酞菁光敏劑抗小鼠宮頸癌的光動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

楊永帥，賈玉華，蔡良知，徐 芃，戴 濤，陳錦燦，胡 萍,，黃明東，陳 卓

(1.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2.中國科學(xué)院福建物質(zhì)結(jié)構(gòu)研究所結(jié)構(gòu)化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002；3.福建省婦幼保健院婦科，福建 福州 350001；4.福州大學(xué)化學(xué)學(xué)院，福建 福州 350108)

0 引言

宮頸癌是婦科最常見的惡性腫瘤之一，在女性惡性腫瘤疾病中位居前列[1].2018年全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示,我國宮頸癌的發(fā)病率逐年上升，且表現(xiàn)出年輕化趨勢(shì)[2].傳統(tǒng)的腫瘤治療手段(手術(shù)、放療和化療)往往給患者的機(jī)體和精神帶來極大痛苦和傷害，而且長期的放化療容易使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致復(fù)發(fā)[3-4].因此，尋找新的有效抗腫瘤療法迫在眉睫.

光動(dòng)力療法(photodynamic therapy，PDT)是通過特定波長的光照射腫瘤部位，使蓄積在腫瘤部位的光敏劑被激發(fā)，產(chǎn)生單線態(tài)氧或自由基，從而破壞周圍的腫瘤細(xì)胞[5]、影響基因表達(dá)[6]、抑制腫瘤微血管生成[7].該療法具有毒副作用小[8]、不產(chǎn)生耐藥性、創(chuàng)傷面積小[9-10]等優(yōu)點(diǎn).在眾多的光敏劑中，酞菁類光敏劑理化性質(zhì)穩(wěn)定，在長波段(670～850 nm)有強(qiáng)吸收，與卟啉類光敏劑相比，表現(xiàn)出較強(qiáng)的光動(dòng)力學(xué)特性和較低的皮膚光毒性[11]，是具有潛在前景的新一代抗腫瘤光敏劑.近年來，隨著精準(zhǔn)醫(yī)療戰(zhàn)略的部署，研發(fā)具有對(duì)腫瘤細(xì)胞特異性識(shí)別功能的光敏劑備受關(guān)注.

本課題組前期通過固相合成法，成功制備了一種高純度且組分單一的酞菁鋅光敏劑五聚賴氨酸-β-羰基酞菁鋅.該光敏劑具有良好的生物安全性，同時(shí)對(duì)多種癌癥具有顯著抑制作用[12-13].本研究觀察該光敏劑在宮頸癌細(xì)胞中的攝取及其光動(dòng)力抗腫瘤作用.構(gòu)建小鼠宮頸癌模型，比較該光敏劑治療前后小鼠的腫瘤體積，腫瘤質(zhì)量以及小鼠體質(zhì)量等指標(biāo)變化情況，探索該光敏劑對(duì)宮頸癌的治療作用，為光動(dòng)力療法用于宮頸癌臨床治療提供重要理論依據(jù).

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

P230P高效液相色譜儀(大連依利特分析儀器有限公司)；分析柱SinoChrom ODS-BP C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)(大連依利特分析儀器有限公司)；MAXI-DRY LYO 真空濃縮凍干機(jī)(丹麥 Heto-Holten公司)；5810R高速離心機(jī)(美國 Eppendorf 公司)；ZHJH-C1115B垂直流超凈工作臺(tái)(上海智城分析儀器制造有限公司)；LED 平板光源(香港 Uniglory Electronices公司)；BB15 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國 Thermo Fisher Scientific公司)；XSP-37XB倒置生物顯微鏡(上海光學(xué)儀器廠)；GI100TR滅菌器(美國 ZEAL WAY公司)；LC-122A 670 nm激光器(660 mW)(美國 Luma Care Medical Group公司)；Synergy 4 多功能酶標(biāo)儀(美國 BioTek公司).

