CRISPR/Cas9技術(shù)及其在水稻和小麥遺傳改良中的應(yīng)用綜述

馬斯霜 白海波 惠建 呂學(xué)蓮 陳曉軍 李樹華

摘要：CRISPR/Cas9技術(shù)是新發(fā)展的定向基因編輯技術(shù)，CRISPR/Cas9技術(shù)是在細(xì)菌和古細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的1種抵御外來病毒及質(zhì)粒入侵的獲得性免疫系統(tǒng)。CRISPR/Cas9技術(shù)由sgRNA（單向?qū)NA）介導(dǎo)，與Cas9核酸酶切割實(shí)現(xiàn)作物定點(diǎn)編輯改良。本文主要對(duì)CRISPR/Cas9技術(shù)的工作原理、系統(tǒng)分類、結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)構(gòu)建方法進(jìn)行了系統(tǒng)介紹。同時(shí)，總結(jié)了CRISPR/Cas9技術(shù)在水稻和小麥的突變體庫(kù)的建立和基因功能研究、品質(zhì)和農(nóng)藝性狀遺傳改良等方面的研究。并對(duì)CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)作物進(jìn)行定向編輯改良進(jìn)行了展望，以期為利用CRISPR/Cas9技術(shù)創(chuàng)制新品種、作物品種改良提供參考。

關(guān)鍵詞：CRISPR/Cas9;基因編輯;遺傳改良;水稻;小麥

中圖分類號(hào)：Q789?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）20-0029-04

世界人口持續(xù)增長(zhǎng)、耕地面積減少、生態(tài)環(huán)境逐步惡化等因素，為糧食的持續(xù)性穩(wěn)定供給增加了風(fēng)險(xiǎn)[1]。對(duì)作物進(jìn)行遺傳改良，提高作物的產(chǎn)量、品質(zhì)、抗逆性以應(yīng)對(duì)人口增長(zhǎng)和氣候變化是育種人員首要解決的問題[2]。雖然傳統(tǒng)育種技術(shù)解決上述問題已取得一定效果，但依靠雜交創(chuàng)制新品種，選育穩(wěn)定優(yōu)良品種耗時(shí)長(zhǎng)，成本高，在選擇過程中容易造成優(yōu)良基因的丟失，且遺傳相似性較高。分子標(biāo)記輔助育種（MAS）常因多代回交和連鎖累贅而丟失分子標(biāo)記，影響作物遺傳改良的進(jìn)程。傳統(tǒng)的基因編輯技術(shù)以基因重組為基礎(chǔ)進(jìn)行基因組定向修飾，但該技術(shù)存在脫靶率高、周期長(zhǎng)、應(yīng)用范圍窄等缺點(diǎn)。

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的迅速發(fā)展，大量物種的全基因組測(cè)序已經(jīng)完成，為用基因編輯、基因工程等技術(shù)對(duì)作物進(jìn)行遺傳改良奠定了基礎(chǔ)。作物遺傳改良已經(jīng)由常規(guī)雜交向定向編輯改良轉(zhuǎn)變?；蚓庉嬁芍苯訉?duì)基因組或者轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行定向編輯，通過片段的插入、替換、敲除等定點(diǎn)編輯修飾?；蚓庉嫾夹g(shù)極大地加速了生命科學(xué)研究進(jìn)程[3-4]?；蚓庉嫾夹g(shù)通過模板識(shí)別靶位點(diǎn)序列，核酸酶對(duì)靶位點(diǎn)切割造成DNA雙鏈斷裂（double strand breaks，簡(jiǎn)稱DSBs），以及DSBs 激活DNA損傷修復(fù)應(yīng)答機(jī)制，即非同源末端連接（non-homologous ending-joining，簡(jiǎn)稱NHEJ）或同源重組（homologous recombination，簡(jiǎn)稱HR）。NHEJ可在酶切位點(diǎn)發(fā)生堿基的插入或缺失;在有同源供體DNA時(shí)HR會(huì)導(dǎo)致靶位點(diǎn)序列的替換[5-6]?，F(xiàn)主要有3種基因編輯技術(shù)：鋅指核酸酶（zinc-finger nucleases，簡(jiǎn)稱ZFNs）、TALE核酸酶（transcription activator like effector nucleases，簡(jiǎn)稱TALENs）和CRISPR/Cas9 （clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated nuclease 9）[7]。ZFNs與TALENs技術(shù)根據(jù)靶位點(diǎn)序列設(shè)計(jì)識(shí)別蛋白模板，F(xiàn)okⅠ內(nèi)切酶與蛋白模板融合切割;CRISPR/Cas9技術(shù)，只需根據(jù)靶位點(diǎn)序列設(shè)計(jì)20個(gè)核苷酸的gRNA（向?qū)NA），Cas9切割DNA[8]。CRISPR/Cas9技術(shù)因其簡(jiǎn)潔的操作、低脫靶率等優(yōu)點(diǎn)，將基因編輯技術(shù)的完善與應(yīng)用推向了新高潮。

