培養(yǎng)條件對(duì)木薯胚性愈傷組織中3種保護(hù)酶活性的影響

黎萍 李恒銳 楊海霞 梁振華 馬仙花 何文 劉連軍

摘要：以GR891木薯胚性愈傷組織為材料，常規(guī)保存（GD培養(yǎng)基+12.0 mg/L毒莠定+20 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂）培養(yǎng)基為對(duì)照（CK），研究處理培養(yǎng)基中添加不同濃度蔗糖（25、30、35、40 g/L）、甘露醇（20、30、40、50 g/L）和多效唑（4.0、6.0、8.0、10.0 mg/L）對(duì)木薯胚性愈傷組織保存40 d時(shí)超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）和過(guò)氧化氫酶（CAT）活性的影響。結(jié)果表明，在20 ℃條件下，處理組與對(duì)照組SOD、POD、CAT活性呈先升高后降低的趨勢(shì)，甘露醇和多效唑處理比蔗糖處理的3種保護(hù)酶活性高，下降的速度也較緩慢。與對(duì)照相比，蔗糖和甘露醇濃度均為 30 g/L 脅迫時(shí)，SOD、POD、CAT活性同時(shí)出現(xiàn)峰值，且一直維持較高水平;隨著多效唑濃度（4.0～8.0 mg/L）的升高，SOD、POD、CAT活性不斷升高，多效唑濃度為8.0 mg/L時(shí)木薯胚性愈傷組織中3種保護(hù)酶活性最高。說(shuō)明將木薯胚性愈傷組織保存在添加蔗糖或甘露醇30 g/L、多效唑8.0 mg/L的常規(guī)固體培養(yǎng)基上，可以有效地延長(zhǎng)木薯胚性愈傷細(xì)胞壽命，延緩保存時(shí)細(xì)胞的衰老。

關(guān)鍵詞：木薯;胚性愈傷組織;SOD;POD;CAT;蔗糖;甘露醇;多效唑

中圖分類號(hào)： S533.01?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）20-0080-04

木薯是世界三大薯類作物（木薯、馬鈴薯、甘薯）之一[1]。傳統(tǒng)的田間種植保存易受病蟲害、自然災(zāi)害及經(jīng)費(fèi)短缺等弊端的困擾，這使得大量的木薯資源面臨流失的可能。緩慢生長(zhǎng)保存法是對(duì)木薯胚性愈傷組織進(jìn)行離體種質(zhì)保存的重要手段，其易于控制，且便于種質(zhì)交流，需要時(shí)，能隨時(shí)將保存材料大量繁殖[2]。緩慢生長(zhǎng)保存是指通過(guò)添加滲透劑（蔗糖、甘露醇、山梨醇等）或生長(zhǎng)抑制劑（比久、多效唑、烯效唑等）提高培養(yǎng)基的滲透壓、改變植物生長(zhǎng)培養(yǎng)條件來(lái)限制培養(yǎng)物生長(zhǎng)，使植物組織因缺水而減弱新陳代謝，導(dǎo)致植物的細(xì)胞壁酶活性受到抑制，最終實(shí)現(xiàn)延緩生長(zhǎng)的目的。

