吉林省花生秧與花生殼的體外發(fā)酵特性

鄭 琳，魏炳棟，張立春，何中國(guó)，于 維，趙嶺樂(lè)，王 欣

（1. 吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧科學(xué)分院，吉林 公主嶺 136100；2. 吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花生所，吉林 公主嶺 136100；3. 公主嶺市環(huán)保局，吉林 公主嶺 136100）

隨著畜牧業(yè)的不斷發(fā)展，常規(guī)飼料資源的需求量已不能滿(mǎn)足畜牧業(yè)發(fā)展的要求，飼料資源的不當(dāng)處理，也造成了嚴(yán)重的環(huán)境問(wèn)題。如何合理利用飼料資源是緩解飼料資源短缺和保護(hù)生態(tài)環(huán)境的關(guān)鍵[1]。羊草(Leymus chinensis)作為吉林省西部草原區(qū)的優(yōu)勢(shì)草種，其適口性強(qiáng)，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，是東北地區(qū)牧場(chǎng)種植的優(yōu)良草種[2]。由于其產(chǎn)量高、質(zhì)量?jī)?yōu)，也是吉林省各種草食家畜的優(yōu)質(zhì)干草資源[3]?；ㄉ?Arachis hypogaea)是我國(guó)重要的油料作物之一，種植面積僅次于油菜(Brassica campestris)，位居第二，花生秧與花生殼是花生收割時(shí)期產(chǎn)生的農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物[4]。花生秧作為一種優(yōu)質(zhì)飼料資源，國(guó)內(nèi)學(xué)者分別從地區(qū)[5]、品種[6]、收獲時(shí)間和高度[7-8]等方面對(duì)其進(jìn)行了營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)定；馮豆等[9]首次利用近紅外反射光譜技術(shù)快速檢測(cè)花生秧的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分，該技術(shù)能夠精準(zhǔn)預(yù)測(cè)花生秧中的干物質(zhì)(dry matter, DM)、粗蛋白質(zhì)(crude protein, CP)及中性洗滌纖維(neutral detergent fibre,NDF)含量；黃帥等[10]和楊雪海等[11]也對(duì)不同地區(qū)的花生殼進(jìn)行了營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)定。

羊草作為吉林省的優(yōu)質(zhì)飼草資源已在畜牧業(yè)中得到了廣泛的應(yīng)用，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值方面的研究相對(duì)較多，但對(duì)于吉林省花生副產(chǎn)物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值研究還鮮見(jiàn)報(bào)道。且國(guó)內(nèi)關(guān)于花生副產(chǎn)物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)定多集中于常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分分析及瘤胃降解特性等方面的研究，對(duì)于體外發(fā)酵特性方面的研究也甚少。體外產(chǎn)氣法是評(píng)定粗飼料營(yíng)養(yǎng)成分可利用率的一種方法，該方法可根據(jù)不同粗飼料在一定時(shí)間內(nèi)產(chǎn)氣量與產(chǎn)氣速率的不同，來(lái)估測(cè)其有機(jī)物的消化率，與其他方法相比，重復(fù)性好、自動(dòng)化程度高，得到了國(guó)內(nèi)外的廣泛認(rèn)可[12]。

因此，本研究利用體外產(chǎn)氣法分析花生秧、花生殼與羊草3 種粗飼料的體外發(fā)酵特性，以羊草作為對(duì)照，通過(guò)比較花生副產(chǎn)物與羊草各發(fā)酵參數(shù)的不同對(duì)其進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)定，以期為吉林省花生副產(chǎn)物的合理開(kāi)發(fā)與利用提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 飼料原料的采集與處理

試驗(yàn)所用花生秧采于吉林省雙遼地區(qū)，9 月20 日收割，品種名為“科富花2 號(hào)”；花生殼粉碎后制粒；羊草采于吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧科學(xué)分院。原料經(jīng)采集后于65 ℃烘干制成風(fēng)干樣品，粉碎過(guò)1 mm 篩，密封保存以備用。3 種飼料原料的營(yíng)養(yǎng)成分如表1 所列。

表 1 3 種粗飼料的營(yíng)養(yǎng)成分(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Nutritional components of three types of roughage (DM basis)

