不同甲酯化方法分析羊肉膻味脂肪酸

李秋桐，蘇偉，母應春

(貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴陽 550025)

肉類及其制品是人類飲食構成的重要組成部分，尤其是高蛋白、低脂肪和低膽固醇的羊肉，其消費需求量隨著人們生活水平的提升不斷凸顯[1，2]。貴州省羊產(chǎn)業(yè)主要以肉食為主，存欄羊中山羊占95%，綿羊占5%[3]，主要品種包括白山羊、黑山羊、黔北麻羊和晴隆綿羊等。但羊肉產(chǎn)量僅占肉類總產(chǎn)量的2.1%，且肉羊產(chǎn)業(yè)仍面臨著一系列問題，其中很大一個因素是羊肉特有的“膻味”，一定程度上降低了人們對羊肉的可接受程度，不利于羊肉市場的發(fā)展。

Brennand等[4]對羊肉的膻味進行了研究，發(fā)現(xiàn)羊肉的這種特征風味物質主要來源于脂肪組織。脂肪酸的組成會對肉品的風味產(chǎn)生一定影響，8～10個碳原子的不飽和脂肪酸對羊肉的風味影響很大，特別是4-甲基辛酸和4-乙基辛酸是引起羊肉膻味的主要脂肪酸[5，6]。4-甲基辛酸，具有蠟樣的豬肉、牛肉和焙烤羔羊的脂肪香氣，并有奶油、牛奶和內酯香韻，是羊肉的特征香氣成分[7]。4-乙基辛酸俗稱羊油酸，它存在于煮羊肉、烤羊肉、羊脂肪、山羊奶酪、綿羊奶酪、廣木香、弗吉尼亞煙草中[8]。因此，對這兩種脂肪酸進行測定，對研究羊肉的膻味形成機理及除膻技術具有特殊意義。

低級的脂肪酸通常為無色、有刺激性氣味的液體，具有一定的揮發(fā)性，需要將其衍生成脂肪酸甲酯才能檢測[9]。但脂肪酸甲酯化方法眾多，不同的方法適用于不同的脂肪酸。目前動植物油脂的脂肪酸甲酯制備主要參照GB 5009.168—2016進行，將提取出的游離脂肪在三氟化硼-甲醇等催化下生成脂肪酸甲酯，采用氣相色譜法測定。丁艷艷等[10]在脂肪樣品中加入NaOH溶液和混有內標的乙醚溶液，置入烘箱中皂化2 h，用H2SO4溶液調節(jié)pH至酸性，同時用蒸餾裝置對4-甲基辛酸和4-甲基壬酸進行萃取，測定不同品種綿羊的膻味物質。目前為止，有關4-甲基辛酸和4-乙基辛酸的甲酯化方法鮮有報道。

因此，本試驗對4-甲基辛酸和4-乙基辛酸采用6種不同的甲酯化方法進行研究，并篩選出適合羊肉中4-甲基辛酸和4-乙基辛酸甲酯化處理的方法。以期為研究羊肉膻味物質及除膻技術提供技術支撐，為推動貴州肉羊產(chǎn)業(yè)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

試驗脂肪樣品：分別采自于白山羊、黑山羊、黔北麻羊和晴隆綿羊，均為周歲雄性羊后腿皮下脂肪組織，每個樣品質量約為100 g。

4-甲基辛酸、4-乙基辛酸標準液(純度≥98.0%)：美國Sigma公司；甲醇、正己烷(色譜純)：美國天地有限公司；三氟化硼-甲醇溶液(純度14%)：上海麥克林生化科技有限公司；氫氧化鉀、氫氧化鈉(分析純)：成都金山化學試劑有限公司；濃硫酸(分析純)：重慶川東化工有限公司；超純水。

Trace DSQ氣質聯(lián)用儀 美國Finnigan公司；HP-FFAP色譜柱(50 m×0.20 mm，0.25 μm) 美國安捷倫科技有限公司；N-1100旋轉蒸發(fā)儀 上海愛朗儀器有限公司；XW-80渦旋振蕩器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；TGL20M離心機 長沙邁佳森儀器設備有限公司；NAI-DCY-12GD氮吹儀 上海那艾精密儀器有限公司；DK-98-II恒溫水浴箱 天津泰斯特儀器有限公司；FA2004N電子天平 上海青海儀器有限公司；0.22 μm有機濾膜 天津市領航實驗設備有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 脂肪的提取