細(xì)胞內(nèi)的保護(hù)酶系統(tǒng)主要包括超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）等。SOD是清除活性氧反應(yīng)過(guò)程中第1個(gè)發(fā)揮作用的抗氧化酶，且廣泛參與植物體在各種逆境脅迫下的生理生化反應(yīng)，對(duì)抗衰老和抗干旱都起到積極的作用[3]。POD是廣泛存在于植物體內(nèi)且功能較多的酶類，可清除活性氧，降低活性氧對(duì)細(xì)胞膜過(guò)氧化程度，減少膜脂過(guò)氧化，穩(wěn)定膜系統(tǒng)[4]。CAT是植物體內(nèi)的保護(hù)酶之一[5]，CAT和POD能作為愈傷組織生長(zhǎng)過(guò)程中增殖和衰老的標(biāo)志酶[6]。POD、CAT、SOD活性的變化與愈傷組織的生長(zhǎng)及分化過(guò)程密切相關(guān)。有關(guān)植物胚性愈傷組織離體保存與細(xì)胞內(nèi)保護(hù)酶系統(tǒng)活性變化的研究已有報(bào)道，黎金燕等的研究表明，培養(yǎng)基中附加1種抑制劑（DPI）可以促進(jìn)尾葉桉胚性愈傷組織的誘導(dǎo)，從而提高POD、CAT、SOD等抗氧化酶活性[7]。曾麗蘭等研究發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)濃度的甘露醇和蔗糖，不僅可以有效提高植物細(xì)胞活力，而且還可以提高植物胚性愈傷組織中SOD活性[3-8]。劉懷攀等研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加聚乙二醇（PEG）-6000和脫落酸（ABA）可以顯著提高水生蘆葦胚性愈傷組織中的CAT、POD活性[9]。葉煒等的研究表明，較高濃度的甘露醇處理可使胚性愈傷組織的SOD活性升高，考慮延緩衰老，均在培養(yǎng)基中加入20 g/L甘露醇以有效提高植物SOD活性[10-12]。目前，除黎萍等的報(bào)道[8]外，有關(guān)培養(yǎng)基成分與木薯胚性愈傷組織中的抗氧化酶活性之間的聯(lián)系尚未見報(bào)道。為探討SOD、POD、CAT活性與木薯胚性愈傷組織抗衰老之間的關(guān)系，研究在不同培養(yǎng)條件下保存40 d時(shí)木薯胚性愈傷組織中SOD、POD、CAT活性的變化，以期尋求一種更適合木薯離體種質(zhì)的高效長(zhǎng)期保存方法。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料

1.1.1?供試材料

以廣西亞熱帶作物研究所培育的木薯品種GR891為試驗(yàn)材料，對(duì)木薯嫩枝、側(cè)芽進(jìn)行水洗、滅菌，然后將其接種到MS+1.0 mg/L 6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）+0.5 mg/L萘乙酸（NAA）+25.0 g/L蔗糖+6.5 g/L 瓊脂的固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)45 d后獲得木薯試管苗。對(duì)無(wú)菌試管苗的腋芽采用MS改良培養(yǎng)基（MS+2 mol/L CuSO4+12 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸+20 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂）誘導(dǎo)胚性愈傷組織，然后用常規(guī)固體保存培養(yǎng)基（GD培養(yǎng)基+12.0 mg/L毒莠定+25.0 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂）進(jìn)行增殖培養(yǎng)，獲得繼代胚性愈傷組織。以上培養(yǎng)基pH值均為5.8，培養(yǎng)條件為（20±1） ℃，光照度為1 000～1 200 lx，光照時(shí)間為 16～18 h/d。

1.1.2?試驗(yàn)儀器

JJ500型電子分析天平，購(gòu)自常熟市雙杰測(cè)試儀器廠;SW-CJ-1FD型超凈工作臺(tái)，購(gòu)自蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;YZM-60B高壓滅菌鍋，購(gòu)自廣州豪爾生醫(yī)療設(shè)備有限公司;T6新世紀(jì)紫外分光光度計(jì)，購(gòu)自北京普析通用儀器有限公司;YR11-2A磁力攪拌器，購(gòu)自上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司;LRH-400-G光照培養(yǎng)箱，購(gòu)自韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司;CT15RT型高速冷凍離心機(jī)，購(gòu)自上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司。

1.1.3?試劑

愈創(chuàng)木酚，由天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所提供;氮藍(lán)四唑，由合肥博美生物科技有限責(zé)任公司進(jìn)口分裝;核黃素，購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠;甲硫氨酸，由合肥博美生物科技有限責(zé)任公司進(jìn)口分裝;Na3-乙二胺四乙酸（EDTA），購(gòu)自上海埃彼化學(xué)試劑有限公司;KH2PO4，購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.2?試驗(yàn)方法

