2種中國(guó)櫻桃果實(shí)有機(jī)酸積累及代謝相關(guān)酶活性的研究

李 航，陶海青，陳益香，龔成宇，楊 科，龔榮高

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，成都 611130)

中國(guó)櫻桃(CerasuspseudocerasusLindl.)隸屬薔薇科李亞科櫻屬，起源于中國(guó)，有著3000余年的栽培歷史[1]，是世界四大櫻桃栽培種之一[2]，果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富，富含磷、鐵、維生素C和胡蘿卜素等[3-4]，一直深受消費(fèi)者的喜愛(ài)。己有的研究表明，果實(shí)中的有機(jī)酸種類(lèi)、質(zhì)量分?jǐn)?shù)及其構(gòu)成比例和形成動(dòng)態(tài)是果實(shí)風(fēng)味形成的重要基礎(chǔ)[5]，果實(shí)中有機(jī)酸組分很多，但大多數(shù)果實(shí)通常以1種或2種有機(jī)酸為主，其他僅以少量或微量存在。有機(jī)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)與果實(shí)的酸度有顯著的相關(guān)性，不僅對(duì)平衡果實(shí)的風(fēng)味非常重要[6]，而且在果實(shí)的光合作用，呼吸作用，以及成酚類(lèi)、酯類(lèi)和氨基酸的合成中發(fā)揮重要作用[7]。果實(shí)中有機(jī)酸的合成代謝途徑受代謝相關(guān)酶活性的調(diào)控(代謝途徑見(jiàn)圖1)[8-11]，其中調(diào)控蘋(píng)果酸代謝的酶主要包括蘋(píng)果酸脫氫酶(NAD-MDH)、蘋(píng)果酸酶(NADP-ME)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)。PEPC主要催化PEP生成OAA以及無(wú)機(jī)磷[12]，NAD-MDH能夠?qū)AA氧化成蘋(píng)果酸，從而快速降低OAA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)[13]；NADP-ME主要催化蘋(píng)果酸生成丙酮酸，對(duì)蘋(píng)果酸的降解起到催化作用，在成熟蘋(píng)果果實(shí)里的NADP-ME活性的增加能夠減少有機(jī)酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)[14]；而檸檬酸合成酶(CS)主要催化OAA和Ac-CoA縮合產(chǎn)生檸檬酸。中國(guó)櫻桃果實(shí)具有很高的食用價(jià)值，但目前果實(shí)有機(jī)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)偏高是中國(guó)櫻桃產(chǎn)業(yè)的問(wèn)題之一，研究中國(guó)櫻桃果實(shí)有機(jī)酸代謝對(duì)于中國(guó)櫻桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展有重大的理論和實(shí)踐意義，而且對(duì)于中國(guó)櫻桃果實(shí)中有機(jī)酸代謝機(jī)制的研究也相對(duì)較少。因此，本試驗(yàn)以‘黑櫻桃’和‘紅櫻桃’2種中國(guó)櫻桃為材料，測(cè)定中國(guó)櫻桃果實(shí)發(fā)育過(guò)程中有機(jī)酸組分及質(zhì)量分?jǐn)?shù)、相關(guān)酶活性，探討中國(guó)櫻桃果實(shí)發(fā)育過(guò)程中有機(jī)酸積累的機(jī)理，為進(jìn)一步研究果實(shí)有機(jī)酸代謝提供理論依據(jù)，同時(shí)為中國(guó)櫻桃生產(chǎn)栽培、品種選育、提高中國(guó)櫻桃果實(shí)品質(zhì)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

取樣地位于四川省雅安市漢源縣，屬亞熱帶季風(fēng)性氣候，冬暖夏涼，四季分明。年平均氣溫17.9 ℃，無(wú)霜期300 d，年平均日照時(shí)間1 475.8 h，年活動(dòng)積溫5 844.7 ℃，年均降雨量741.8 mm。

以漢源縣當(dāng)?shù)卦耘嗟摹跈烟摇汀t櫻桃’為試材，每種試材選擇樹(shù)勢(shì)中庸、生長(zhǎng)健壯、長(zhǎng)勢(shì)相近的10 a生植株5株作為供試植株，采用常規(guī)管理。盛花期開(kāi)始，從每株供試植株中選擇大小基本一致，具有代表性的花序掛牌標(biāo)記。

