huì)引起炮制品碳化，導(dǎo)致有效成分分解，說(shuō)明尋找合理的炮制參數(shù)是非常關(guān)鍵的。因此，本研究通過(guò)Box-Behnken響應(yīng)面法對(duì)單因素考察結(jié)果進(jìn)一步優(yōu)化，所建立模型總決定系數(shù)r2=0.982 1，模型擬合度高并且能解釋98.21%的試驗(yàn)數(shù)據(jù)變異性，可以較好地預(yù)測(cè)燙狗脊原兒茶酸與砂燙溫度、砂燙時(shí)間、砂燙溫度之間的變化關(guān)系。各因素對(duì)原兒茶酸含量的影響順序?yàn)椋荷盃C時(shí)間>砂燙溫度>砂量比。根據(jù)模型預(yù)測(cè)到燙狗脊的最優(yōu)炮制工藝為砂量比4.67∶1、砂燙時(shí)間為5.87 min、砂燙溫度177.99 ℃，預(yù)測(cè)原兒茶酸的含量為0.931 mg/g。通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證設(shè)計(jì)方案的可靠性，實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值的偏差率較小，建立模型基本可靠，可為規(guī)范燙狗脊的炮制工藝提供更多的科學(xué)依據(jù)。