1?CRISPR/Cas9的簡(jiǎn)介

CRISPR/Cas9是新發(fā)展的定向基因編輯技術(shù)。由于易操作、成本低且脫靶率低，被Science評(píng)為2013年十大科學(xué)進(jìn)展之一[9]。CRISPR/Cas9是在細(xì)菌和古細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的一種抵御外來病毒及質(zhì)粒入侵的獲得性免疫系統(tǒng)[10]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)由CRISPR位點(diǎn)、Cas蛋白、編碼DNA序列組成，并因操作性強(qiáng)、編輯效率較高等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)被用于小麥、水稻、玉米、擬南芥等植物中。

1.1?CRISPR/Cas9技術(shù)的作用原理

細(xì)菌和古細(xì)菌的CRISPR/Cas9系統(tǒng)抵御外來病毒及質(zhì)粒侵染的免疫機(jī)制有3個(gè)階段[11-13]。首先是外源DNA的獲取，外源DNA侵入時(shí)，識(shí)別PAM區(qū)域，鄰近PAM的DNA序列作為原間隔序列，蛋白復(fù)合物將原間隔序列從外源DNA中剪切下來，通過鑒定、加工整合到CRISPR 位點(diǎn)。其次是crRNA的合成表達(dá)階段，CRISPR在前導(dǎo)區(qū)的調(diào)控下轉(zhuǎn)錄出precursor-CRISPR-derived RNA（pre-crRNA）和trans-acting crRNA（tracrRNA），tracrRNA、pre-crRNA和Cas9 蛋白在RNase（核糖核酸酶）的作用下產(chǎn)生crRNA。crRNA通過堿基配對(duì)與 tracrRNA 結(jié)合形成 tracrRNA/crRNA復(fù)合物[14-15]，此復(fù)合物引導(dǎo)核酸酶Cas9蛋白在與crRNA配對(duì)的序列靶位點(diǎn)剪切雙鏈DNA。最后是靶向干擾階段，以上2種RNA復(fù)合物被改裝成1個(gè)向?qū)NA（single-guideRNA， 簡(jiǎn)稱sgRNA） [16-17]。這個(gè)sgRNA與Cas9對(duì)DNA雙鏈進(jìn)行切割，在完整基因組上的特定位點(diǎn)完成切割反應(yīng)，sgRNA序列還可借助特定軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)。sgRNA和Cas9與外源DNA進(jìn)行識(shí)別，并識(shí)別出與crRNA互補(bǔ)的原間隔序列，復(fù)合物將被定位到PAM原間隔序列的區(qū)域，形成R-Loop[18-19]。Cas9 剪切與crRNA互補(bǔ)的DNA鏈，雙鏈斷裂，形成DNA雙鏈斷裂（DSBs）。斷裂的雙鏈通過同源重組或非同源末端連接得到修復(fù)，從而達(dá)到對(duì)基因組編輯的目的。

1.2?CRISPR/Cas9分類及結(jié)構(gòu)