圖1 果實(shí)細(xì)胞有機(jī)酸代謝途徑Fig.1 Organic acid metabolism in fruit cell

1.2 取樣方法

在盛花后6、12、18、24、30、36、42 d取樣。在10株供試植株樹(shù)冠外圍1～2 m處取樣，每株選擇無(wú)病蟲(chóng)害、中等大小的果實(shí)40個(gè)，用冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室，用液氮速凍分裝后于-80 ℃超低溫冰箱中保存。

1.3 果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育動(dòng)態(tài)測(cè)定

果實(shí)單果質(zhì)量用萬(wàn)分之一天平測(cè)定，縱橫徑用數(shù)顯游標(biāo)卡尺測(cè)定。

1.4 有機(jī)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

蘋(píng)果酸、酒石酸、奎寧酸和檸檬酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定，提取和測(cè)定方法參考馬倩倩等[15]和張麗麗等[16]的方法并略加改進(jìn)。使用Agilent高效液相色譜儀(Agilent 1260Ⅱ)測(cè)定，色譜柱為C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為0.04 mol·L-1KH2PO4，柱溫為30 ℃，紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，流速 0.5 mL·min-1，進(jìn)樣量10 μL。

1.5 蔗糖代謝相關(guān)酶活性測(cè)定

酶液的制備，蘋(píng)果酸脫氫酶(NAD-MDH)、蘋(píng)果酸酶(NADP-ME)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)和檸檬酸合成酶(CS)活性的測(cè)定參考龔榮高等[17]和李甲明等[18]的方法，并略加改進(jìn)。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010和SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 2種中國(guó)櫻桃單果質(zhì)量變化

由圖2可見(jiàn)，2種中國(guó)櫻桃果實(shí)發(fā)育持續(xù)時(shí)間在42 d左右，2種櫻桃果實(shí)發(fā)育呈慢—快的生長(zhǎng)趨勢(shì)，在花后6～24 d(幼果期)單果質(zhì)量增長(zhǎng)速率較慢；花后30 d后果實(shí)進(jìn)入轉(zhuǎn)色膨大期，果實(shí)單果質(zhì)量迅速增加，推測(cè)此時(shí)期為2種中國(guó)櫻桃果實(shí)發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期；整個(gè)發(fā)育過(guò)程中‘紅櫻桃’單果質(zhì)量明顯高于‘黑櫻桃’，成熟時(shí)‘黑櫻桃’單果質(zhì)量為2.72±0.11 g，‘紅櫻桃’單果質(zhì)量為 3.74±0.17 g。

2.2 2種中國(guó)櫻桃縱橫徑變化

由圖3可見(jiàn)，在果實(shí)發(fā)育前期(花后6～ 24 d)，中國(guó)櫻桃果實(shí)縱徑大于橫徑，縱徑橫徑緩慢上升；從花后30 d開(kāi)始果實(shí)橫徑迅速上升，并明顯高于橫徑，橫徑變化較為平穩(wěn)。成熟時(shí)‘黑櫻桃’縱徑1.70±0.085 cm，橫徑1.87±0.086 cm，果形指數(shù)為0.92；‘紅櫻桃’縱徑1.66±0.084 cm，橫徑2.02±0.089 cm，果形指數(shù)為0.82。果實(shí)成熟時(shí)，‘黑櫻桃’果實(shí)指數(shù)高于‘紅櫻桃’，使得‘紅櫻桃’比‘黑櫻桃’果形更偏扁圓形，也與成熟時(shí)‘紅櫻桃’果實(shí)單果質(zhì)量大于‘黑櫻桃’相一致。

2.3 2種中國(guó)櫻桃果實(shí)有機(jī)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化

由圖4可見(jiàn)，在整個(gè)發(fā)育時(shí)期，2種中國(guó)櫻桃成熟果實(shí)中有機(jī)酸以蘋(píng)果酸為主，蘋(píng)果酸和酒石酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化趨勢(shì)和總酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化相近，總體呈先上升后降低的變化趨勢(shì)，花后13 d開(kāi)始，果實(shí)蘋(píng)果酸和總酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)開(kāi)始迅速上升，在花后30 d質(zhì)量分?jǐn)?shù)上升到最高，花后30 d開(kāi)始逐漸降低。發(fā)育期內(nèi)，‘黑櫻桃’奎寧酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化不大，‘紅櫻桃’奎寧酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)從花后30 d開(kāi)始呈降低的趨勢(shì)；2種中國(guó)櫻桃果實(shí)檸檬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈升高—降低—升高—降低的變化趨勢(shì)，在花后24 d檸檬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低，花后30 d質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，花后30 d開(kāi)始降低。

