血清藥理學(xué)在抗腫瘤中草藥研究中的應(yīng)用

劉翠翠

（滄州醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校，河北 滄州 061000）

血清藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法于20世紀(jì)80年代由日本學(xué)者田帶真一提出，Iwama H進(jìn)行了完善，它是指給動(dòng)物灌服實(shí)驗(yàn)所用藥物（尤其是中藥或其復(fù)方制劑等成分復(fù)雜藥物）一定時(shí)間后，采集動(dòng)物血液，離心得到含原型藥物或其代謝產(chǎn)物的血清（含藥血清），此方法模擬了體內(nèi)藥物的作用環(huán)境，是一種半體內(nèi)的體外實(shí)驗(yàn)方法。該方法的特點(diǎn)是以中草藥有效成分為切入點(diǎn)，同時(shí)結(jié)合了藥物代謝動(dòng)力學(xué)觀點(diǎn)，即無(wú)論單味中草藥還是其復(fù)方（方劑）化學(xué)成分有多復(fù)雜，在經(jīng)適當(dāng)途徑給藥后，經(jīng)過(guò)吸收、分布、代謝等體內(nèi)過(guò)程，最終入血的成分才能夠真正發(fā)揮藥理效應(yīng)。從某種意義上來(lái)說(shuō)，中草藥及其方劑的血清藥理學(xué)和血清靶成分的研究既秉承了中醫(yī)中藥治療疾病的精華又借鑒了許多相關(guān)學(xué)科的現(xiàn)代研究成果[1]。本文就血清藥理學(xué)在抗腫瘤中草藥研究中的應(yīng)用做一綜述。

1 中草藥有效成分的研究

中草藥有效成分（有效部位）的研究主要采取藥物與細(xì)胞直接接觸的體外實(shí)驗(yàn)方法，觀察細(xì)胞直接接觸藥物后的生長(zhǎng)狀態(tài)，從而客觀地通過(guò)藥物作用的有效濃度（IC50）判斷藥物的活性，還可以在細(xì)胞水平甚至分子水平研究藥物的作用機(jī)制[2-3]。例如近幾年來(lái)研究頗多的中藥半枝蓮的有效成分半枝蓮總黃酮[4]、半枝蓮黃芩苷[5]、半枝蓮多糖[6-7]、半枝蓮二萜[8]的抗癌試驗(yàn)及作用機(jī)制研究均為體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

對(duì)中草藥的有效成分進(jìn)行血清藥理學(xué)方面的實(shí)驗(yàn)研究，可以使實(shí)驗(yàn)條件更加接近細(xì)胞和藥物作用的真實(shí)環(huán)境，必要時(shí)還可以做血藥濃度-時(shí)間曲線(xiàn)分析。例如，體內(nèi)藥理實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)川芎有效成分川芎嗪可以抑制小鼠Liwes肺癌細(xì)胞的增殖，降低其腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的發(fā)生，同時(shí)可以降低腫瘤組織中的血管密度。進(jìn)一步的血清藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，含有川芎嗪的藥物血清能夠?qū)寡軆?nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV304細(xì)胞的增殖，為川芎嗪抗腫瘤血管生成做出了解釋[9]。在另一項(xiàng)川芎嗪的血清藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中[10]，川芎嗪含藥血清可以抑制人肝癌HepG2腫瘤細(xì)胞的增殖，同時(shí)結(jié)合RP-HPLC測(cè)定血清藥物濃度證實(shí)，川芎嗪腹腔注射143.0 ng/kg，1次/天，連續(xù)7天，最后一次給藥后0.5小時(shí)采集血液，血清藥物濃度為385.1 μg/ml，對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率為46.10%。

2 單味中草藥的研究

單味中草藥粗提物的抗腫瘤作用體外初步篩選工作，采用血清藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法可以避免藥物制劑粗糙對(duì)細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)干擾過(guò)大的缺點(diǎn)，就有效成分而言研究的目的更加明確。