細(xì)菌和古細(xì)菌中存在大量的Cas9蛋白，根據(jù)其結(jié)構(gòu)、功能、對(duì)應(yīng)的gRNA 不同等因素可大致分為3類。第1類在成熟的sgRNA中有1個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)，需要與大量的Cas9蛋白形成1個(gè)蛋白復(fù)合體，可在sgRNA的作用下切割目的DNA片段。在第2類中需要的Cas蛋白較少，其sgRNA有多個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu);該類型是CRISPR/Cas系統(tǒng)中最簡(jiǎn)單，同時(shí)也是編輯效率最高的一類。第3類中Cas9蛋白形成2個(gè)不同形式的復(fù)合體，分別是Csm復(fù)合體和Crm復(fù)合體，其中Csm復(fù)合體結(jié)合sgRNA后切割目的DNA片段，而Crm復(fù)合體則可以結(jié)合sgRNA后去切割RNA分子。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)主要由CRISPR位點(diǎn)、Cas蛋白構(gòu)成[20]。CRISPR位點(diǎn)主要是由保守的重復(fù)序列和長(zhǎng)度相似的間隔序列交替排列組成。間隔序列與一些質(zhì)?；蛘呤删w的序列具有較高的同源性，間隔序列可使宿主細(xì)胞免疫外源DNA的入侵，是細(xì)菌及古生菌長(zhǎng)期進(jìn)化形成的一種適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。前導(dǎo)序列可以作為啟動(dòng)子，使CRISPR位點(diǎn)的序列開始轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄出的RNA被命名為CRISPR RNAs（crRNAs）。Cas9蛋白是CRISPR/Cas9系統(tǒng)的重要組成部分，Cas9剪切與crRNA互補(bǔ)的DNA鏈，DNA雙鏈斷裂。Cas9由1 409個(gè)氨基酸組成，主要有2個(gè)大小不同的結(jié)構(gòu)域，是1種多結(jié)構(gòu)域蛋白，主要包括大的球形特異性識(shí)別結(jié)構(gòu)域（REC）和小的核酸酶功能域（NUC）;核酸酶結(jié)構(gòu)域又進(jìn)一步包含2個(gè)核酸酶位點(diǎn)RuvC和HNH，以及1個(gè)PAM-interacting位點(diǎn)[21]。

1.3?CRISPR/Cas9構(gòu)建方法

CRISPR/Cas9系統(tǒng)的構(gòu)建僅包括Cas9蛋白和gRNA的構(gòu)建。Cas9蛋白和gRNA可分別在2個(gè)不同載體中構(gòu)建，也可同時(shí)在1個(gè)載體中構(gòu)建。這2種構(gòu)建方法各具特點(diǎn)：將Cas9蛋白和gRNA構(gòu)建在同一載體上可提高轉(zhuǎn)化效率，降低脫靶效率，該方式在轉(zhuǎn)化困難的作物中較為實(shí)用。將Cas9蛋白和gRNA分別構(gòu)建在2個(gè)表達(dá)載體上，能快速檢測(cè)脫靶效率[22]。為使Cas9更高效地表達(dá)，構(gòu)建時(shí)要對(duì)密碼子進(jìn)行優(yōu)化;gRNA的設(shè)計(jì)主要根據(jù)靶位點(diǎn)的 DNA 序列進(jìn)行[23]。CRISPR/Cas9的轉(zhuǎn)化效率除了受Cas9和gRNA的構(gòu)建影響外，還有很多其他因素。通常SNP（單核苷酸多態(tài)性）和環(huán)的循環(huán)越少，gRNA越有效;此外，脫靶效率還與gRNA-DNA雜交體的解鏈溫度具有較高的相關(guān)性，并與AT含量與脫靶效應(yīng)呈負(fù)相關(guān)，因此AT百分比越高，脫靶效應(yīng)越低[24]。

2?CRISPR/Cas9技術(shù)在水稻遺傳改良中的應(yīng)用

水稻不僅是重要的糧食作物，也是重要的模式植物，相比于小麥復(fù)雜的遺傳結(jié)構(gòu)背景，CRISPR/Cas9技術(shù)在水稻的基因編輯改良中更易操作。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在水稻基因功能研究、水稻品種改良、水稻突變體庫(kù)建立等方面表現(xiàn)出巨大的潛力。