1.2 動(dòng)物、細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)條件

動(dòng)物：雌性SPF級(jí)BALB/c近交系小鼠(6～8周齡)，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(滬)2017-0005，合格證號(hào)為2015000547947.實(shí)驗(yàn)小鼠飼養(yǎng)于12 h光照/12 h黑暗的SPF級(jí)環(huán)境中，自由攝食和飲水.動(dòng)物適應(yīng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn).

腫瘤細(xì)胞株：人宮頸癌細(xì)胞Hela(購于中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心).

腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基：DMEM高糖培養(yǎng)基(含1%(體積分?jǐn)?shù)，下同)鏈霉素、1%青霉素、10%胎牛血清).

腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)條件：37 ℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2培養(yǎng).

1.3 光敏劑的制備

光敏劑中間體單羧基酞菁鋅(ZnPc-COOH)的合成：根據(jù)本課題組前期工作[14]，將尿素、鄰苯二甲酸酐、無水醋酸鋅、偏苯三甲酸酐充分研磨后，與氯化銨、鉬酸銨一同置于帶有攪拌子和回流裝置的三頸燒瓶中，油浴加熱至170 ℃，反應(yīng)4 h，加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解樣品，將反應(yīng)液倒入冰水中，沉淀析出后，進(jìn)行抽濾并烘干，取1 mol·L-1氫氧化鉀溶液100 mL加入所得的固體，油浴攪拌加熱至80 ℃并反應(yīng)24 h，然后先用0.5 mol·L-1鹽酸洗滌，之后水洗至中性，柱層析分離即得ZnPc-COOH.該化合物的摩爾消光系數(shù)ε=120 000 L(mol·cm)-1，根據(jù)Lamber-Beer定律A=C×L×ε，借助Synergy4多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)其最大吸收波長處的吸光度值，可獲得所配制溶液的濃度.

光敏劑五聚賴氨酸-β-羰基酞菁鋅(ZnPc-(Lys)5)的制備：該光敏劑的合成方法比較成熟[12,15]，即取上述已合成的中間體ZnPc-COOH適量，與活化劑N,N-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、1-羥基苯丙三唑(HOBt)溶于含有5%(體積分?jǐn)?shù)，以下同)吡啶的DMF中，活化30 min后與五聚賴氨酸樹脂加熱超聲，用DMF洗滌至無色后冷凍干燥，并與95%的三氟乙酸(TFA)混合反應(yīng)4 h.過濾反應(yīng)液后冷凍干燥，將所得固體溶解于甲醇并離心取上清液，冷凍抽干即得粗品.進(jìn)一步的純化方法：稱取0.6 g ZnPc-(Lys)5粗品，加入12 mL甲醇溶解，室溫12 000 r·min-1離心2 min，將上清液經(jīng)過高效液相分析儀，梯度洗脫法(有機(jī)相洗脫劑為含0.1% TFA的CH3OH∶CH3CN為1∶1(體積比)的混合液，水相洗脫劑為含0.1% TFA的純水；洗脫程序?yàn)橛袡C(jī)相在25 min內(nèi)體積分?jǐn)?shù)從10%增加到100%)分析，收集特定峰區(qū)間的溶液后，旋蒸、冷凍干燥，所得產(chǎn)物即為純化后的ZnPc-(Lys)5.該化合物的摩爾消光系數(shù)為ε=118 380 L(mol·cm)-1，根據(jù)Lamber-Beer定律，利用Synergy4多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)其在最大吸收波長處的吸光度值，即可獲得所配制溶液的濃度.