例如天然藥物白花蛇舌草，具有清熱、解毒、消痛、散結(jié)、抑瘤等功效，臨床上經(jīng)常配伍其他中草藥用于治療肝癌、食管癌、乳腺癌等。陳晨等[11]的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究，同時(shí)觀察了白花蛇舌草注射液在體內(nèi)和體外的抗腫瘤活性。體內(nèi)試驗(yàn)：給予荷瘤小鼠（人肝癌HepG2細(xì)胞）白花蛇舌草注射液，觀察腫瘤發(fā)生率；體外試驗(yàn)：小鼠灌胃白花蛇舌草，獲取含藥血清，而后觀察藥物血清對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的影響。結(jié)果：體內(nèi)試驗(yàn)空白對(duì)照組、白花蛇舌草組、5-氟尿嘧啶組小鼠肝癌的發(fā)生率分別為100%、60%、30%，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且白花蛇舌草組小鼠腫瘤的體積為（1 873±47）mm3，與對(duì)照組（3 042±56）mm3相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。體外試驗(yàn)10%、15%、20%中藥白花蛇舌草含藥血清組抑制率分別為（14.20±1.42）%，（24.60±3.76）%，（35.35±4.81）%，其中以 20%的濃度抑瘤率最高，依據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果和其他實(shí)驗(yàn)資料，研究人員已經(jīng)初步確定了白花蛇舌草抗腫瘤作用的有效部位。

水蛭亦是臨床上經(jīng)常用來(lái)配伍抗腫瘤方劑的動(dòng)物藥，李小菊等[12]在對(duì)水蛭抑制腫瘤血管生成的實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，SD大鼠每天灌胃水蛭懸濁液1.25 ml/100 g，連續(xù)給藥7 d，最后一次給藥后2 h采集血液，以終濃度為0.5%、15%、25%、35%、45%的水蛭含藥血清與EA.hy926血管內(nèi)皮細(xì)胞株共培養(yǎng)，證實(shí)水蛭含藥血清能抑制EA.hy926細(xì)胞的增殖，且具有時(shí)間和劑量依賴(lài)性，同時(shí)證實(shí)水蛭含藥血清抑制腫瘤組織血管增生可能與降低 HIF-1 α、mRNA、VEGF mRNA的表達(dá)和 HIF-1 α 蛋白表達(dá)水平有關(guān)。苦參也是經(jīng)常配伍于抗腫瘤方劑的中藥，張宏梅等[13]通過(guò)血清藥理學(xué)方法觀察了中藥苦參煎劑對(duì)SPC-A1人肺癌細(xì)胞的抑制作用。首先SD大鼠灌胃苦參煎劑150 ml/kg，2次/天，3天后腹主動(dòng)脈采血，獲取藥物血清，以不同濃度的含藥血清作用于SPC-A1細(xì)胞，MTT法觀察藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞的周期分布。結(jié)果證實(shí)，不同濃度的含藥血清對(duì)SPC-A1細(xì)胞的生長(zhǎng)均具有抑制作用，血清濃度為20%時(shí)，抑制率可達(dá)62.29%，且含藥血清細(xì)胞組細(xì)胞大多停滯于G0/G1期。另外，歐冰凝等[14]對(duì)中藥八角蓮的血清藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，30%八角蓮的含藥血清可抑制人肝癌SMMC-7221細(xì)胞增殖，抑制率可達(dá)31.27%，與對(duì)照組相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 中藥方劑（復(fù)方）的研究

抗腫瘤中藥方劑（復(fù)方）的突出特點(diǎn)是多組分活性、多靶點(diǎn)協(xié)同作用，其研究一直是中藥現(xiàn)代化研究的重、難點(diǎn)之一。近年來(lái)，抗腫瘤中草藥方劑（復(fù)方）的藥理學(xué)研究，尤其是基礎(chǔ)性研究采用血清藥理學(xué)方法的越來(lái)越多。中藥抗腫瘤方劑（復(fù)方）的血清藥理學(xué)研究主要包括方劑抗腫瘤活性的篩選，作用機(jī)制的探討，處方的研究（處方解析），等等。