2.1?CRISPR/Cas9技術(shù)在水稻突變體庫(kù)建立方面的應(yīng)用

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展史中的2次綠色革命，都與突變體的研究密不可分。在自然環(huán)境中存在自發(fā)突變，但自發(fā)突變獲得的突變體進(jìn)行基因功能的研究已經(jīng)不能滿足生物學(xué)發(fā)展要求，CRISPR/Cas9技術(shù)利用反向遺傳學(xué)，已經(jīng)在突變體庫(kù)的建立方面取得極大進(jìn)展，進(jìn)行大規(guī)模高通量篩選，為基因組學(xué)的研究與農(nóng)業(yè)生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。沈春修等通過CRISPR/Cas9，以粳稻臺(tái)北309為受體材料，對(duì)LOC_Os05g31750位點(diǎn)進(jìn)行敲除，獲得6株成功敲除的突變體植株[25]。沈蘭等利用CRISPR/Cas9構(gòu)建載體，共敲除8個(gè)農(nóng)藝性狀，在T0代檢測(cè)到雜合突變株和純合突變株[26]。此外，在突變株中發(fā)現(xiàn)了純合的六突突變株、七突突變株、八突突變株。原文霞等利用新的載體和方法，對(duì)水稻日本晴D3基因的3個(gè)位點(diǎn)分別構(gòu)建了相應(yīng)的CRISPR/Cas9載體，并獲得一系列轉(zhuǎn)基因植株，研究了純合突變體的株高、分蘗數(shù)表型與CRISPR/Cas9編輯后基因型之間的關(guān)系[27]。楊紹華等利用CRISPR/Cas9對(duì)水稻品種明恢86中的Os IPA基因突變體功能進(jìn)行驗(yàn)證，研究該基因在水稻花粉發(fā)育過程中的功能[28]。Mao等利用CRISPR/Cas9對(duì)Os MYB1基因進(jìn)行定向編輯，獲得突變體，研究該基因功能[29]。Xie等利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)水稻負(fù)調(diào)節(jié)植物抗病性基因OsMPK5的3個(gè)位點(diǎn)分別進(jìn)行編輯，驗(yàn)證該基因?qū)ν蛔冎昕共⌒缘挠绊慬30]。Feng等利用CRISPR/Cas9分別對(duì)ROC5（Rice Outermost Cell-specific gene5）、SPP（Stromal Processing Peptidase）、YSA（Young Seedling Albino）3個(gè)基因進(jìn)行編輯，發(fā)現(xiàn)不同基因編輯產(chǎn)生的突變體間存在極顯著差異[31]。胡雪嬌等利用CRISPR/Cas9，以SD1基因?yàn)榘谢?，研究該基因?qū)ν蛔冎晗抵旮叩挠绊慬32]。

2.2?CRISPR/Cas9技術(shù)在水稻品質(zhì)改良中的應(yīng)用

隨著人們對(duì)植物代謝途徑的研究不斷深入，利用分子技術(shù)對(duì)作物品質(zhì)進(jìn)行改良也取得顯著成效。隨著CRISPR/Cas9技術(shù)機(jī)制的不斷闡明，采用CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)行作物品質(zhì)定向改良已顯現(xiàn)出巨大的潛力。目前，人們利用CRISPR/Cas9已經(jīng)成功地對(duì)水稻進(jìn)行不同方面的品質(zhì)改良。馮璇等利用CRISPR/Cas9編輯技術(shù)將高產(chǎn)的非糯性品種轉(zhuǎn)為糯性品種，對(duì)保持系209B的Wx位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)編輯，并轉(zhuǎn)育糯稻不育系WX209A且直鏈淀粉含量降低[33]。汪秉琨等利用CRISPR/Cas9編輯Wx基因，獲得了穩(wěn)定遺傳、低直鏈淀粉含量的轉(zhuǎn)化株系[34]。Zhou等利用CRISPR/Cas9，在應(yīng)用最廣泛的溫敏核不育TGMS基因中誘導(dǎo)特異性突變，并開發(fā)了新的“轉(zhuǎn)基因清潔”TGMS系，加速了不育系的育種，開發(fā)了雜種優(yōu)勢(shì)[35]。劉維等通過CRISPR/Cas9技術(shù)，以感病品種麗江為材料，對(duì)抗病基因OsCOL9進(jìn)行編輯，麗江抗病性顯著增強(qiáng)[36]。邵高能等通過CRISPR/Cas9對(duì)中花11的香味基因Badh2進(jìn)行編輯，突變體材料中的香味物質(zhì)顯著增加[37]。白建江等利用CRISPR/Cas9得到穩(wěn)定的沒有潮霉素標(biāo)記的高抗性淀粉水稻純合突變株，為高抗性淀粉育種提供了新的種質(zhì)資源[38]。Wang等利用CRISPR/Cas9對(duì)粳稻 Kuiku131稻瘟病負(fù)調(diào)控抗性基因OsERF922進(jìn)行編輯，發(fā)現(xiàn)純合突變系在苗期和分蘗期稻瘟病發(fā)病程度明顯比野生型低，且農(nóng)藝性狀沒有發(fā)生明顯的變化[39]。