1.4 宮頸癌細(xì)胞Hela對(duì)光敏劑的攝取

將生長狀態(tài)良好的宮頸癌細(xì)胞Hela接種在96孔板(每孔約4×104個(gè)細(xì)胞)后，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h，待細(xì)胞貼壁后，分別加入10 μmol·L-1的光敏劑(ZnPc-(Lys)5或ZnPc-COOH),并檢測(cè)經(jīng)過不同孵育時(shí)間點(diǎn)(0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 h)的攝取情況.具體做法是：光敏劑與細(xì)胞經(jīng)過不同時(shí)間的孵育后，先用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗去未結(jié)合的藥物，然后在各孔中加入100 μL細(xì)胞裂解液(由0.1 mol·L-1NaOH、體積分?jǐn)?shù)為1%的SDS以及1%的DMSO組成)，常溫靜置2 h后，借助Synergy4多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)680 nm熒光值(610 nm激發(fā)).與此同時(shí)，利用不同濃度的光敏劑制備相應(yīng)的熒光標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)曲線判斷細(xì)胞經(jīng)過不同孵育時(shí)間對(duì)光敏劑的攝取總量.此外，根據(jù)BCA檢測(cè)法檢測(cè)各孔總蛋白含量，并最終計(jì)算得到各組細(xì)胞對(duì)光敏劑的攝取情況.

1.5 光敏劑對(duì)體外宮頸癌細(xì)胞Hela的光動(dòng)力作用

將生長狀態(tài)良好的宮頸癌細(xì)胞Hela接種在96孔板(每孔約104個(gè)細(xì)胞)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h，待細(xì)胞貼壁后，除對(duì)照組，其余各給藥組分別加入不同濃度光敏劑(終濃度分別為3.000 0、1.000 0、0.300 0、0.100 0、0.030 0、0.010 0、0.003 0、0.001 0、0.000 3 μmol·L-1)，并孵育4 h后更新培養(yǎng)液，經(jīng)過光照處理(670 nm激光照射37 s，光劑量為1.5 J·cm-2)后，利用四唑鹽(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞的存活和生長情況.實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次設(shè)置對(duì)照組和給藥組，每組有4個(gè)復(fù)孔.與此同時(shí)，進(jìn)行相關(guān)光敏劑的暗毒性實(shí)驗(yàn)，不進(jìn)行光照處理，直接用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的存活和生長情況.

1.6 光敏劑對(duì)Hela荷瘤小鼠的光動(dòng)力作用

取200 μL密度為2×107mL-1的Hela細(xì)胞接種于小鼠右背部皮下，建立Hela荷瘤小鼠模型.待小鼠腫瘤體積約80 mm3后隨機(jī)分成4組，每組8只小鼠，分別為對(duì)照組(尾靜脈注射200 μL，體積分?jǐn)?shù)為0.9%的生理鹽水)和給藥組(分別尾靜脈注射200 μL的0.3 μmol·L-1ZnPc-COOH、0.3 μmol·L-1ZnPc-(Lys)5或1.0 μmol·L-1ZnPc-(Lys)5).給藥4 h后，對(duì)腫瘤部位進(jìn)行光照(670 nm激光照射3 min，光劑量為30 J·cm-2)，并每天記錄小鼠體重及腫瘤體積(V=a×b2/2，其中a為腫瘤的最長徑，b為腫瘤的最短徑)，最后繪制其體重和腫瘤體積的變化曲線.實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)各組荷瘤小鼠的瘤體進(jìn)行稱量并記錄.

1.7 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，所有數(shù)據(jù)表示為平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM).細(xì)胞對(duì)光敏劑的攝取、光敏劑對(duì)細(xì)胞的光毒性和暗毒性、光敏劑對(duì)荷瘤小鼠的光動(dòng)力作用等實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用雙因素方差分析.95%置信水平,*P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，**P<0.01表示差異極具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.數(shù)據(jù)處理軟件包括Graph Pad Prism、Chem Bio Draw和Microsoft Excel 2013.

2 結(jié)果與分析

2.1 光敏劑的紫外-可見吸收譜圖

光敏劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1所示，其紫外-可見吸收譜如圖2所示.

圖1 光敏劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure formulas of photosensitizers and their UV-Vis absorption spectrum

酞菁光敏劑 ZnPc-(Lys)5最大吸收峰(680 nm)與其中間體ZnPc-COOH最大吸收峰(676 nm)比較接近.相比之下，ZnPc-(Lys)5出現(xiàn)最大吸收峰紅移可能是由于其偶合的五聚賴氨酸在其支鏈上的助色基團(tuán)-NH2增加所致.

