CPEB4在透明細(xì)胞性腎細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義

王靜，王書(shū)芹，周梅，畢超，呂輝，禤瑞霞，汪蕓，包貴賢

中山市中醫(yī)院病理科，廣東 中山 528400

腎細(xì)胞癌（renal cell carcinoma，RCC）是最常見(jiàn)的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其最常見(jiàn)的病理類型為透明細(xì)胞性腎細(xì)胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）。近年來(lái)，RCC的發(fā)病率呈逐年上升且年輕化趨勢(shì)[1]，嚴(yán)重威脅人們的健康與生命。目前，臨床上主要以根治性腎切除術(shù)為主要治療方案，但是由于大部分RCC患者早期缺乏典型的臨床癥狀，確診時(shí)已進(jìn)展至中晚期，錯(cuò)過(guò)了手術(shù)的最佳時(shí)機(jī)；此外，RCC對(duì)放化療的敏感性較差[2-3]。目前，臨床上對(duì)于ccRCC的治療仍然缺乏有效的手段，患者預(yù)后較差，因此，尋找新的潛在靶點(diǎn)一直是RCC治療領(lǐng)域探討的重點(diǎn)。胞質(zhì)型多聚腺苷酸化元件結(jié)合蛋白4（cytoplasmic polyadenylation element binding protein 4，CPEB4）是具有特異性RNA結(jié)合序列的胞質(zhì)型多聚腺苷酸化元件結(jié)合蛋白（cytoplasmic polyadenylation element binding protein，CPEB）家族成員之一，與絲裂原激活蛋白激酶（mitogen-activation protein kinase，MAPK）/胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）信號(hào)通路有關(guān)，近年來(lái)，已引起細(xì)胞生物學(xué)家的廣泛關(guān)注[4]。有研究顯示，CPEB4對(duì)不同腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的調(diào)控機(jī)制不甚相同，在乳腺癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、前列腺癌等腫瘤組織中高表達(dá)，而在非小細(xì)胞肺癌和肝癌組織中低表達(dá)[5-6]，但目前關(guān)于CPEB4在ccRCC患者ccRCC組織中的表達(dá)情況及其與患者臨床特征的關(guān)系尚未見(jiàn)明確報(bào)道。本研究通過(guò)分析ccRCC患者的79例ccRCC組織和32例癌旁正常組織中CPEB4的表達(dá)情況及其臨床意義，旨在為ccRCC的診斷、治療及預(yù)后評(píng)價(jià)提供新的思路和潛在靶點(diǎn)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年8月至2016年7月中山市中醫(yī)院收治的ccRCC患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理學(xué)檢查確診為原發(fā)性ccRCC；②行根治性腎切除術(shù)前未接受過(guò)放化療或新輔助治療等抗腫瘤治療；③臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并糖尿病、高血壓、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病，以及腎臟、肝臟、肺臟疾病等嚴(yán)重的原發(fā)性基礎(chǔ)病變；②合并其他部位惡性腫瘤；③合并血液和免疫系統(tǒng)疾病。根據(jù)納入、排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入76例ccRCC患者，其中，男47例，女29例；年齡為26～81歲，平均年齡為（59.78±10.36）歲；根據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（American Joint Committee on Cancer，AJCC）制定的腎癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)[7]對(duì)患者進(jìn)行TNM分期：Ⅰ期27例，Ⅱ期30例，Ⅲ～Ⅳ期19例；根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）組織學(xué)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[8]對(duì)患者進(jìn)行組織學(xué)分級(jí)：Ⅰ級(jí)19例，Ⅱ級(jí)23例，Ⅲ級(jí)34例；左側(cè)腎病變患者41例，右側(cè)腎病變患者35例。收集76例ccRCC患者的ccRCC組織及其中32例患者的癌旁（距腫瘤外緣≥5 cm）正常組織石蠟包埋標(biāo)本進(jìn)行研究。