2.3?CRISPR/Cas9技術(shù)在水稻農(nóng)藝性狀改良中的應(yīng)用

作物品種改良的關(guān)鍵是對(duì)農(nóng)藝性狀進(jìn)行改良，利用控制農(nóng)藝性狀的有利等位基因，通過分子標(biāo)記輔助育種進(jìn)行改良。雖然分子標(biāo)記能夠?qū)ψ魑镏性S多控制重要農(nóng)藝性狀的基因進(jìn)行定位，但不能對(duì)目標(biāo)性狀進(jìn)行定向改造。CRISPR-Cas9能有目的地選擇一些有價(jià)值的等位基因在育種中應(yīng)用。Xu等通過CRISPR/Cas9對(duì)粒質(zhì)量基因GW2、GW5和TGW6同時(shí)進(jìn)行編輯，得到gw5tgw6和gw2gw5tgw6突變體，其粒質(zhì)量較野生型品種粳稻明顯增加，且3個(gè)基因間無互作關(guān)系[40]。Shen等利用CRISPR/Cas9對(duì)4個(gè)水稻品種的粒長(zhǎng)和穗粒數(shù)進(jìn)行定向編輯，且gs3和gs3nla突變體的粒長(zhǎng)和千粒質(zhì)量較野生型明顯增加[41]。韓嬌等通過CRISPR/Cas9對(duì)水稻中與McPht蛋白同源性最高的磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因進(jìn)行編輯，并對(duì)突變體進(jìn)行生理指標(biāo)測(cè)定，水稻突變體的株高、鮮質(zhì)量、根系活力均小于野生型，根系掃描結(jié)果顯示，水稻突變體的根長(zhǎng)、投影面積、表面積和側(cè)根數(shù)均大于野生型[42]。孟帥等利用CRISPR/Cas9編輯控制粒長(zhǎng)基因GS3，對(duì)后代植株粒型進(jìn)行考察，gs3突變體的粒長(zhǎng)均顯著長(zhǎng)于野生型[43]。沈蘭等利用CRISPR/Cas9，以控制粒型基因GS3和控制每穗粒數(shù)基因Gn1a為靶基因，轉(zhuǎn)化4個(gè)優(yōu)質(zhì)水稻品種，突變體gs3和gs3gn1a 與野生型相比粒長(zhǎng)變長(zhǎng)，千粒質(zhì)量增加;突變體gs3gn1a與突變體gs3相比，每穗粒數(shù)顯著增加[44]。Miao等利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)分別研究CAO1和LAZY1基因?qū)ν蛔冎耆~綠素B的合成和分蘗夾角的影響[45]。Li 等對(duì)粳稻Zhonghua11中的Gn1a、DEP1、GS3、IPA1與產(chǎn)量相關(guān)的4個(gè)基因編輯，Gn1a、DEP1和GS3純合突變株穗粒數(shù)、直立型密穗數(shù)和千粒質(zhì)量顯著增加，且DEP1和GS3突變植株中出現(xiàn)了半矮稈和長(zhǎng)芒現(xiàn)象，而IPA1突變株中出現(xiàn)了多蘗和少蘗2種現(xiàn)象[46]。