試驗前將各樣品脂肪絞碎，以5000 r/min均質化5 min，用錫箔紙包好置于冰箱-8 ℃下保存，備用。分別稱取均質化后的脂肪樣品5.0 g，用濾紙包好后放入索氏提取器中，以石油醚為溶劑，在60 ℃恒溫條件下連續(xù)抽提6 h。用旋轉蒸發(fā)儀除去提取物中的有機溶劑，得到透明濃稠狀的粗脂肪油。

1.2.2 標準品溶液的配制

準確稱取4-甲基辛酸和4-乙基辛酸各100.0 mg，混合并用正己烷定容至50 mL，即為脂肪酸標準溶液。準確量取標準溶液100，200，500，1000，2000，5000 μL至25 mL容量瓶中，用正己烷定容，配制成兩種脂肪酸濃度分別為8，16，40，80，160，400 μg/mL不同梯度的混合標準溶液。

1.2.3 4 mol/L氫氧化鈉-甲醇法

參照GB 5413.36—2010《嬰幼兒食品和乳品中反式脂肪酸的測定》進行甲酯化。準確吸取400 μg/mL脂肪酸標準溶液5.0 mL于15 mL具塞試管中，加入4 mol/L的氫氧化鈉-甲醇溶液0.5 mL。塞緊試管塞，在渦旋振蕩儀上劇烈振搖2 min，振蕩后置于離心機以4000 r/min離心5 min，取上清液過0.22 μm有機濾膜，轉入進樣瓶中，待測定。

1.2.4 0.4 mol/L氫氧化鈉-甲醇法

準確吸取400 μg/mL脂肪酸標準溶液5.0 mL于150 mL錐形瓶中，依次加入正己烷10 mL和0.4 mol/L氫氧化鈉-甲醇溶液10 mL，塞緊瓶口，于渦旋振蕩儀上振搖2 min，使其充分混勻。室溫下靜置30 min，加入10 mL超純水再次振搖5 min，靜置分層后取上清液過0.22 μm有機濾膜，轉入進樣瓶中，待測定[11]。

1.2.5 1%硫酸-甲醇法

準確吸取400 μg/mL脂肪酸標準溶液5.0 mL于15 mL具塞試管中，加入1%硫酸-甲醇溶液2 mL，搖勻后置于70 ℃恒溫水浴箱中加熱30 min。取出后冷卻至室溫，加入2 mL正己烷，再加入超純水至試管口，取出上清液。再用1 mL正己烷洗滌1次，合并上清液過0.22 μm有機濾膜，轉入進樣瓶中，待測定[12]。

1.2.6 濃硫酸法

準確吸取400 μg/mL脂肪酸標準溶液5.0 mL于15 mL具塞試管中，加入0.5 mL甲醇，在渦旋振蕩儀上振搖2 min以充分混勻，再加入50 μL濃硫酸置于80 ℃恒溫水浴箱中反應1 h。取出冷卻至室溫后，加入5 mL正己烷充分混勻，靜置分層，移取上層的正己烷層，加入5 mL的超純水與正己烷層充分混勻，最后分取出正己烷層，用氮氣吹至近干，用正己烷定容至2 mL，過0.22 μm有機濾膜，轉入進樣瓶中，待測定。

1.2.7 酸堿法

準確吸取400 μg/mL脂肪酸標準溶液5.0 mL于150 mL錐形瓶中，加入2%氫氧化鈉-甲醇溶液5 mL搖勻，安裝冷凝回流裝置，置于75 ℃恒溫水浴箱中回流20 min。再移取0.5 mol/L硫酸-甲醇溶液10 mL從冷凝管上端加入，75 ℃水浴回流15 min，最后加入10 mL正己烷回流2 min。取出后冷卻至室溫，加入10 mL超純水，在渦旋振蕩儀上振搖5 min，靜置分層后取上清液過0.22 μm有機濾膜，轉入進樣瓶中，待測定[13]。

1.2.8 三氟化硼-甲醇法

參照GB 5009.168—2016中的三氟化硼-甲酯化方法。準確吸取400 μg/mL脂肪酸標準溶液5.0 mL于150 mL錐形瓶中，加入2%氫氧化鈉-甲醇溶液5 mL搖勻，裝置冷凝回流管，置于75 ℃恒溫水浴箱中回流20 min，再移取15%三氟化硼-甲醇溶液10 mL從冷凝管上端加入，75 ℃水浴回流5 min。取出后冷卻至室溫，加入10 mL超純水，在渦旋振蕩儀上振搖5 min，靜置分層后取上清液過0.22 μm有機濾膜，轉入進樣瓶中，待測定。