圖2 櫻桃果實(shí)發(fā)育過(guò)程單果質(zhì)量變化Fig.2 Changes of fruit mass during cherry fruit development

a.黑櫻桃 Heiyingtao；b.紅櫻桃 Hongyingtao

花后42 d果實(shí)成熟時(shí)‘黑櫻桃’蘋(píng)果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.62±0.15 mg·g-1，占總酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的89%；‘紅櫻桃’蘋(píng)果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.50±0.11 mg·g-1，占總酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的85%?？鼘幩岷蜋幟仕豳|(zhì)量分?jǐn)?shù)相近，‘黑櫻桃’奎寧酸和檸檬酸占總酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的5%和4%，‘紅櫻桃’奎寧酸和檸檬酸占總酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的9%和4%；酒石酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低，占總酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的1%。‘紅櫻桃’成熟果實(shí)中各有機(jī)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于‘黑櫻桃’。

2.4 2種中國(guó)櫻桃果實(shí)中有機(jī)酸代謝相關(guān)酶活性變化

2.4.1 蘋(píng)果酸脫氫酶活性 由圖5可以看出， 2種中國(guó)櫻桃果實(shí)蘋(píng)果酸脫氫酶(NAD-MDH)活性總體呈先升高再降低趨勢(shì)，與蘋(píng)果酸變化趨勢(shì)相近，在花后12～30 d NAD-MDH 活性呈上升趨勢(shì)，在花后30 d活性達(dá)到最高，‘黑櫻桃’為 12.39±0.62 U·g-1·min-1，高于‘紅櫻桃’的 11.39±0.41 U·g-1·min-1。花后30 d后NAD-MDH活性迅速下降，成熟時(shí)‘黑櫻桃’果實(shí)中NAD-MDH的活性最低，為3.85±0.21 U·g-1·min-1，‘紅櫻桃’為4.77±0.55 U·g-1·min-1，‘紅櫻桃’果實(shí)中NAD-MDH活性高于‘黑櫻桃’。兩者相比較而言，花后12 d前‘紅櫻桃’NAD-MDH活性有小幅度降低；‘黑櫻桃’NAD-MDH活性在花后12～30 d期間高于‘紅櫻桃’，花后30 d后，‘黑櫻桃’該酶降低幅度大于‘紅櫻桃’，‘紅櫻桃’該酶活性更高。

圖4 櫻桃果實(shí)發(fā)育過(guò)程酸組份質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化Fig.4 Changes in acid mass fraction during the development of cherry fruit

圖5 櫻桃果實(shí)發(fā)育過(guò)程蘋(píng)果酸脫氫酶活性變化Fig.5 Changes in NAD-MDH activity during the development of cherry fruit

2.4.2 蘋(píng)果酸酶活性 由圖6可以看出，2種櫻桃果實(shí)發(fā)育過(guò)程中蘋(píng)果酸酶(NADP-ME)活性總體呈先下降再上升的趨勢(shì)；花后30 d前NADP-ME活性持續(xù)下降且變化較為平穩(wěn)，在花后30 d下降到最低值，‘黑櫻桃’最低為0.04±0.02 U·g-1·min-1，‘紅櫻桃’最低為0.09±0.05 U·g-1·min-1；花后30 d后，2種櫻桃NADP-ME活性迅速上升，成熟時(shí)該酶活性到達(dá)最高，‘黑櫻桃’最高為1.12±0.07 U·g-1·min-1，‘紅櫻桃’最高為0.78±0.05 U·g-1·min-1。兩者相比較，花后24 d前NADP-ME活性變化趨勢(shì)相反，花后24 d后變化趨勢(shì)相同，從花后30 d開(kāi)始，‘黑櫻桃’NADP-ME活性一直高于‘紅櫻桃’。

圖6 櫻桃果實(shí)發(fā)育過(guò)程蘋(píng)果酸酶活性變化Fig.6 Changes in NADP-ME activity during the development of cherry fruit