1.2.1?培養(yǎng)條件對(duì)木薯胚性愈傷組織生長(zhǎng)保存的影響

在GD培養(yǎng)基+12.0 mg/L毒莠定+6.5 g/L瓊脂固體培養(yǎng)基中分別附加25、30、35、40 g/L蔗糖;在常規(guī)固體保存培養(yǎng)基上添加不同濃度甘露醇（20、30、40、50 g/L）和不同濃度的多效唑（4.0、6.0、8.0、10.0 mg/L）。選取繼代3～5代生長(zhǎng)良好的顆粒狀木薯胚性愈傷，接種在上述培養(yǎng)基中，以不添加任何物質(zhì)的常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)為對(duì)照（CK），每個(gè)處理接15皿，每培養(yǎng)皿接入胚性愈傷組織1 g，均放置在溫度為20 ℃，光照度為 1 500～2 000 lx，光照時(shí)間為16 h/d的溫室中培養(yǎng)，40 d后，分別測(cè)定SOD、POD、CAT活性的變化，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.2?測(cè)定方法

1.2.2.1?粗酶液的提取

稱取愈傷組織材料0.5 g，加入7倍體積0.1 mol/L磷酸緩沖液（含1%聚乙烯吡咯烷酮，pH值7.0）和少量石英砂，置于冷凍好的研缽中研磨成勻漿，將勻漿液移入離心管中并低溫抽提1 h，然后于4 ℃、15 000 r/min條件下離心 20 min。將上清液移至5 mL離心管中低溫保存，并記錄上清液的體積（V），所得的上清液即為含游離態(tài)SOD、POD、CAT的粗酶液。

1.2.2.2?SOD活性測(cè)定?SOD活性測(cè)定參考黎萍等的方法[8]并略加改進(jìn)，所需的反應(yīng)母液為0.05 mol/L pH值7.8磷酸緩沖液、130 mmol/L 甲硫氨酸（MET）溶液、750 μmol/L氮藍(lán)四唑溶液、100 μmol/L EDTA-Na2溶液、20 μmol/L核黃素溶液，其中，將EDTA-Na2溶液和核黃素溶液合并在一起配制，當(dāng)測(cè)定SOD活性時(shí)，將該混合液稀釋100倍再使用。取3只對(duì)照管和1只樣品管，添加一定量上述反應(yīng)母液（磷酸緩沖液1.7 mL，MET溶液0.3 mL，氮藍(lán)四唑溶液0.3 mL，EDTA-Na2溶液0.3 mL，核黃素溶液0.3 mL，酶液0.1 mL），然后往樣品管中添加2.0 mL酶液，3只對(duì)照管添加1.0 mL提取緩沖液來(lái)代替酶液，反應(yīng)體系的總量為3.0 mL。將1支對(duì)照管置于暗處，其余各管置于4 000 lx日光燈下反應(yīng) 30 min，然后立即取出置于暗處終止反應(yīng)。以避光管作為空白參比調(diào)零，分別測(cè)定其他各管在560 nm處的D值。以 1 min、1 g愈傷組織抑制NBT光化還原的50%來(lái)作為1個(gè)酶活性單位，用U/g表示，3次重復(fù)。

SOD活性=（Dc-Dt）×V/（0.5×Dc×Vt×m）。

式中：Dc為對(duì)照管吸光度;Dt為樣品管吸光度;V為樣品提取液總體積，mL;Vt為測(cè)定時(shí)樣品用量，mL;m為愈傷組織鮮質(zhì)量，g。