2.2 宮頸癌細(xì)胞對(duì)光敏劑的攝取

將濃度為10 μmol·L-1的不同光敏劑與宮頸癌細(xì)胞Hela共同孵育，并在不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)Hela細(xì)胞對(duì)光敏劑的攝取情況.結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著光敏劑與Hela細(xì)胞孵育時(shí)間延長，它們被Hela細(xì)胞攝取的量逐漸增加，約4 h后接近飽和.相比之下，Hela細(xì)胞對(duì)ZnPc-(Lys)5的攝取明顯高于對(duì)ZnPc-COOH的攝取(見圖3).出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是腫瘤細(xì)胞表面帶有較多負(fù)電荷，對(duì)帶較多正電荷的ZnPc-(Lys)5具有更大的吸引力.

圖2 光敏劑的紫外-可見吸收譜圖Fig.2 UV-Vis absorption spectrum of photosensitizers

圖3 宮頸癌細(xì)胞Hela對(duì)光敏劑的攝取Fig.3 Cellular uptakes of photosensitizers on cervical cancer Hela cells

2.3 光敏劑對(duì)宮頸癌細(xì)胞的體外光動(dòng)力作用

將光敏劑與宮頸癌細(xì)胞Hela孵育4 h后，觀察光敏劑對(duì)Hela細(xì)胞的光毒性和暗毒性作用.結(jié)果顯示：在670 nm激光照射、光劑量為1.5 J·cm-2條件下，兩種光敏劑對(duì)Hela細(xì)胞的光動(dòng)力抗腫瘤效應(yīng)均為濃度依賴型，即隨著光敏劑濃度增加，其光動(dòng)力抗腫瘤活性逐漸增強(qiáng)(見圖4(a)).與ZnPc-COOH的抗宮頸癌作用(IC50為(57.3±5.8)nmol·L-1)相比，ZnPc-(Lys)5抗腫瘤效果稍勝一籌(IC50為(30.5±3.1)nmol·L-1)，約為前者的1.9倍.同時(shí)，二者在無光照時(shí)并未表現(xiàn)出抗腫瘤活性(見圖4(b)).

圖4 光敏劑對(duì)宮頸癌細(xì)胞Hela的光毒性和暗毒性實(shí)驗(yàn)Fig.4 Phototoxicity and dark toxicity of photosensitizers on cervical cancer Hela cells

2.4 光敏劑對(duì)Hela荷瘤小鼠的光動(dòng)力作用

為進(jìn)一步觀察光敏劑對(duì)在體腫瘤的光動(dòng)力療效，本課題組建立小鼠宮頸癌模型，并觀察光敏劑對(duì)荷瘤小鼠的作用.研究結(jié)果顯示：對(duì)照組小鼠的腫瘤增長較快，而光敏劑各治療組均對(duì)小鼠腫瘤生長產(chǎn)生不同程度的抑制作用(見圖5(a)).ZnPc-COOH治療組(0.3 μmol·L-1)對(duì)Hela荷瘤小鼠具有明顯抑制腫瘤生長作用，但同樣劑量的ZnPc-(Lys)5治療組，不僅抑制腫瘤生長，而且具有減小腫瘤體積的療效.當(dāng)ZnPc-(Lys)5治療組用藥劑量增加為1.0 μmol·L-1時(shí)，Hela荷瘤小鼠的腫瘤體積幾乎消失，這也驗(yàn)證了該光敏劑的抗腫瘤作用與其濃度正相關(guān).

實(shí)驗(yàn)觀察11 d后，將不同組小鼠的瘤體稱重(見圖5(b)).結(jié)果顯示：在光劑量為30 J·cm-2的光照條件下，同等藥物濃度(均為0.3 μmol·L-1)的ZnPc-(Lys)5比ZnPc-COOH具有更顯著抗腫瘤作用，而且該抗腫瘤作用隨著光敏劑ZnPc-(Lys)5濃度的增加而增強(qiáng).與對(duì)照組(無光敏劑組)相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001.