3?CRISPR/Cas9系統(tǒng)在小麥遺傳改良中的應(yīng)用

小麥?zhǔn)钱愒炊啾扼w，其基因組較為龐大，高倍性和高度重復(fù)的DNA序列使得其正向和反向遺傳分析均難以進(jìn)行。因其復(fù)雜的遺傳結(jié)構(gòu)、巨大的基因組（17Gb）和對(duì)轉(zhuǎn)化的頑固，對(duì)小麥基因組進(jìn)行定點(diǎn)編輯相對(duì)困難[47]。近年來，CRISPR/Cas9已經(jīng)在小麥上廣泛應(yīng)用。利用CRISPR/Cas9對(duì)小麥進(jìn)行遺傳改良的研究也廣泛開展。Yi等在CRISPR/Cas9的基礎(chǔ)上對(duì)單個(gè)Ta MLO位點(diǎn)進(jìn)行誘導(dǎo)，獲得4個(gè)突變體植株，表明CRISPR/Cas9可在多倍體的小麥中誘導(dǎo)形成有利突變[48]。Shan等利用CRISPR/Cas9對(duì)控制小麥籽粒形狀和分蘗基因Ta GASR7、Ta DEP1定點(diǎn)編輯，純合敲除突變體的千粒質(zhì)量和分蘗數(shù)明顯增加，但株高降低[49]。Liang等在CRISPR/Cas9編輯技術(shù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行改善，通過粒子轟擊傳遞CRISPR/Cas9的體外轉(zhuǎn)錄物（iVts）或核糖核蛋白復(fù)合物（rnps）對(duì)小麥進(jìn)行編輯[50]，不僅避免了CRISPR/Cas9隨機(jī)整合到基因組DNA，還降低了脫靶率，并可在短期內(nèi)獲得再生株系。Bhowmik等將CRISPR/Cas9技術(shù)與小孢子技術(shù)相結(jié)合，并優(yōu)化了單倍體誘變系統(tǒng)[51]。使用Cas9和sgRNA，對(duì)小麥的1個(gè)Ds Red外源基因和2個(gè)內(nèi)源基因（Ta Lox2和Ta UbiL1）進(jìn)行靶向修飾，驗(yàn)證了將小孢子和CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)相結(jié)合用于作物改良的可行性。Liang等利用基因槍粒子轟擊技術(shù)分別將7個(gè)不同目的基因的CRISPR/Cas9 的DNA分別導(dǎo)入到二倍體硬質(zhì)小麥和六倍體面包小麥的愈傷中，在不使用任何篩選標(biāo)記的情況下快速獲得相應(yīng)基因的突變株系[52]。Zhang等通過CRISPR/Cas9 RNPs將gw2-RNPs轉(zhuǎn)化到小麥原生質(zhì)體中，gw2-RNPs誘導(dǎo)的Ta GW2基因在小麥A、B、D染色體組的突變頻率分別為94.3%、33.4%、21.8%[53]。Shan等利用CRISPR/Cas9，對(duì)水稻和小麥進(jìn)行序列特異性基因編輯并且小麥雙等位基因pds突變體具有預(yù)期的表型[54]。

4?展望

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是生命科學(xué)的重大發(fā)現(xiàn)之一，具有廣泛的發(fā)展和應(yīng)用前景?？梢远c(diǎn)敲除不利基因，對(duì)作物進(jìn)行定向改良，也可進(jìn)行基因替換、插入，使一些優(yōu)良基因在其他作物中穩(wěn)定遺傳。既能夠解決傳統(tǒng)育種技術(shù)與分子標(biāo)記輔助育種的弊端，拓寬選育品種的遺傳背景，見效快;又能避免轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)帶來的安全問題，精準(zhǔn)地達(dá)到育種目標(biāo)，品種的安全性更高。毫無疑問，CRISPR/Cas9系統(tǒng)將成為作物育種和改良的重要技術(shù)。但CRISPR/Cas9 系統(tǒng)也存在一些問題。CRISPR/Cas9技術(shù)目前在水稻遺傳改良中相對(duì)比較成熟，在其他作物的基因編輯改良中需要進(jìn)一步改善優(yōu)化，使得CRISPR/Cas9技術(shù)可以在多種作物中廣泛應(yīng)用，提高突變率;脫靶效應(yīng)高和同源重組（HR）編輯效率低是CRISPR/Cas9技術(shù)難以攻克的難題，需要進(jìn)一步加強(qiáng)完善，降低脫靶效應(yīng);解決能夠同時(shí)對(duì)多個(gè)不同基因進(jìn)行定點(diǎn)精準(zhǔn)編輯的問題。目前，CRISPR/Cas9系統(tǒng)在作物遺傳改良的應(yīng)用還處于初級(jí)階段，也在不斷完善發(fā)展，相信在將來能克服種種困難，對(duì)作物進(jìn)行定向改良，獲得更優(yōu)質(zhì)、更理想的品種，將成為作物育種的重要生物技術(shù)。

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