1.2.2.3?POD活性測(cè)定

過(guò)氧化物酶（POD）活性參考朱廣廉等的方法[13]并略加改進(jìn)，采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定，反應(yīng)混合液由50 mL 0.05 mol/L pH值6.0磷酸緩沖液、19 μL 30% H2O2、28 μL愈創(chuàng)木酚（原試劑）混合而成，配制時(shí)先將磷酸緩沖液與愈創(chuàng)木酚混合加熱溶解，冷卻后再加入H2O2混勻即可。當(dāng)進(jìn)行POD測(cè)定時(shí)，先往一個(gè)測(cè)定管中添加反應(yīng)混合液3 mL，以1 mL提取緩沖液代替酶液加入到該混合液中，混勻后作為空白對(duì)照調(diào)零。同樣往另一測(cè)定管中添加反應(yīng)混合液3 mL，加入1 mL酶液（事先已將其濃度稀釋10倍），然后立即開啟秒表計(jì)時(shí)，于 470 nm 條件下測(cè)D值，每隔30 s讀1次數(shù)值，讀數(shù)3 min，以1 min內(nèi)D值變化作為1個(gè)POD活性單位，3次重復(fù)。

POD活性=（D470 nm×V×K）/（1×m×Vt×T）。

式中：K為稀釋倍數(shù);D470 nm為樣品管吸光度;V為樣品液總體積，mL;Vt為測(cè)定時(shí)樣品用量，mL;m為愈傷組織鮮質(zhì)量，g;T為光照反應(yīng)時(shí)間，min。

1.2.2.4?CAT活性測(cè)定?過(guò)氧化氫酶（CAT）活性測(cè)定參照李玲等的方法[14]，酶促反應(yīng)體系由2.9 mL 20 mmol/L H2O2溶液和100 μL酶提取液組成，以蒸餾水為參比空白，在反應(yīng)15 s時(shí)開始記錄反應(yīng)體系在波長(zhǎng)為240 nm處的吸光度，作為初始值，然后每隔 30 s 記錄1次，連續(xù)測(cè)定6個(gè)點(diǎn)數(shù)據(jù)。以 1 g 木薯胚性愈傷組織（鮮質(zhì)量）1 min吸光度變化值減少0.01為1個(gè)CAT活性單位，3次重復(fù)。

CAT活性=ΔD240 nm×V/（0.01×Vs×m）。

式中：ΔD240 nm為樣品管吸光度變化量;V為樣品提取液體積，mL;Vs為測(cè)定樣品提取液體積，mL;m為愈傷組織鮮質(zhì)量，g。

1.3?數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2003和SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，采用Duncan's新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析。

2?結(jié)果與分析

2.1?不同濃度蔗糖處理對(duì)木薯胚性愈傷組織中3種保護(hù)酶活性的影響

蔗糖既是植物組織培養(yǎng)中的最主要碳源，也是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[3]。由表1可知，保存期間蔗糖處理的木薯胚性愈傷組織SOD、POD、CAT活性均高于對(duì)照組，表現(xiàn)出隨著蔗糖處理濃度的升高，SOD、POD、CAT活性先升高后下降的趨勢(shì)，活性最高點(diǎn)均出現(xiàn)在蔗糖濃度為30 g/L時(shí)，此時(shí)與其他處理差異顯著（P<0.05）;表明在蔗糖滲透脅迫下，較高活性的保護(hù)酶系統(tǒng)能夠有效地清除木薯胚性愈傷組織內(nèi)過(guò)多的活性氧，維持活性氧產(chǎn)生與清除之間的動(dòng)態(tài)平衡。蔗糖濃度超過(guò)35 g/L時(shí)，SOD、CAT活性開始緩慢下降，而POD活性表現(xiàn)急速下降，說(shuō)明活性氧的增加遠(yuǎn)大于正常清除能力，過(guò)多的氧自由基使細(xì)胞內(nèi)多種功能膜及酶系統(tǒng)遭到不同程度的破壞，生理代謝紊亂，POD活性就可能受到抑制而急速下降[15]。由此可以看出，適當(dāng)濃度的蔗糖可以提高木薯胚性愈傷組織的抗氧化酶活性。