3.1 方劑抗腫瘤作用的初步篩選

方劑（復(fù)方）抗腫瘤活性體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)初步篩選的評(píng)價(jià)指標(biāo)主要是腫瘤細(xì)胞增殖的抑制率和腫瘤細(xì)胞的凋亡率。例如，消癌解毒方是國(guó)醫(yī)大師周仲瑛教授根據(jù)多年臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)總結(jié)形成的治療腫瘤的中藥復(fù)方制劑[15]，家兔灌胃給予消癌解毒方而后采集含藥血清使其與人結(jié)腸癌HT-29和HCT-116細(xì)胞共同培養(yǎng)，培養(yǎng)的含藥血清濃度為15%時(shí)，以腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，結(jié)果消癌解毒方含藥血清對(duì)兩種腫瘤細(xì)胞的抑制率分別為42.7%和50.2%，確證了該方劑的抗腫瘤活性。在陳曉琦等[16]對(duì)扶正消瘤顆粒的血清藥理學(xué)的研究中亦以腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，證實(shí)扶正消瘤顆粒的含藥血清對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞具有抑制其生長(zhǎng)的作用，且抑制作用同濃度高低和時(shí)間長(zhǎng)短具有平行關(guān)系。在另外一項(xiàng)中藥方劑鱉甲煎丸化裁方[17]的血清藥理學(xué)的研究中以腫瘤細(xì)胞凋亡率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SD大鼠灌胃鱉甲煎丸化裁方水煎劑，以10%、20%濃度含藥血清與人肝癌 HCCLM3細(xì)胞共培養(yǎng)，24 h、48 h的凋亡率分別為7.90%、12.22%和11.95%、13.89%，相對(duì)對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率5.29%和5.73%，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈現(xiàn)出明確的量效關(guān)系。

3.2 抗癌作用機(jī)制探討

在明確方劑（復(fù)方）具有抗腫瘤活性之后可以進(jìn)一步探討其抗腫瘤作用的機(jī)制，中藥方劑（復(fù)方）抗腫瘤作用機(jī)制的探討主要集中于對(duì)腫瘤細(xì)胞周期的影響以及對(duì)相關(guān)腫瘤基因等的影響。

關(guān)于方劑（復(fù)方）抗癌對(duì)細(xì)胞周期的影響研究較多采用的方法是流式細(xì)胞術(shù)。例如對(duì)中藥方劑參芪抑瘤方的血清藥理學(xué)研究首先證實(shí)該方劑含藥血清對(duì)BGC-823胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)有抑制作用，進(jìn)一步流式細(xì)胞術(shù)研究證實(shí)這一作用的機(jī)制在于將腫瘤細(xì)胞阻滯于G0/G1期[18]。類(lèi)似的研究表明中藥方劑補(bǔ)腎抑瘤湯的含藥血清誘導(dǎo)人前列腺癌PC-3細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制在于將PC-3細(xì)胞的增殖阻滯于G2/M期[19]，而中藥方劑生脈注射液的含藥血清能使人胃癌耐藥細(xì)胞GC7901/VCR周期阻滯于DNA合成前期，從而干擾細(xì)胞周期，抑制耐藥細(xì)胞的增殖[20]。

其他有關(guān)方劑（復(fù)方）抗腫瘤作用機(jī)制的研究還有仇江輝等[21]的方劑扶正透毒祛毒復(fù)方對(duì)髓系MRD-L患者CD34＋細(xì)胞源DC誘導(dǎo)過(guò)程中IL-2、sIL-2R的影響，翟林柱等[22]的益氣除痰方對(duì)彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤增殖及AKT表達(dá)的影響以及樓姣英等[23]的中藥清毒栓對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞產(chǎn)生免疫相關(guān)細(xì)胞因子的影響等。扶正透毒祛毒復(fù)方含藥血清可以促進(jìn)CD34＋細(xì)胞向DC轉(zhuǎn)化的機(jī)制可能與促進(jìn)IL-2的分泌，減少sIL-2R的形成有關(guān)。益氣除痰方的抑瘤作用可能參與抑制了AKT磷酸化的信號(hào)通路，從而對(duì)彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤OCI-ly10細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制以及促進(jìn)其凋亡的作用。清毒栓含藥血清可顯著誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)免疫相關(guān)細(xì)胞因子IL-8、TNF-α基因的表達(dá)，使其表達(dá)量增加，其作用機(jī)制可能是通過(guò)促進(jìn)相關(guān)基因的表達(dá)量來(lái)增加相應(yīng)細(xì)胞因子蛋白的表達(dá)。