2.4.3 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性 由圖7可以看出，2種櫻桃果實(shí)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)活性總體呈先升高再降低趨勢(shì)，在花后24 d前PEPC活性上升且變化平穩(wěn)，花后24～ 30 d迅速上升并到達(dá)峰值，‘黑櫻桃’最高為0.96±0.03 U·g-1·min-1，‘紅櫻桃’為0.99±0.05 U·g-1·min-1。果實(shí)發(fā)育后期(花后30～ 42 d)，2種櫻桃果實(shí)PEPC活性迅速下降，果實(shí)成熟時(shí)降至最低，‘黑櫻桃’最低為0.32±0.05 U·g-1·min-1，‘紅櫻桃’為0.31±0.04 U·g-1·min-1。2種櫻桃相比較，‘黑櫻桃’果實(shí)PEPC活性在整個(gè)發(fā)育期內(nèi)都高于‘紅櫻桃’。

圖7 櫻桃果實(shí)發(fā)育過(guò)程磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性變化Fig.7 Changes in PEPC activity during the development of cherry fruit

2.4.4 檸檬酸合成酶活性 圖8顯示，‘黑櫻桃’果實(shí)CS活性整體呈下降趨勢(shì)，‘紅櫻桃’CS活性整體呈上升趨勢(shì)；2種櫻桃果實(shí)CS活性在發(fā)育前期(花后6～18 d)變化平穩(wěn)，花后24 d CS活性迅速降低后，在花后30 d迅速上升至峰值，‘黑櫻桃’最高為0.18±0.004 U·g-1·min-1，‘紅櫻桃’為0.21±0.01 U·g-1·min-1。果實(shí)發(fā)育后期(花后30～42 d)，2種櫻桃CS活性迅速下降至果實(shí)成熟，成熟時(shí)‘黑櫻桃’果實(shí)CS活性為 0.10±0.01 U·g-1·min-1，‘紅櫻桃’為 0.16±0.002 U·g-1·min-1。兩者相比較，從花后 12 d開(kāi)始，‘紅櫻桃’CS活性一直高于‘黑 櫻桃’。

圖8 櫻桃果實(shí)發(fā)育過(guò)程檸檬酸合成酶活性變化Fig.8 Changes in citrate synthetase (CS) activity during the development of cherry fruit

2.5 中國(guó)櫻桃果實(shí)中酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)與相關(guān)酶活性相關(guān)性

由表1可以看出，在果實(shí)發(fā)育期內(nèi)，‘黑櫻桃’果實(shí)蘋(píng)果酸和總酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)也與蘋(píng)果酸脫氫酶(NAD-MDH)活性呈極顯著正相關(guān)(R2= 0.886**,R2=0.892**)，與蘋(píng)果酸酶(NADP-ME)和檸檬酸合成酶(CS)活性呈負(fù)相關(guān)，蘋(píng)果酸、酒石酸和總酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)與磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)活性呈極顯著正相關(guān)(R2= 0.918**,R2=0.907**,R2=0.914**)，酒石酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)與蘋(píng)果酸酶(NADP-ME) 活性呈極顯著負(fù)相關(guān)(R2=-0.886**)；‘紅櫻桃’果實(shí)蘋(píng)果酸和總酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)與蘋(píng)果酸脫氫酶(NAD-MDH)活性呈顯著正相關(guān)(R2=0.801*,R2= 0.788*)，與磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)活性呈顯著正相關(guān)(R2=0.855*,R2=0.855*)，與蘋(píng)果酸酶(NADP-ME)活性呈負(fù)相關(guān)，檸檬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)與檸檬酸合成酶(CS)活性呈正相關(guān)。由此可知，NAD-MDH、PEPC在櫻桃果實(shí)有機(jī)酸積累過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。

表1 中國(guó)櫻桃果實(shí)有機(jī)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)與代謝相關(guān)酶的相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis between organic acid mass fraction and metabolic related enzymes in Chinese cherry fruit

注：** 代表極顯著性相關(guān)(P<0.01)；*代表顯著性相關(guān)(P<0.05)。

Note：** means highly significant correlation(P<0.01); * means significant correlation (P<0.05).