2.2?不同濃度甘露醇處理對(duì)木薯胚性愈傷組織中3種保護(hù)酶活性的影響

甘露醇是活性氧清除劑[16]，作為一種重要的多元醇，還可直接清除·OH，抵抗氧化反應(yīng)[17]。由表2可以看出，隨著甘露醇濃度（0～30 g/L）的不斷升高，木薯胚性愈傷組織中的SOD、POD、CAT活性不斷升高，其中20、30 g/L甘露醇處理與對(duì)照差異顯著。30 g/L甘露醇處理的3種保護(hù)酶活性維持在較高的水平上，SOD、POD、CAT活性值分別比對(duì)照升高63.27%、56.42%、59.81%，除濃度在30～40 g/L之間POD活性差異不顯著外，其他各處理之間的3種保護(hù)酶活性均差異顯著，說(shuō)明脅迫處理下胚性愈傷細(xì)胞中3種保護(hù)酶活性被誘導(dǎo)升高，直到濃度高達(dá)40 g/L時(shí)才開始呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢(shì)，這可能是由于高濃度處理超出了細(xì)胞的生理耐受和反應(yīng)極限，破壞了正常細(xì)胞生理活動(dòng)。由此可見，甘露醇濃度為30 g/L時(shí)可以有效增強(qiáng)木薯胚性愈傷組織的SOD、POD、CAT活性，且3種保護(hù)酶活性升高與愈傷組織抗衰老密切相關(guān)，可作為愈傷組織生長(zhǎng)過(guò)程中增殖和衰老的標(biāo)志酶。

2.3?不同濃度多效唑處理對(duì)木薯胚性愈傷組織中3種保護(hù)酶活性的影響

多效唑作為高效低毒的植物生長(zhǎng)延緩劑，可以延長(zhǎng)培養(yǎng)物在試管中的保存時(shí)間[18]。由表3可以看出，木薯胚性愈傷組織在多效唑濃度為4.0、6.0、8.0、10.0 mg/L處理下，SOD、POD、CAT活性顯著高于對(duì)照，8.0 mg/L多效唑處理的3種保護(hù)酶活性維持在較高的水平上，分別比對(duì)照升高63.09%、63.73%、93.20%，SOD、POD、CAT活性的最高值是愈傷組織生長(zhǎng)高峰期到來(lái)的標(biāo)志。3種保護(hù)酶活性隨著多效唑濃度的升高呈先升后降的趨勢(shì)，6.0 mg/L與8.0 mg/L多效唑處理下，木薯胚性愈傷組織中的SOD、POD活性差異不顯著，8.0 mg/L 多效唑處理的CAT活性與其他處理組差異顯著，10.0 mg/L濃度處理下，3種保護(hù)酶活性急速下降，說(shuō)明培養(yǎng)基添加多效唑在一定程度上使3種保護(hù)酶活性增強(qiáng)，從而減弱膜脂過(guò)氧化作用，有效地延長(zhǎng)愈傷組織的繼代周期。綜合分析認(rèn)為，生長(zhǎng)延緩劑多效唑在木薯胚性愈傷保存中的適宜濃度為8.0 mg/L。

3?結(jié)論與討論

SOD、POD、CAT是抗氧化酶系統(tǒng)中控制植物體內(nèi)活性氧積累的最主要的3種保護(hù)酶，其活性變化與衰老密切相關(guān)?？寡趸富钚缘奶岣哂欣跍p緩愈傷組織中活性氧對(duì)細(xì)胞的氧化損害，減緩其細(xì)胞膜質(zhì)過(guò)氧化并抑制褐化[19]。POD是廣泛存在于各種動(dòng)物、植物和微生物體內(nèi)的一類氧化酶，其與SOD共同作用能減輕或消除氧自由基對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的不良影響[20]。CAT廣泛存在于植物體內(nèi)，其活性與植物體的成熟衰老關(guān)系非常密切[21]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在常規(guī)固體保存培養(yǎng)基（GD培養(yǎng)基+12.0 mg/L毒莠定+6.5 g/L瓊脂）上附加蔗糖30 g/L、甘露醇30 g/L、多效唑8.0 mg/L時(shí)，木薯胚性愈傷組織的3種保護(hù)酶活性均有一定幅度的增強(qiáng)，可在一定程度上延緩解木薯胚性愈傷細(xì)胞的衰老，有效地延長(zhǎng)愈傷組織的繼代周期，進(jìn)而達(dá)到延長(zhǎng)保存時(shí)間的目的，是一種對(duì)木薯種質(zhì)資源離體保存的方法。