3.3 處方配伍的研究

以中醫(yī)理論為依據(jù)，結(jié)合現(xiàn)代藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)手段研究中藥處方配伍方式是促進(jìn)中西醫(yī)結(jié)合以及中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展的重要途徑之一。例如陳亦暉對(duì)健脾養(yǎng)胃方（由黃芪、黨參、陳皮、法半夏、白術(shù)、白芍、當(dāng)歸、三棱、莪術(shù)、白花蛇舌草、石見(jiàn)穿、茯苓、木香、砂仁、炙甘草十五味中草藥組成）進(jìn)行了拆方研究。健脾養(yǎng)胃方是中醫(yī)治療脾胃病的代表方，通過(guò)健脾益氣養(yǎng)胃之法，使氣血生化之源不斷，有助于胃癌治療的整個(gè)過(guò)程，對(duì)該方進(jìn)行配伍研究具有實(shí)際意義。研究人員首先將該方拆方為理氣化痰方（陳皮、半夏組成）、行氣破血方（三棱、莪術(shù)、石見(jiàn)穿組成）、行氣化濕方（砂仁、木香組成）3個(gè)復(fù)方，連同健脾養(yǎng)胃方全方制備藥物血清進(jìn)行血清藥理學(xué)研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些組方含藥血清對(duì)BGC-823（人胃癌細(xì)胞）和 BGC-823/5-Fu耐藥株的抑制率均隨著藥物濃度的升高越來(lái)越強(qiáng)，且與腫瘤細(xì)胞是否耐5-氟尿嘧啶（5-Fu）無(wú)關(guān)；在細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，各組方含藥血清均可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且與濃度呈正相關(guān)，但行氣破血方（三棱、莪術(shù)、石見(jiàn)穿組）與其余各組相比，凋亡率較低；在隨后的體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)中，5-Fu組、健脾養(yǎng)胃全方組、行氣化濕方組、健脾養(yǎng)胃全方+5-Fu組、行氣化濕方+5-Fu組，抑瘤率分別為19.01%、36.30%、32.35%、55.19%、48.72%，均高于單用 5-Fu組，且健脾養(yǎng)胃全方組抑瘤效果強(qiáng)于行氣化濕方組，應(yīng)用中藥各組方組不良反應(yīng)較單用5-Fu組少且不受細(xì)胞耐藥的影響。該項(xiàng)研究的結(jié)論是從總體治療效果來(lái)說(shuō)健脾養(yǎng)胃全方組是抑制BGC-823和BGC-823/5-Fu細(xì)胞增殖的最佳配伍形式[24]。

3.4 其他

通過(guò)血清藥理學(xué)研究中藥方劑（復(fù)方）的抗腫瘤作用還包括聯(lián)合用藥，化療增效減毒以及抗腫瘤轉(zhuǎn)移、侵襲等。例如，隋雨桐等[25]研究發(fā)現(xiàn)芪杉方含藥血清不僅能夠抑制人肺癌細(xì)胞A549的增殖，降低 Caspase-9以及 PI3K等蛋白、基因表達(dá)量，同時(shí)還與臨床常用化療藥物順鉑聯(lián)合使用具有協(xié)同作用。史曉光等[26]在對(duì)參芪扶正注射液的血清藥理學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)，化療藥物5-Fu、順鉑注射液聯(lián)合含藥血清后，相較于單用化療藥物，對(duì)于小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的抑制明顯降低，證實(shí)參芪扶正注射液可以改善化療藥物所造成的免疫抑制。另外葉依依等[27]在對(duì)中藥方劑乳移平的研究中發(fā)現(xiàn)，乳移平含藥血清能夠逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的Smad4蛋白及mRNA的高表達(dá)，從而抑制TGF-β1誘導(dǎo)的4T1高侵襲能力，為乳移平的抗腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

總之，血清藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)工作的開(kāi)展為中草藥特別是中藥方劑的研究提供了便利，使得成分復(fù)雜的中草藥及粗制劑進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)成為可能，因此在中藥抗癌藥物的研究中得到廣泛使用。盡管血清藥理學(xué)研究還存在不足，但是作為一種研究手段問(wèn)世20年來(lái)已經(jīng)成為中草藥有效成分研究的主要思路之一。