1.2.9 GC-MS分析

色譜柱：HP-FFAP(50 m ×0.200 mm，0.25 μm)；升溫程序：初始溫度100 ℃，保持2 min，以6.0 ℃/min升至220 ℃，保持10 min；載氣(He)流速1.0 mL/min，進樣口溫度270 ℃；分流比10∶1；樣液進樣量1.0 μL；傳輸線溫度230 ℃；離子源溫度220 ℃；電子轟擊(EI)離子源；電子能量70 eV；選擇性離子掃描模式(SIM)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Trace DSQ氣質聯(lián)用儀工作站中的C-Xcalibur和Excel 2007對數(shù)據(jù)進行處理和統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 脂肪酸甲酯化色譜圖

圖1 6種甲酯化方法的色譜圖Fig.1 Chromatograms of six methylation methods

由圖1可知，采用4 mol/L氫氧化鈉-甲醇法測定脂肪酸，圖譜上無法看出峰形；采用0.4 mol/L氫氧化鈉-甲醇法測定兩種脂肪酸，雖然出現(xiàn)兩種脂肪酸甲酯化后的峰，但兩者峰形與峰面積差異較大，且分離度和峰形較差，無法準確檢測4-乙基辛酸和4-甲基辛酸；以1%硫酸-甲醇法測定得兩者的峰形及峰面積不明顯，僅能檢測到少量4-甲基辛酸和4-乙基辛酸；濃硫酸法與1%硫酸-甲醇法類似；與這4種方法相比，酸堿法和三氟化硼-甲醇法所測得的色譜圖峰形和分離度較好，且4-甲基辛酸和4-乙基辛酸的相對百分含量比值均接近1∶1，可作為定量測定這兩種脂肪酸的甲酯化方法。

6種甲酯化方法中，4 mol/L氫氧化鈉-甲醇法和0.4 mol/L氫氧化鈉-甲醇法所得的色譜峰不理想，說明4-甲基辛酸和4-乙基辛酸在堿性條件下甲酯化效率較低，在室溫條件下反應條件溫和，并伴隨有產(chǎn)物的水解反應，因此不能有效生成或只生成極少量的脂肪酸甲酯。1%硫酸-甲醇法中，濃硫酸與脂肪酸直接反應，由于反應較強烈，使脂肪酸脫水，因此脂肪酸測定結果中脂肪酸甲酯的含量較低。同樣，在濃硫酸法中，脂肪酸在酸性條件下與甲醇發(fā)生酯化反應，可能存在硫酸使甲醇脫水生成甲醚的副反應，使反應不完全[14]。而酸堿法和三氟化硼-甲醇法所測結果相近，測得峰形較好，是因為在冷凝回流的過程中脂肪酸與溶液接觸的機會增多，充分反應形成甲酯[15]。

檢索Nist 08譜圖庫，確定兩種脂肪酸甲酯的出峰時間及種類，見表1。

表1 2種脂肪酸甲酯保留時間Table 1 Retention time of two fatty acid methyl esters

2.2 方法線性、檢出限和定量限

配制系列濃度的混合標準溶液(0.10，0.20，0.50，1.0，5.0 μg/mL)，分別采用酸堿法和三氟化硼-甲醇法對標準溶液進行甲酯化處理，由高濃度至低濃度依次進樣檢測，以質量濃度與峰面積做標準曲線線性回歸。以添加回收濃度為依據(jù)，以特征離子質量色譜峰性噪比S/N=3計算檢出限，S/N=10計算方法定量限。結果表明，兩種方法處理后的脂肪酸甲酯在0.10～5.0 μg/mL范圍內呈現(xiàn)良好的線性關系，見圖2。酸堿法的檢出限均為0.017 μg/kg，定量限為0.057，0.056 μg/kg，三氟化硼-甲醇法的檢出限均為0.010 μg/kg，定量限為0.032，0.033 μg/kg，結果見表2。

圖2 兩種方法的線性關系圖Fig.2 Linear relationship diagrams of the two methods

2.3 方法的回收率和精密度

分別稱取0.001 g的 4-甲基辛酸和4-乙基辛酸標準品，用正己烷定容至100 mL，準確移取25 mL標準品溶液至容量瓶中，用正己烷定容至50 mL，相當于各含4-甲基辛酸和4-乙基辛酸5 mg/L。平行稱取同一種羊的脂肪樣品(白山羊)6份，其中3份樣品加入脂肪酸標準液，另外3份做實際樣品檢測，分別用酸堿法和三氟化硼-甲醇法對樣液進行甲酯化處理，考察方法的加標回收率與精密度。結果表明，酸堿法的平均加標回收率為47.49%和42.04%，相對標準偏差(RSD，n=6)為11.26%和10.77%；三氟化硼-甲醇法的平均加標回收率為20.18%和18.19%，相對標準偏差為6.44%和6.35%，見表2。由于4-甲基辛酸和4-乙基辛酸屬于揮發(fā)性化合物，如羊奶常采用閃蒸脫膻的方法去除膻味，因此在甲酯化過程中可能造成膻味脂肪酸的差異[16]。