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)所選用的瘤胃液供體牛為3 頭健康，年齡、體重相近的裝有永久性瘤胃瘺管的草原紅牛，每天于08:00 和18:00 各飼喂一次，自由采食羊草，自由飲水。

1.3 體外產(chǎn)氣試驗(yàn)

1.3.1 人工瘤胃緩沖液的制備

人工瘤胃緩沖液配制參照Menke 和Steingass[13]的方法。量取520.2 mL 蒸餾水，分別加入0.1 mL A 液、208.1 mL B 液、208.1 mL C 液 和1.0 mL D 液 于1 000 mL 容量瓶中，放置過(guò)夜，臨用前加入62.4 mL E 液，至于39 ℃恒溫水浴中，持續(xù)沖入CO2氣體，直至緩沖液由淺藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)榻鼰o(wú)色即可[14]。

1.3.2 瘤胃液的采集

試驗(yàn)當(dāng)日晨飼前，分別從3 頭供試動(dòng)物的瘤胃內(nèi)采集足量的瘤胃液于存有CO2氣體的保溫瓶中，蓋嚴(yán)瓶口，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。攪拌均勻后經(jīng)尼龍布過(guò)濾，將濾液置于39 ℃恒溫水浴中，并持續(xù)沖入CO2氣體以確保瘤胃液處于厭氧環(huán)境。

1.3.3 試驗(yàn)過(guò)程

稱(chēng)取2 g 飼料原料于發(fā)酵罐中，置于39 ℃恒溫水浴中預(yù)熱30～60 min，然后加入之前配置好的緩沖液和瘤胃液，緩沖液與瘤胃液的比例為2∶1，緩沖液100 mL，瘤胃液50 mL，于39 ℃的水浴搖床中進(jìn)行體外發(fā)酵，轉(zhuǎn)速為80 r·min-1，每個(gè)樣品5 個(gè)重復(fù)，并設(shè)定空白對(duì)照，利用Qtfxy-6 型產(chǎn)氣裝置進(jìn)行體外產(chǎn)氣量數(shù)據(jù)的采集[15]。發(fā)酵結(jié)束后將發(fā)酵液于-20 ℃保存，用于后續(xù)各項(xiàng)發(fā)酵參數(shù)的測(cè)定。

1.4 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.4.1 常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分

3 種粗飼料的干物質(zhì)(dry matter, DM)、粗蛋白質(zhì)(crude protein, CP)、鈣(Ca)和磷(P)的測(cè)定參照張麗英[16]的方法。中性洗滌纖維(neutral detergent fibre, NDF)和酸性洗滌纖維(acid detergent fibre,ADF)的測(cè)定參照Van Soest[17]的方法。

1.4.2 產(chǎn)氣量及產(chǎn)氣動(dòng)力學(xué)參數(shù)

產(chǎn)氣裝置自動(dòng)采集每個(gè)發(fā)酵罐每6 min 的平均產(chǎn)氣量，通過(guò)計(jì)算獲得2、4、6、8、12、24 h 各時(shí)間點(diǎn)的累計(jì)產(chǎn)氣量，根據(jù)以下公式計(jì)算產(chǎn)氣量：

式中：GPt為在t 時(shí)間點(diǎn)累計(jì)發(fā)酵產(chǎn)氣量(mL·g)-1，Vt為樣品罐指定時(shí)間內(nèi)的累計(jì)產(chǎn)氣量(mL)，V0為空白罐指定時(shí)間內(nèi)的累計(jì)產(chǎn)氣量(mL)，W 為樣品干物質(zhì)含量(g)。

產(chǎn)氣動(dòng)力學(xué)參數(shù)依據(jù)France 等[18]提出的方程進(jìn)行計(jì)算，方程如下：

式中：GPt為在t 時(shí)間點(diǎn)累計(jì)發(fā)酵產(chǎn)氣量(mL·g-1)，A 為 理 論 最 大 產(chǎn) 氣 量(mL·g-1)，b 為 產(chǎn) 氣 速 率(mL·h-1)，LAG 為體外發(fā)酵產(chǎn)氣延滯時(shí)間(h)，t 為發(fā)酵時(shí)間(h)。