1.2 主要試劑與儀器

Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；cDNA合成試劑盒、熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒均購(gòu)自北京OMEGA生物公司；PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成并提供；兔抗人CPEB4抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。Eppendorf 5427R型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)和各種型號(hào)的移液器均購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；CX41倒置光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本OLYMPUS公司；電子分析天平購(gòu)自中國(guó)上海玉研科學(xué)儀器有限公司；恒溫水浴搖床和YCZ-40D型轉(zhuǎn)移電泳槽均購(gòu)自北京六一儀器廠；實(shí)時(shí)定量PCR儀和GelDoc XR System凝膠成像數(shù)碼分析系統(tǒng)均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；HWA-50D恒溫水浴鍋購(gòu)自韓國(guó)Autonics公司；UV-8000紫外分光光度計(jì)購(gòu)自上海精密儀器儀表公司。

1.3 觀察指標(biāo)

檢測(cè)不同組織中CPEB4mRNA和蛋白的陽(yáng)性表達(dá)情況，分析ccRCC組織中CPEB4mRNA和蛋白的陽(yáng)性表達(dá)情況與患者臨床特征及預(yù)后的關(guān)系，分析ccRCC患者預(yù)后的影響因素。

1.4 免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)不同組織中CPEB4蛋白的表達(dá)情況及結(jié)果判定

嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作進(jìn)行，具體步驟：①按照病理編號(hào)調(diào)出病理科存檔的ccRCC組織和癌旁正常組織標(biāo)本，常規(guī)石蠟包埋并連續(xù)切片，脫蠟、水化，將切片平鋪置于載玻片上，烘干48 h后待用；②加熱修復(fù)抗原；③滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；④封閉；⑤加入 50 μl CPEB4一抗（1∶500稀釋），4℃孵育過(guò)夜；⑥加入50 μl山羊抗兔二抗，室溫孵育30 min；⑦滴加DAB試劑顯色；⑧蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水、透明和封片。在染色后的病理切片中，由2位以上經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師在高倍鏡（×400）下隨機(jī)選擇每張切片中的10個(gè)不重復(fù)視野進(jìn)行閱片。采用半定量計(jì)分法計(jì)算ccRCC細(xì)胞的染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞所占比例。CPEB4蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占比例進(jìn)行評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞所占比例為0計(jì)0分，陽(yáng)性細(xì)胞所占比例≤25%計(jì)1分，陽(yáng)性細(xì)胞所占比例為26%～50%計(jì)2分，陽(yáng)性細(xì)胞所占比例為51%～75%計(jì)3分，陽(yáng)性細(xì)胞所占比例＞75%計(jì)4分。根據(jù)細(xì)胞的染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分：未染色計(jì)0分，弱染色計(jì)1分，中度染色計(jì)2分，強(qiáng)染色計(jì)3分。將染色強(qiáng)度評(píng)分和陽(yáng)性細(xì)胞所占比例評(píng)分相乘得最終總分：1～3分為低表達(dá)，4～12分為高表達(dá)。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)不同組織中CPEB4 mRNA 的表達(dá)情況及結(jié)果判定

組織DNA提取：按照病理編號(hào)調(diào)出病理科存檔的石蠟包埋組織切片，脫蠟水化后，切片，取100 mg組織置于EP管中；加入Trizol試劑提取總RNA，加入20μl焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）水溶解沉淀，分裝，置于-80℃保存?zhèn)溆?。采用凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)分別檢測(cè)RNA分子量及濃度。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：取5 μl RNA樣本置于PCR管中，70℃恒溫水浴鍋中靜置5 min，冰浴靜置1 min，加入20 μl逆轉(zhuǎn)錄試劑，混勻后離心。置于PCR儀中，設(shè)定25℃10 min，37℃60 min；將反應(yīng)產(chǎn)物置于-80℃保存?zhèn)溆?。采用?shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time PCR，RT-PCR）法檢測(cè)不同組織中CPEB4mRNA的表達(dá)情況，將25 μl反應(yīng)體系（Taq Mix 22 μl+cDNA 模板 1 μl+上下游引物各 1 μl）按照PCR程序進(jìn)行擴(kuò)增；反應(yīng)條件：95℃ 3 min預(yù)變性；95℃ 30 s變性，60℃30 s退火（β-actin、CPEB4的退火溫度分別為60℃、57.8℃），72℃5 min延伸；共循環(huán)40次。β-actin的上游引物為5'-TGGCGATGGCAGTGTCTTAG-3'，下游引物為5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'；長(zhǎng)度為334 bp。CPEB4的上游引物為5'-CAGCTTTGAGGTTCGTGTTTGT-3'，下游引物為5'-ATGCTCTTCTTTTTTGCGGAAA-3'；長(zhǎng)度為273 bp。根據(jù)實(shí)時(shí)定量PCR儀的使用說(shuō)明調(diào)整基線，將閾值設(shè)定在熒光值對(duì)數(shù)圖的線性部分，從軟件中讀取Ct值?；贑t值，采用2-△△Ct法計(jì)算CPEB4mRNA的相對(duì)表達(dá)量。CPEB4mRNA的相對(duì)表達(dá)量≥Ct平均值則判定為陽(yáng)性表達(dá)，否則為陰性表達(dá)。