表2 方法相關系數(shù)、檢出限、定量限與回收率Table 2 Correlation coefficients, detection limits, quantitative limits and recovery rates of the methods

2.4 羊脂肪的測定

準確稱取4種羊的濃縮脂肪各50 mg，置于150 mL三角瓶中，按照上述方法中的酸堿法和三氟化硼-甲醇法對羊脂肪進行處理并測定。羊脂肪色譜圖見圖3和圖4。

圖3 酸堿法測定羊脂肪色譜圖Fig.3 Chromatograms of determination of fatin sheep by acid-base method

由表3可知，酸堿法的甲酯化效率總體上高于三氟化硼-甲酯法。4個品種羊中，黑山羊的4-甲基辛酸和4-乙基辛酸的甲酯化含量都明顯高于其他3種羊。該結果與羊肉的膻味程度相一致，這可能與羊的基因、飼養(yǎng)方式等密切相關。

圖4 三氟化硼-甲醇法測定羊脂肪色譜圖Fig.4 Chromatograms of determination of fat in sheep by boron trifluoride-methanol method

表3 4個品種羊膻味脂肪酸含量Table 3 The odor fatty acid content of four varieties of sheep

3 討論

丁艷艷等通過在綿羊脂肪樣品中加入不同量脂肪酸標品對4-甲基辛酸和4-甲基壬酸的回收率進行了考察，發(fā)現(xiàn)當2-乙基壬酸添加量達到2 mL時，4-甲基辛酸和4-甲基壬酸的回收率達到最大，為19.80%和19.86%，2-乙基壬酸的最大回收率則為24%。而在本試驗中，經(jīng)過酸堿法甲酯化后的4-甲基辛酸和4-乙基辛酸的回收率則達到了47.49%和42.04%，且不需要添加內標，反應時間較短，適用于羊肉中膻味物質的研究。

揮發(fā)性脂肪酸對羊肉的膻味起著重要作用，尤其是4-甲基辛酸和4-乙基辛酸對羊肉的這種特殊風味起著主要骨架作用[17]。而不同品種的羊肉中，所含的4-甲基辛酸和4乙基辛酸也有所不同。研究發(fā)現(xiàn)，營養(yǎng)和遺傳兩大因素對羊肉的肉質及風味有很大影響，飼養(yǎng)方式、飼料種類及品種等都會對羊肉所含的脂肪酸造成影響[18]。引起膻味的支鏈脂肪酸更是與羊的品種、年齡、性別和部位等相關[19]。老齡羊肉的膻味通常比幼齡羊肉重，而公羊肉相比母羊肉有較強的膻味[20]。Young等[21]的研究表明，飼養(yǎng)方式會對羊肉膻味造成不同程度的影響，將一批羊進行放牧飼養(yǎng)，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)該放牧飼養(yǎng)下的羊肉中4-甲基辛酸和4-甲基壬酸等膻味脂肪酸含量比其他飼養(yǎng)方式的高。因貴州地勢為喀斯特地貌，草山草坡較多，貴州黑山羊主要以放牧飼養(yǎng)為主[22]，這也可能是造成黑山羊肉膻味脂肪酸含量較高、膻味較重的原因之一。白山羊和黔北麻羊通常通過補飼等提高其生長性能，晴隆綿羊則通過引進和選育而逐漸成為貴州羊中的優(yōu)良品種。從品質上，貴州黑山羊具有適應能力強、抗病能力強、耐粗飼等特點，但由于長期的自然放牧，黑山羊的膻味物質含量較其他品種高。因此從感官上來說，白山羊、黔北麻羊和晴隆綿羊可能更容易被消費者所接受。

4 結論

本文對4-甲基辛酸和4-乙基辛酸這兩種膻味脂肪酸的甲酯化方法進行了研究，從6種甲酯化方法中篩選出酸堿法和三氟化硼-甲醇法。將這兩種方法用于實際樣品檢測中，對貴州幾個具有代表性的品種即白山羊、黑山羊、黔北麻羊和晴隆綿羊的脂肪組織進行測定發(fā)現(xiàn)，黑山羊脂肪組織中的4-甲基辛酸和4-乙基辛酸明顯高于其他品種羊，白山羊和黔北麻羊其次，晴隆綿羊最低，因此4個品種羊肉的膻味程度各不相同。