根據(jù)式(3)計(jì)算達(dá)到最大產(chǎn)氣量1/2 時(shí)的產(chǎn)氣速率(AGPR, mL·h-1)[19]：

1.4.3 pH

發(fā)酵結(jié)束后立即用pHS-3C 型pH 計(jì)測(cè)定各發(fā)酵液的pH。

1.4.4 氨態(tài)氮

取發(fā)酵液10 mL，5 400 r·min-1離心10 min，取上清液做適當(dāng)稀釋?zhuān)瑓⒄振T宗慈和高民[20]改進(jìn)方法，采用L9 型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定吸光度值，波長(zhǎng)700 nm，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及吸光度值求出發(fā)酵液的氨態(tài)氮濃度。

1.4.5 微生物蛋白

采用差速離心法分離獲得細(xì)菌組分[21]。發(fā)酵結(jié)束后取發(fā)酵液50 mL 經(jīng)四層紗布過(guò)濾，于1 200 r·min-1離 心15 min 去 除 原 蟲(chóng) 和 飼 料 大 顆 粒，將 上清液于7 630 r·min-1離心30 min，棄去上清液，用9%的生理鹽水重懸菌體，清洗兩次，沉淀即為細(xì)菌組分，采用凱氏定氮法測(cè)定細(xì)菌組分的微生物蛋白濃度。

1.4.6 揮發(fā)性脂肪酸

樣品前處理：發(fā)酵液搖勻之后，取樣加入2 mL水(1∶3 磷酸水溶液)，渦旋均漿2 min，加入2 mL乙醚萃取10 min，4 000 r·min-1離心20 min (做低溫處理，放置于冰水浴中離心)；離心后取出乙醚相，再加入2 mL 乙醚萃取10 min，4 000 r·min-1離心分離，離心后再次取出乙醚相，將兩次萃取液合并揮發(fā)定容至2 mL，進(jìn)樣分析。

用賽默飛世爾氣質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行分析。色譜柱為T(mén)G WAX 30 m × 0.25 mm × 0.25 μm。升溫程序：初始溫度100 ℃，保留5 min，以5 ℃·min-1升溫至150 ℃，再以30 ℃·min-1升溫至240 ℃，保留30 min。流速1 mL·min-1，分流比75∶1，載氣為氦氣，進(jìn)樣器溫度240 ℃。質(zhì)譜：EI 源；轟擊電壓：70 eV；單離子掃描模式：定量離子60、73；離子源溫度：200 ℃；連接線(xiàn)溫度：250 ℃。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

3 種粗飼料不同時(shí)間點(diǎn)的體外產(chǎn)氣量和體外發(fā)酵數(shù)據(jù)先經(jīng)Excel 2007 進(jìn)行初步整理，然后利用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)和顯著性檢驗(yàn)，采用Duncan 氏法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較，試驗(yàn)結(jié)果用平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤表示，差異顯著的判定標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05；通過(guò)SAS 9.1軟件的NON-LINEAR 方法計(jì)算產(chǎn)氣動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 3 種粗飼料的體外發(fā)酵產(chǎn)氣量及產(chǎn)氣動(dòng)力學(xué)參數(shù)

3 種粗飼料在不同時(shí)間點(diǎn)的累計(jì)產(chǎn)氣量和達(dá)到最大產(chǎn)氣量1/2 時(shí)的產(chǎn)氣速率結(jié)果一致，為花生秧 ＞ 花生殼 ＞ 羊草，三者之間差異顯著(P＜0.05)；花生秧的理論最大產(chǎn)氣量顯著高于花生殼和羊草(P ＜0.05)，花生殼與羊草之間差異不顯著(P ＞ 0.05)；羊草的產(chǎn)氣速率和產(chǎn)氣延滯時(shí)間顯著高于花生秧和花生殼，三者之間差異顯著(P＜0.05) (表2)。

表 2 3 種粗飼料不同時(shí)間點(diǎn)產(chǎn)氣量及產(chǎn)氣動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 2 GP at different time points and kinetic parameters of three types of roughage