1.6 隨訪

采用郵件、電話、信件及門(mén)診就診的方式對(duì)全部患者進(jìn)行隨訪。術(shù)后2年內(nèi)每3個(gè)月隨訪1次，后每6個(gè)月隨訪1次；隨訪時(shí)間為6～50個(gè)月，終點(diǎn)事件為患者死亡。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析ccRCC患者預(yù)后的影響因素。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ccRCC 組織和癌旁正常組織中CPEB4 mRNA及蛋白表達(dá)情況的比較

免疫組化染色結(jié)果顯示，ccRCC患者ccRCC組織中CPEB4蛋白的高表達(dá)率為57.89%（44/76），明顯高于癌旁正常組織中CPEB4蛋白的28.12%（9/32），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.985，P＜0.01）。RT-PCR法檢測(cè)結(jié)果顯示，ccRCC患者ccRCC組織中CPEB4mRNA的陽(yáng)性表達(dá)率為56.58%（43/76），明顯高于癌旁正常組織的18.75%（6/32），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=13.001，P＜0.01）。

2.2 不同臨床特征ccRCC患者ccRCC組織中CPEB4mRNA 陽(yáng)性表達(dá)情況的比較

不同年齡、性別、腫瘤部位的ccRCC患者ccRCC組織中CPEB4mRNA的陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；不同TNM分期、WHO組織學(xué)分級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的ccRCC患者ccRCC組織中CPEB4mRNA的陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征ccRCC患者ccRCC組織中CPEB4 mRNA陽(yáng)性表達(dá)情況的比較（n=76）

2.3 ccRCC組織中CPEB4mRNA表達(dá)與ccRCC患者預(yù)后的關(guān)系

截至隨訪結(jié)束，ccRCC患者的3年生存率為59.21%（45/76），其中，CPEB4mRNA陰性表達(dá)患者的3年生存率為60.61%（20/33），明顯高于CPEB4mRNA陽(yáng)性表達(dá)患者的58.14%（25/43），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.012，P＜0.01）。

2.4 ccRCC 患者預(yù)后的影響因素分析

Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析結(jié)果顯示，TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期和CPEB4mRNA陽(yáng)性表達(dá)是ccRCC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。（表2）

表2 ccRCC患者預(yù)后影響因素的Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析（n=76）

3 討論

RCC是一類起源于腎實(shí)質(zhì)泌尿小管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，約80%的患者為ccRCC患者，以根治性腎切除術(shù)為主要治療方式[9]。但是，部分ccRCC患者早期缺乏典型的臨床表現(xiàn)，確診時(shí)已錯(cuò)過(guò)手術(shù)的最佳時(shí)機(jī)。ccRCC對(duì)放化療不敏感，且部分ccRCC患者手術(shù)后會(huì)復(fù)發(fā)；對(duì)于此部分患者，目前尚缺乏有效的治療方案[10]。由于RCC具有高度的遺傳異質(zhì)性，涉及多種基因的突變或缺失，因此，尋找新的基因靶點(diǎn)是目前腎癌治療領(lǐng)域關(guān)注的重點(diǎn)[11]。