3 討 論

許多果實(shí)中主要有機(jī)酸在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中呈現(xiàn)前期上升后期下降的變化趨勢(shì)[19]，如砂梨[20]、石榴[21]和杏[22]等。本試驗(yàn)中，2種中國(guó)櫻桃果實(shí)有機(jī)酸積累以蘋(píng)果酸為主，成熟時(shí)果實(shí)中蘋(píng)果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)占總酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)85%以上，而其他有機(jī)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)很低，屬于蘋(píng)果酸型果實(shí)，與甜櫻桃[23]、蘋(píng)果[24]和枇杷[25]上的研究結(jié)果相似。成熟時(shí)‘黑櫻桃’果實(shí)較低的有機(jī)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)決定了其風(fēng)味相對(duì)于‘紅櫻桃’的優(yōu)勢(shì)。

雖然有機(jī)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)過(guò)高會(huì)導(dǎo)致果實(shí)風(fēng)味變差，但在果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育中占據(jù)重要作用，有機(jī)酸的積累受到有機(jī)酸代謝相關(guān)酶調(diào)控。本試驗(yàn)中，NAD-MDH和PEPC活性與蘋(píng)果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化趨勢(shì)大致相同，呈顯著正相關(guān)，2種中國(guó)櫻桃蘋(píng)果酸積累的差異主要與2種酶活性高低有關(guān)。櫻桃果實(shí)中NADP-ME活性與蘋(píng)果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化趨勢(shì)相反，呈負(fù)相關(guān)，2種中國(guó)櫻桃果實(shí)進(jìn)入轉(zhuǎn)色期后蘋(píng)果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降與NADP-ME活性迅速升高有關(guān)，果實(shí)成熟時(shí)，NADP-ME活性升高使得蘋(píng)果酸開(kāi)始分解，造成蘋(píng)果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降，而2種中國(guó)櫻桃果實(shí)發(fā)育后期NADP-ME活性的差異也是導(dǎo)致成熟時(shí)蘋(píng)果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異的原因，與在桃、果梅和蘋(píng)果等果實(shí)中NAD-MDH和PEPC調(diào)控蘋(píng)果酸的合成，NADP-ME調(diào)控蘋(píng)果酸分解的結(jié)果相一致[23-25]。本試驗(yàn)中，2種中國(guó)櫻桃果實(shí)中CS活性較低，更多的OAA在NAD-MDH作用下合成蘋(píng)果酸，導(dǎo)致檸檬酸在果實(shí)中質(zhì)量分?jǐn)?shù)低，但相關(guān)性分析表明2種櫻桃果實(shí)中CS活性都和檸檬酸顯著相關(guān)，CS是2種中國(guó)櫻桃調(diào)控檸檬酸合成的關(guān)鍵酶，與郭潤(rùn)姿等[26]在蘋(píng)果酸積累型果實(shí)黃冠梨中發(fā)現(xiàn)檸檬酸的積累與CS活性呈極顯著正相關(guān)的結(jié)果相似。在2種中國(guó)櫻桃果實(shí)發(fā)育的不同時(shí)期，果實(shí)有機(jī)酸積累和酸代謝酶的活性均不相同，有機(jī)酸的積累可能是多種酸代謝酶相互作用的結(jié)果，并通過(guò)影響果實(shí)內(nèi)有機(jī)酸的積累，進(jìn)而影響果實(shí)的風(fēng)味，決定果實(shí)的品質(zhì)。

4 結(jié) 論

‘黑櫻桃’和‘紅櫻桃’2種中國(guó)櫻桃果實(shí)有機(jī)酸以蘋(píng)果酸，檸檬酸和奎寧酸為主，其中蘋(píng)果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)遠(yuǎn)高于其他有機(jī)酸，在發(fā)育期內(nèi)呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，成熟時(shí)‘黑櫻桃’果實(shí)有機(jī)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于‘紅櫻桃’?；ê?0 d進(jìn)入轉(zhuǎn)色期為2種中國(guó)櫻桃果實(shí)發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期，進(jìn)入轉(zhuǎn)色期后果實(shí)有機(jī)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)開(kāi)始迅速降低。NAD-MDH、PEPC和NADP-ME是2種中國(guó)櫻桃蘋(píng)果酸代謝的關(guān)鍵酶，果實(shí)中有機(jī)酸積累不僅是各種酸代謝酶共同調(diào)控、相互作用影響有機(jī)酸的組分和質(zhì)量分?jǐn)?shù)，還可能與其他因素有關(guān)。