2.2 3 種粗飼料體外發(fā)酵24 h 的pH 及揮發(fā)性脂肪酸含量

體外發(fā)酵24 h 后，3 種粗飼料的pH 為羊草最高，花生秧最低，三者之間差異顯著(P ＜0.05)；乙酸比例無(wú)顯著性差異(P ＞ 0.05)；丙酸的比例為花生秧最高，其次是花生殼，羊草最低，三者之間差異顯著(P＜0.05)；丁酸的比例為羊草最高，其次是花生殼，花生秧最低，三者之間差異顯著(P＜0.05)；總揮發(fā)性脂肪酸含量為花生秧最高，且顯著高于花生殼和羊草(P＜0.05)，花生殼與羊草之間差異不顯著(P ＞ 0.05)；乙酸/丙酸的值為羊草最高，且顯著高于花生秧和花生殼(P＜0.05)，花生秧與花生殼之間差異不顯著(P ＞ 0.05) (表3)。

2.3 3 種粗飼料體外發(fā)酵24 h 的氨態(tài)氮濃度及微生物蛋白含量

氨態(tài)氮濃度為羊草最高，且顯著高于花生秧和花生殼(P＜0.05)，花生秧與花生殼之間差異不顯著(P ＞ 0.05)。微生物蛋白含量為花生秧最高，羊草最低，三者之間差異顯著(P＜0.05) (表4)。

3 討論

3.1 不同粗飼料對(duì)體外產(chǎn)氣量及產(chǎn)氣動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響

體外發(fā)酵期間產(chǎn)生的氣體主要包括瘤胃微生物發(fā)酵底物產(chǎn)生的二氧化碳、甲烷及揮發(fā)性脂肪酸經(jīng)緩沖作用生成的二氧化碳[22]。累計(jì)產(chǎn)氣量的高低一定程度上反映了瘤胃微生物對(duì)發(fā)酵底物的利用程度和瘤胃微生物的自身活性[23]。湯少勛等[24]研究發(fā)現(xiàn)，不同品種秸稈在各時(shí)間點(diǎn)的產(chǎn)氣量與NDF、ADF 含量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，本研究中3 種粗飼料在各時(shí)間點(diǎn)的產(chǎn)氣量由高到低為花生秧 ＞ 花生殼 ＞ 羊草，其各自的NDF 含量大小為花生殼 ＞ 羊草 ＞ 花生秧，其產(chǎn)氣量與NDF 含量趨勢(shì)相反，與前人研究結(jié)果一致。花生殼的產(chǎn)氣量低是由于木質(zhì)素含量高，不易被消化利用。黃帥等[10]利用康奈爾凈碳水化合物-蛋白質(zhì)體系(Cornell Net Carbohy drate and Protein System, CNCPS)計(jì)算得出花生殼不可利用的細(xì)胞壁含量高達(dá)47.94%，進(jìn)一步說(shuō)明了花生殼不易被微生物利用。

本研究中3 種粗飼料的理論最大產(chǎn)氣量由高到低為花生秧 ＞ 花生殼 ＞ 羊草，可能與3 種粗飼料營(yíng)養(yǎng)成分的不同有關(guān)，有研究報(bào)道[25]，理論最大產(chǎn)氣量的高低與粗飼料中可溶性非結(jié)構(gòu)碳水化合物與粗蛋白比例正相關(guān)。