CPEB具有高度保守的特異性RNA識(shí)別序列，可促進(jìn)多聚腺苷酸化誘導(dǎo)的翻譯過(guò)程，與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及腫瘤血管生成等病理生理過(guò)程密切相關(guān)[12]。CPEB家族包含CPEB1、CPEB2、CPEB3、CPEB4 4個(gè)成員，各成員可單獨(dú)或相互作用，從而參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[13]。其中，CPEB4是poly（A）尾延伸和聚腺苷酸化誘導(dǎo)翻譯的關(guān)鍵因子，在多種腫瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)；通過(guò)與Ras信號(hào)通路中的相關(guān)分子、染色質(zhì)重塑相關(guān)蛋白、細(xì)胞周期蛋白、凋亡相關(guān)分子、壓力和炎性相關(guān)因子、代謝酶及侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因等結(jié)合，在腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、侵襲、凋亡等生物學(xué)行為中發(fā)揮著重要作用[14]。有研究顯示，CPEB4通過(guò)與兩個(gè)以上的胞質(zhì)聚腺苷酸化物結(jié)合，作為致癌因子參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及血管生成，并與大量癌基因或抑癌基因密切相關(guān)[15]。但是，在非小細(xì)胞肺癌和肝癌中，CPEB4的作用恰恰相反。國(guó)外有研究顯示，敲除CPEB4基因后，肝癌荷瘤小鼠的成瘤能力和腫瘤生長(zhǎng)活性增強(qiáng)[16]；而且肝癌或非小細(xì)胞肺癌患者的腫瘤組織中CPEB4的表達(dá)水平明顯低于相應(yīng)的癌旁正常組織中CPEB4的表達(dá)水平，且與患者的腫瘤分期呈負(fù)相關(guān)；提示CPEB4在肝癌和非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中可能作為抑癌分子發(fā)揮作用[17]。目前關(guān)于CPEB4在ccRCC組織中的表達(dá)情況及其與患者病理特征關(guān)系的研究相對(duì)較少。

本研究通過(guò)RT-PCR和免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)了76例ccRCC患者的ccRCC組織和其中的32例ccRCC患者相應(yīng)的癌旁正常組織中CPEB4的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，ccRCC患者ccRCC組織中CPEB4蛋白的高表達(dá)率明顯高于癌旁正常組織，CPEB4mRNA的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁正常組織（P＜0.01）；ccRCC患者ccRCC組織中CPEB4mRNA的陽(yáng)性表達(dá)率可能與患者的年齡、性別、腫瘤部位均無(wú)關(guān)，可能與患者的TNM分期、WHO組織學(xué)分級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況均有關(guān)。提示CPEB4可能參與ccRCC的發(fā)生、發(fā)展。另外，本研究又進(jìn)一步分析了ccRCC患者ccRCC組織中CPEB4mRNA的表達(dá)與ccRCC患者預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CPEB4mRNA陰性表達(dá)患者的3年生存率明顯低于CPEB4mRNA陽(yáng)性表達(dá)患者（P＜0.01）；Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析結(jié)果顯示，TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期和CPEB4mRNA陽(yáng)性表達(dá)是ccRCC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05），均提示CPEB4的表達(dá)水平越高，TNM分期越高，ccRCC患者的預(yù)后越差。

綜上所述，CPEB4mRNA和蛋白在ccRCC患者ccRCC組織中的表達(dá)水平較高，與ccRCC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)；此外，TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期和CPEB4mRNA陽(yáng)性表達(dá)的ccRCC患者的預(yù)后較差，對(duì)于指導(dǎo)ccRCC的臨床治療具有一定的參考價(jià)值。但是由于本研究納入的樣本量少，且關(guān)于CPEB4在ccRCC發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制尚不明確，因此，CPEB4是否可作為ccRCC患者預(yù)后的輔助評(píng)估指標(biāo)用于臨床尚需要大量研究驗(yàn)證。