二參湯對心力衰竭大鼠模型AngII 通路的干預(yù)與影響

王亞萍，王 萌，周麗雅

（1.吉林工程技術(shù)師范學(xué)院校醫(yī)院，長春 130000；2.長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院傳統(tǒng)診療中心，長春 130022；3.長春中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，長春 130117）

近年來，大量研究證明炎性反應(yīng)是導(dǎo)致CHF病理及生理的重要機制之一，且對于其炎癥通路及炎性細胞因子的研究也成為目前的研究熱點。當(dāng)前各項研究證實，AngII本身是一種強大的促炎癥因子，它能夠激活循環(huán)中的白細胞，并通過合成黏附分子、趨化因子等參與白細胞黏附至活化的內(nèi)皮細胞[1-2]。同時AngⅡ還是 RAAS系統(tǒng)的主要活性物質(zhì)，體內(nèi)的RAAS系統(tǒng)被激活，導(dǎo)致血管緊張素II（Ang II）的釋放增加，激活核因子-κB（NF-κB），進一步激活 TLR4，觸發(fā)細胞信號級聯(lián)反應(yīng)，而最終導(dǎo)致NF-κB 轉(zhuǎn)錄因子依賴的信號途徑的整體激活，進而形成各種炎性因子對血管壁的浸潤，使得CRP等炎性因子的過度表達，最終產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。因此，促炎癥因子AngII、核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和非特異性炎癥反應(yīng)物CRP的測定可以作為CHF病理、生理狀態(tài)及預(yù)后評價的一種標志物。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級雄性Wistar大鼠160只，體質(zhì)量（250±20）g，由長春中醫(yī)藥大學(xué)實驗中心提供。

1.2 藥物 1）藥物二參湯：黨參20 g，丹參20 g，川芎15 g，麥冬10 g，五味子10 g，木香10 g，降香10 g，薤白15 g，元胡15 g。生藥由長春吉林省中醫(yī)院制劑中心提供，由其中藥房代煎，長春中醫(yī)藥大學(xué)實驗研究室濃縮而成，其中藥液含生藥量為3. 36 g/mL，4℃冰箱保存。2）成藥：纈沙坦，北京諾華制藥有限公司，規(guī)格： 80 mg×7粒/盒，批號：201604。

1.3 試劑 兔抗鼠NF-κB p65單克隆抗體（C-20）：ZS-372，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗,北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；CRP ELIsA試劑盒，R&D system公司；碘[125I]血管緊張素II（AII）放射免疫分析藥盒，北京北方生物技術(shù)研究所。

1.4 主要儀器 旋渦混合器（上海XW-80A）；超聲器（MODELCV188）；數(shù)顯恒溫水箱 （金壇HH-W-420）；震蕩培養(yǎng)箱（哈爾濱HZQ-X100）；酶聯(lián)免疫檢測儀（上海DG5031）。

1.5 動物造模與分組 160只雄性Wistar大鼠隨機分出10只為假手術(shù)組，僅穿線不結(jié)扎冠狀動脈左前降支（全部存活） ；余下的150只大鼠參照文獻[3-4]采用結(jié)扎冠狀動脈左前降支的方法來建立急性心肌梗死大鼠模型，使用心臟彩超測定其心臟射血分數(shù)（ejection fraction, EF）＜60% 為造模成功，共43只，進而值篩選出EF指數(shù)最低的30只，隨機分為纈沙坦組、中藥組、模型組各10只。

1.6 給藥 假手術(shù)組和模型組給予滅菌蒸餾水每只2 mL/d，中藥組給藥量每只2.085 g/kg，纈沙坦組給藥量每只20 mg/kg。1次/d，連續(xù)灌胃28 d。

1.7 觀測項目

1.7.1 觀測各組心肌組織形態(tài)學(xué)變化 灌胃28 d后，實驗大鼠采用眼球取血法，并摘取心尖部部分心肌組織，于10% 福爾馬林溶液中固定一部分心肌組織；另一部分心肌組織于－80℃冰箱低溫保存。經(jīng)Masson染色法處理取部分心肌組織，觀測其形態(tài)學(xué)的變化。

1.7.2 檢測各組心肌NF-κB的蛋白表達 采用Western blot實驗檢測其心肌NF-κB的蛋白表達。于實驗大鼠左心室處提取50 mg心肌，同時提取總蛋白，電泳先以60 V電壓開始，至溴酚藍指示劑進入分離膠后，再將其電壓調(diào)整到120 V直至電泳結(jié)束。再于100 V恒壓轉(zhuǎn)膜60 min，隨后將膜移入含有5% 脫脂奶粉的0.1%Tween20的TBST溶液的自封袋中，在室溫下于搖床內(nèi)封閉l h。加一抗TLR4（1：200）、NF-κB p65（1：500），4℃冰箱過夜。次日再用TBST洗膜3次；再加入二抗（1：5000）于室溫內(nèi)在搖床內(nèi)搖動1 h。TBST洗膜3次，將A、B發(fā)光液以1：1的比例均勻混合，1 min后將混合液滴加于膜上，并使用保鮮膜封包。于暗室內(nèi)使用X光片曝光后常規(guī)方法顯影、定影，隨后用Image J軟件分析。