3.2 不同粗飼料對(duì)pH 及揮發(fā)性脂肪酸的影響

pH 能夠直觀地反映瘤胃的發(fā)酵狀況，同時(shí)也是反映瘤胃內(nèi)VFA 酸度的重要指標(biāo)。正常情況下反芻動(dòng)物瘤胃液的pH 變化范圍為5.5～7.5，當(dāng)pH低于6.5 時(shí)，纖維物質(zhì)的消化受到影響，當(dāng)pH 低于5.5 時(shí)，則會(huì)引起酸中毒[26]。本研究中，3 種粗飼料的體外發(fā)酵液pH 在6.67～7.23，均在正常變化范圍之內(nèi)，且不會(huì)影響對(duì)纖維物質(zhì)的消化。揮發(fā)性脂肪酸是飼料中碳水化合物經(jīng)厭氧發(fā)酵的終產(chǎn)物，為反芻動(dòng)物提供總能量的70%～80%，是維持動(dòng)物自身生命活動(dòng)的主要能源。瘤胃內(nèi)pH 的高低與TVFA 的含量有關(guān)，TVFA 含量的增加會(huì)降低瘤胃液的pH，本研究中3 種粗飼料的pH 和TVFA的變化趨勢(shì)相反。其中花生秧的TVFA 含量和丙酸比例顯著高于花生殼和羊草，乙酸/丙酸比值最低；羊草的TVFA 含量和丙酸比例顯著低于花生秧和花生殼，乙酸/丙酸比值顯著高于花生秧和花生殼，其原因可能與飼料中碳水化合物的組成不同有關(guān)，非結(jié)構(gòu)碳水化合物(nonstructural carbohydrate，NSC)含量的增加會(huì)加快瘤胃的發(fā)酵速率，使其產(chǎn)生更多的VFA，其發(fā)酵類(lèi)型為丙酸型發(fā)酵，乙酸/丙酸的比值會(huì)降低[27]，黃帥等[10]計(jì)算得出花生秧的NSC 為76.86%，而羊草的NSC 僅為14.01%。研究表明，不同類(lèi)型日糧對(duì)VFA 的濃度和比例有較大影響，其總量在60～150 mmol·L-1，單個(gè)酸之間的比例范圍為乙酸(40%～75%)∶丙酸(15%～40%)∶丁酸(10%～20%)[28]。本研究中，3 種粗飼料的TVFA 含量范圍為15.18～24.33 mmol·L-1，乙酸比例為46%左右，丙酸比例為23%～28%，丁酸比例為20%～25%。TVFA 含量偏低，可能與供試動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收有關(guān)；丁酸比例偏高，其原因可能是瘤胃微生物的種群差異所造成的，瘤胃中原蟲(chóng)有利于丁酸的產(chǎn)生，其研究報(bào)道稱(chēng)祛除原蟲(chóng)可將瘤胃的發(fā)酵類(lèi)型從丁酸型發(fā)酵向丙酸型發(fā)酵轉(zhuǎn)變。

表 3 3 種粗飼料體外發(fā)酵24 h 的pH 及VFA 含量Table 3 pH and VFA content of three types of roughage after 24 h of in vitro fermentation

表 4 3 種粗飼料體外發(fā)酵24 h 的氨態(tài)氮濃度及微生物蛋白含量Table 4 Ammonia nitrogen concentration and microbial protein content of three types of roughage after 24 h of in vitro fermentation

3.3 不同粗飼料對(duì)瘤胃體外發(fā)酵氨態(tài)氮濃度和微生物蛋白含量的影響

瘤胃內(nèi)氨態(tài)氮濃度和微生物蛋白含量是研究瘤胃發(fā)酵的重要指標(biāo)。氨態(tài)氮濃度可以綜合反映飼料中蛋白質(zhì)降解與瘤胃中微生物蛋白合成之間的平衡。瘤胃微生物生長(zhǎng)的最佳氨態(tài)氮濃度為6～9 mg·dL-1，過(guò)高或過(guò)低都不利于微生物蛋白的合成。本研究中，3 種粗飼料的氨態(tài)氮濃度范圍為6.83～12.09 mg·dL-1。羊草的氨態(tài)氮濃度過(guò)高，不利于微生物的生長(zhǎng)。MCP 的合成離不開(kāi)氨態(tài)氮，瘤胃內(nèi)適宜的能氮比例會(huì)促進(jìn)MCP 的合成。3 種粗飼料中花生秧的氨態(tài)氮濃度和MCP 含量均高于花生殼，說(shuō)明微生物對(duì)其合成MCP 的利用率較高。羊草的氨態(tài)氮濃度最高，但MCP 含量最低，可能是瘤胃內(nèi)降解產(chǎn)生的氨超過(guò)了最適范圍，過(guò)量的氨不能被微生物充分利用，從而降低了MCP的合成量。

4 結(jié)論

體外發(fā)酵24 h 后，花生秧的體外產(chǎn)氣量、TVFA、丙酸比例及MCP 含量顯著高于花生殼和羊草，pH 顯著低于花生殼和羊草。羊草的丁酸比例、乙酸/丙酸值及氨態(tài)氮濃度顯著高于花生秧和花生殼。綜合各項(xiàng)指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，花生秧的體外發(fā)酵效果最好，更易被瘤胃微生物利用；花生殼的纖維木質(zhì)化程度高，對(duì)其進(jìn)行預(yù)處理，如粉碎、氨化、青貯等可提升其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。