蔗糖是植物組織培養(yǎng)中不可缺少的碳源和能源，同時(shí)還起著調(diào)節(jié)滲透壓的重要作用[22]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)蔗糖處理保存的木薯愈傷組織的SOD、POD、CAT活性比常規(guī)保存的對(duì)照處理高，在30 g/L蔗糖濃度脅迫下，3種保護(hù)酶活性一直維持在較高的水平上，主要原因是添加蔗糖后，培養(yǎng)基碳源充足，細(xì)胞生命活動(dòng)旺盛，過(guò)快的生理反應(yīng)使活性氧的產(chǎn)生較多，高濃度（35～40 g/L）蔗糖迫脅下呈下降趨勢(shì)，不利于木薯胚性愈傷離體保存。

在植物離體保存研究中，常利用甘露醇來(lái)延緩細(xì)胞衰老，以達(dá)到延長(zhǎng)繼代時(shí)間的目的。甘露醇在植物組織培養(yǎng)中是一種調(diào)節(jié)滲透壓的添加劑，通過(guò)給植物造成“饑餓”的作用，延緩植物代謝速率，達(dá)到延緩衰老的目的，在多種植物的保存試驗(yàn)中均取得了很好的效果[23-25]。不同植物培養(yǎng)物保存所需要滲透壓并不相同，本試驗(yàn)研究得出，30 g/L甘露醇能將木薯胚性組織的3種保護(hù)酶活性維持在較高水平。

離體保存成功的關(guān)鍵因素之一是使用合適的植物生長(zhǎng)抑制劑。多效唑（PP333）是一種生長(zhǎng)延緩劑，對(duì)植物的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)有較強(qiáng)的抑制作用，在荔枝胚性愈傷組織保存試驗(yàn)中取得較好效果[26]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在常規(guī)保存培養(yǎng)基中添加不同濃度的生長(zhǎng)抑制劑多效唑，對(duì)木薯胚性愈傷組織保存試驗(yàn)中3種保護(hù)酶活性影響差異較大，其中8.0 mg/L多效唑處理顯著高于對(duì)照，3種保護(hù)酶活性一直維持較高水平，說(shuō)明能延緩細(xì)胞衰老，延長(zhǎng)繼代時(shí)間。綜合試驗(yàn)結(jié)果，8.0 mg/L多效唑處理較適合木薯愈傷組織中離體保存。

參考文獻(xiàn)：

[1]沈?光. 廣西木薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展前景與對(duì)策[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2001，90（2）：24-27，39.

[2]徐志微，楊麗麗，杜國(guó)強(qiáng)，等. 培養(yǎng)基滲透壓和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)葡萄種質(zhì)離體保存的效應(yīng)[J]. 分子植物育種，2014，12（4）：720-725.

[3]曾麗蘭，林玉玲，王亞婷，等. 滲透脅迫對(duì)龍眼胚性愈傷組織SOD活性的影響[J]. 福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2014，43（1）：14-19.

[4]岑忠用. 3種抗氧化劑對(duì)巖黃連愈傷組織細(xì)胞活力與抗氧化酶活性的影響[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2015（15）：75-76，78.

[5]劉敏燕，沙月娥，歐陽(yáng)樂(lè)軍，等. 尾巨桉愈傷組織蛋白質(zhì)含量和氧化酶活性比較[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，53（11）：2581-2583，2587.