1.7.3 檢測各組血清中CRP的濃度 使用大鼠血清因子ELISA試劑盒，檢測各實驗組大鼠血清標本中CRP的濃度。

1.7.4 檢測各組 AngⅡ濃度 采用放射免疫分析分析藥盒測定組織、血漿AngⅡ的放射性計數(shù)（cpm）；之后用log-logit處理數(shù)據(jù)，得出結(jié)果（CONC）。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 運用SPSS 15.0數(shù)據(jù)分析軟件分析處理各項數(shù)據(jù)。結(jié)論得出每組實驗數(shù)據(jù)均為正態(tài)分布，方差齊，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實驗大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)改變 1）假手術(shù)組：大鼠心臟Masson染色以紅色的心肌細胞為主，且心肌組織間分布均勻，結(jié)構(gòu)清晰，細胞排列整齊，細胞間隙窄，且心肌細胞間質(zhì)與周圍血管之間無明顯綠色膠原纖維。2）模型組：CHF大鼠心肌細胞間質(zhì)、血管周圍均可見大量的綠色膠原纖維沉積，并有瘢痕形成，部分心肌組織已被膠原纖維組織所取代，心肌細胞肥大，且圍繞于心肌細胞的膠原纖維出現(xiàn)斷裂、排列紊亂，細胞間隙增寬，血管壁增厚，纖維化程度重。3）給藥組：各給藥組CHF大鼠心肌間質(zhì)纖維化程度介于上述2組之間，但較模型組均有不同程度的減輕，其中二參湯組與纈沙坦組無明顯差異。見圖1。

圖1 各組心肌組織形態(tài)學(xué)改變

2.2 各組藥物對CHF 大鼠心肌NF-κB 表達的影響 見圖2、表1。

圖2 各組藥物對CHF 大鼠心肌NF-κB 表達的影響

表1 各組藥物對 CHF 大鼠心肌NF-κB蛋白表達量的比較（ ） pg/mL

表1 各組藥物對 CHF 大鼠心肌NF-κB蛋白表達量的比較（ ） pg/mL

注：與模型組比較，# P＜0.05；與假手術(shù)組比較，△△P＜0.01

組 別 n NF-κB假手術(shù)組 10 12993.38±198.67#模型組 10 108335.01±176.54△△二參湯組 10 32244.94±215.96#纈沙坦組 10 31463.57±228.09#

2.3 各組血清中CRP含量比較 見表2。

表2 各組血清中CRP含量比較（ ） pg/mL

表2 各組血清中CRP含量比較（ ） pg/mL

注：與模型組比較，# P＜0.05；與假手術(shù)組比較，△△P＜0.01

組 別 n CRP含量假手術(shù)組 10 1236.23±32.72#模型組 10 2151.68±11.05△△二參湯組 10 1479.43±14.41#纈沙坦組 10 1535.29±29.74#

2.4 各組 AngⅡ濃度比較 見表3。

表3 各組 AngⅡ濃度比較（ ，n = 10） pg/mL

表3 各組 AngⅡ濃度比較（ ，n = 10） pg/mL

注：與模型組比較，# P＜0.05；與假手術(shù)組比較，△△P＜0.01

組 別 心肌中 AngⅡ含量 血漿中 AngⅡ含量假手術(shù)組 629.30±27.05# 220.75±16.26#模型組 1480.73±16.30△△ 759.09±7.15△△二參湯組 938.49±27.06# 435.23±14.29#纈沙坦組 955.78±29.76# 454.55±13.42#

3 討論

研究證實，AngII本身是一種強大的促炎癥因子，它能夠激活循環(huán)中的白細胞，并通過合成黏附分子、趨化因子等參與白細胞黏附至活化的內(nèi)皮細胞。通過對RAAS系統(tǒng)的深入研究，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一條心衰的炎癥反應(yīng)鏈，即體內(nèi)的RAAS系統(tǒng)被激活，導(dǎo)致Ang II的釋放增加，激活NF-κB，形成各種炎性因子對血管壁的浸潤，使得TNF-α、IL-6及CRP等炎性因子的過度表達，最終產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。有研究證實，Ang II可以上調(diào)TLR4的表達，這可能是Ang II的致炎作用之一[5]，并且它通過TLR4/NF-κB通路介導(dǎo)血管平滑肌細胞的炎性反應(yīng)[6]。研究證明，AngⅡ是 RAAS系統(tǒng)的主要活性物質(zhì)，在正常生理狀態(tài)下，心肌局部的AngⅡ水平基本保持在10～8 mol/L左右，調(diào)節(jié)血管收縮及水鹽代謝；但在高血壓、心肌缺血或心力衰竭等病理條件下，心肌組織局部的AngⅡ水平便能上升到10～7 mol/L以上，而此時則能夠?qū)е滦募》蚀蠹把苤貥?gòu)。近些年通過對RAAS系統(tǒng)的深入研究，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一條心衰的炎癥反應(yīng)鏈，即Ang II釋放→激活NF-κB→啟動細胞因子CRP最終導(dǎo)致炎癥反應(yīng)。所以Ang II無論是從RAAS系統(tǒng)，還是從炎癥通路，均能促使心力衰竭的進一步發(fā)展和惡化，所以抑制Ang II的升高，便能夠切段該反映鏈，進而在一定程度上控制心衰的發(fā)展。

本次實驗結(jié)果顯示，模型組AngII含量最高，假手術(shù)組含量最低，各給藥組含量均較模型組有所降低，其中以二參湯組最為顯著。說明二參湯、纈沙坦均能抑制AngII的生成，在一定程度上阻斷Ang II在CHF中的傳導(dǎo)途徑，對控制CHF的進一步發(fā)展起到了作用。