此外，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，各組小鼠體質(zhì)量的監(jiān)測(cè)結(jié)果(見圖5(c))顯示：濃度為1.0 μmol·L-1的光敏劑ZnPc-(Lys)5對(duì)動(dòng)物的體重增長沒有產(chǎn)生明顯影響，這與本課題組之前開展的該光敏劑對(duì)其他腫瘤的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符，提示該光敏劑具有一定的生物安全性.

圖5 光敏劑對(duì)荷瘤小鼠腫瘤體積、腫瘤質(zhì)量及小鼠體質(zhì)量的影響Fig.5 Effects of photosensitizers on tumor volume,tumor weights and body weights in tumor-bearing mice

3 結(jié)語

與傳統(tǒng)的化療、放療等手段相比，光動(dòng)力療法作為一種新型的抗腫瘤療法，具有高效低毒，能減少患者痛苦等優(yōu)勢(shì)[9]，受到人們普遍關(guān)注.光敏劑作為光動(dòng)力療法的主要要素之一，對(duì)光動(dòng)力抗腫瘤療效至關(guān)重要.可以說，光敏劑的光動(dòng)力活性、光吸收特性及其靶向特性等決定了其臨床的適用性[16].

目前備受關(guān)注的新一代光敏劑，是在第二代光敏劑的基礎(chǔ)上通過偶聯(lián)上具有生物特性的靶向基團(tuán)，以提高光敏劑對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和靶向功能.在目前研究的大多數(shù)光敏劑中，酞菁類光敏劑因其具有較高的活性氧(ROS)產(chǎn)率、優(yōu)良的光物理和光化學(xué)特性[17-18]等，優(yōu)于多數(shù)類型的光敏劑而備受關(guān)注.但是，酞菁光敏劑存在水溶性差、靶向性有待提高等問題.由于不對(duì)稱酞菁衍生物存在異構(gòu)體現(xiàn)象，合成特定的、單一的非對(duì)稱酞菁衍生物一直是個(gè)難題.本課題組前期通過固相合成法，首先合成單羧基取代酞菁鋅，并在此基礎(chǔ)上通過結(jié)合不同的靶向基團(tuán)—多肽，旨在尋找新型高效的具有靶向性的光敏劑.本研究通過將酞菁光敏劑偶合上帶一定正電荷的五聚賴氨酸，即ZnPc-(Lys)5，在提高酞菁光敏劑水溶性的同時(shí)，提高對(duì)帶有大量負(fù)電荷的腫瘤的靶向性.

本課題組長期從事酞菁光敏劑領(lǐng)域研究，前期實(shí)驗(yàn)研究曾經(jīng)利用小鼠乳腺癌原位模型，證實(shí)了光敏劑ZnPc-(Lys)5對(duì)乳腺癌具有良好的抑制作用.本研究主要針對(duì)該光敏劑對(duì)宮頸癌的治療作用進(jìn)行探討.開展的體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：帶有賴氨酸基團(tuán)的光敏劑ZnPc-(Lys)5可顯著提高其在人宮頸癌細(xì)胞Hela中的攝取量，從而增強(qiáng)了其對(duì)Hela細(xì)胞的光毒性.隨后的在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果,進(jìn)一步驗(yàn)證了該光敏劑在濃度僅為0.3 μmol·L-1時(shí)，就表現(xiàn)出明顯抑制Hela荷瘤小鼠的瘤體生長作用；當(dāng)藥物濃度提高到1.0 μmol·L-1時(shí)，Hela荷瘤小鼠的瘤體幾乎消失，表現(xiàn)出對(duì)荷瘤小鼠極顯著的抗宮頸癌作用.綜上所述，偶合賴氨酸的光敏劑ZnPc-(Lys)5對(duì)宮頸癌治療具有廣闊前景，值得繼續(xù)開展下一步的研發(fā).