[6]林小蘋，賴鐘雄，黃?淺. 不同光質(zhì)對(duì)龍眼胚性愈傷組織生長(zhǎng)和細(xì)胞膜保護(hù)酶活性的影響[J]. 福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2008，37（3）：253-256.

[7]黎金燕，王春暉，黃俊文，等. DPI對(duì)尾葉桉愈傷組織誘導(dǎo)和抗氧化酶活性的影響[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，56（11）：2153-2156.

[8]黎?萍，彭靖茹，黃秋偉，等. 培養(yǎng)條件對(duì)木薯胚性愈傷組織SOD活性的影響[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，54（8）：2009-2012.

[9]劉懷攀，陳?龍，張承烈，等. 滲透脅迫和外源ABA對(duì)蘆葦愈傷組織中3種保護(hù)酶活性的影響[J]. 植物生理學(xué)通訊，2002，38（1）：27-29.

[10]葉?煒. 福建龍眼種質(zhì)資源離體保存初步研究[D]. 福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2006.

[11]林秀蓮. 龍眼胚性愈傷組織限制生長(zhǎng)保存及其生理與遺傳機(jī)理的研究[D]. 福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2009.

[12]王梓清，劉愛萍，王家福. 培養(yǎng)條件對(duì)荔枝胚性愈傷組織保存中生理指標(biāo)的影響[J]. 福建果樹，2008，145（2）：12-15.

[13]朱廣廉，鐘海文，張愛琴. 植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)[M]. 北京：北京大學(xué)出版社，1990.

[14]李?玲，李娘輝，蔣素梅，等. 植物生理學(xué)模塊實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M]. 北京：科學(xué)出版社，2009.

[15]史雨剛，吳治國(guó)，馬金虎. 不同濃度NaCl脅迫對(duì)高粱幼苗SOD、POD酶活性的影響[J]. 山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35（12）：71-73.

[16]陳文利，徐朗萊，沈文飚，等. 鹽脅迫下兩品種大麥葉片H2O2累積及其清除酶活性的變化[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，22（2）：97-100.

[17]Shen B，Jensen R G，Bohnert H J. Mannitol protects against oxidation by hydroxyl radicals[J]. Plant Physiology，1997，115（2）：527-532.

[18]郭?勇，崔堂兵，謝秀禎. 植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)[M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2004：194-203.

[19]蘇?江，岑忠用，奉艷蘭，等. 抗壞血酸對(duì)巖黃連愈傷組織褐化及抗氧化酶活性的影響[J]. 北方園藝，2015（20）：138-142.

[20]覃?鵬，劉葉菊，劉飛虎. 干旱處理對(duì)煙草葉片SOD和POD活性的影響[J]. 中國(guó)煙草科學(xué)，2005，26（2）：28-30.

[21]馬凌云，趙?亮. 嘧菌酯處理對(duì)厚皮甜瓜POD和CAT活性的影響[J]. 食品科技，2008，33（11）：64-66.

[22]劉藝平，王?政，牛佳佳，等. 不同糖源及蔗糖質(zhì)量濃度對(duì)牡丹愈傷組織褐化的影響[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，42（3）：103-106.

[23]王愛華，文曉鵬. 半夏緩慢生長(zhǎng)法保存及體細(xì)胞變異的ISSR檢測(cè)[J]. 西北植物學(xué)報(bào)，2012，32（8）：1698-1703.

[24]韋坤華，李林軒，繆劍華，等. 姜種質(zhì)資源離體保存技術(shù)研究[J]. 北方園藝，2013（8）：112-116.

[25]付傳明，黃寧珍，趙志國(guó)，等. 廣西地不容種質(zhì)離體保存技術(shù)研究[J]. 廣西科學(xué)，2007，14（2）：155-159.

[26]王梓清，劉愛萍，胡曉媛，等. 荔枝胚性愈傷組織誘導(dǎo)和離體保存條件的篩選[J]. 植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2009，18（1）：80-86.