響應(yīng)面法酶解藜麥蛋白制備α-淀粉酶抑制肽的工藝研究

葉凱，李小強(qiáng)，周金虎，方尚玲，陳茂彬*

(1.湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，武漢 430068；2.發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430068；3.湖北省釀造工藝與裝備工程技術(shù)研究中心，武漢 430068)

藜麥，原產(chǎn)于南美洲安第斯山區(qū)的一種偽谷物，一年生，葉子較寬，自花授粉[1]。藜麥具有耐寒、耐旱、耐鹽堿和生長(zhǎng)在貧瘠土壤的能力[2]。藜麥不含麩質(zhì)，是素食主義者的理想食品。藜麥?zhǔn)且环N全蛋白食品，蛋白質(zhì)含量高達(dá)12%～23%[3]，且氨基酸含量豐富，其中賴氨酸含量是普通谷物的2倍，氨基酸組成接近FAO推薦的理想蛋白比例，是一種很好的植物蛋白來(lái)源[4]。

藜麥富含淀粉、脂肪、膳食纖維和多種營(yíng)養(yǎng)元素，有著“營(yíng)養(yǎng)黃金”之稱。藜麥及其種子可用于啤酒釀造，藜麥芽可加入沙拉中食用[5]，此外，藜麥還可用于味噌[6]、醬粉、黃酒、飲料、餅干、面包等調(diào)味品和食品的制作。藜麥具有多種化學(xué)成分，包括皂素、植物甾醇、植物蛻皮激素、酚類物質(zhì)和生物活性肽。因此，藜麥?zhǔn)且环N功能性食品[7]。

研究表明，藜麥多肽液具有抗氧化、抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶活性[8]、降血糖等作用。目前，對(duì)藜麥的相關(guān)研究主要集中在黃酮、多酚、蛋白等提取分離和相關(guān)活性研究上，酶解藜麥蛋白制備功能活性肽的報(bào)道較少，Vilcacundo R等[9]模擬人體胃腸環(huán)境消化藜麥蛋白，分離出具有抑制二肽酶IV、α-淀粉酶、α-葡糖苷酶活性肽鏈。田旭靜等[10]以風(fēng)味蛋白酶和堿性蛋白酶為1∶1酶解藜麥糠蛋白制備抗氧化肽，其活性與劑量呈量效關(guān)系。

實(shí)驗(yàn)利用藜麥為材料，提取蛋白進(jìn)行酶解，以酶解后的多肽液對(duì)α-淀粉酶的抑制率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選出最佳蛋白酶，通過(guò)酶解條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)獲得最佳酶解工藝條件，為藜麥的相關(guān)研究和保健酒類飲料的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用提供了參考[11]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藜麥：粉碎過(guò)60目篩脫脂、烘干，山西稼祺藜麥開(kāi)發(fā)有限公司；牛血清蛋白：武漢華順試劑耗材有限公司；正己烷、氫氧化鈉、鹽酸、酒石酸鉀鈉、三氯乙酸、可溶性淀粉：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；中性蛋白酶(100 U/mg)、堿性蛋白酶(200 U/mg)、風(fēng)味蛋白酶(20 U/mg)、胰蛋白酶(250 U/mg)、α-淀粉酶(2×104U/mL，用pH 6.9的磷酸鹽緩沖溶液配成10 U/mL使用)：上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AR313電子天平、FE20 pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；HK-04A粉碎機(jī) 廣州市旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司； Multifuge X1R高速冷凍離心機(jī) 賽默飛世爾科技(上海)有限公司；UV-1000 分光光度計(jì) 日本島津科技有限公司；85-2型磁力攪拌機(jī) 上海司樂(lè)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 藜麥蛋白酶解工藝

稱取一定量粉碎脫脂后的藜麥粉，采用堿溶酸沉法提取藜麥粗蛋白[12]，將提取的粗蛋白樣品配制成1%質(zhì)量濃度的蛋白液，分別用不同的蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解完后沸水浴滅酶10 min，冷卻，以8000 r/min離心10 min，收集上清液測(cè)其多肽含量，比較不同酶解條件制備的酶解液對(duì)α-淀粉酶活性的抑制率，以研究藜麥多肽制備的酶解工藝。

1.3.2 檢測(cè)方法

1.3.2.1 多肽含量及得率測(cè)定

采用雙縮脲法繪制牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線[13,14]。

多肽液樣品多肽含量的檢測(cè)：取3 mL樣品溶液加入3 mL 15%(W/V)的三氯乙酸(TCA)水溶液于漩渦混合儀上混合均勻，然后在10000 r/min下離心10 min ，取上清液于540 nm下測(cè)定OD值，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣品溶液中的多肽濃度C(g/L)，進(jìn)而可求得樣品中的多肽含量。

1.3.2.2 藜麥多肽液對(duì)α-淀粉酶活性抑制率的測(cè)定

樣品管：取0.5 mL離心后的多肽液和等量的10 U/mL α-淀粉酶溶液于37 ℃加熱10 min，然后加入2%可溶性淀粉1 mL，反應(yīng)5 min，加入DNS試劑1 mL，沸水浴5 min冷卻，稀釋至25 mL，于520 nm測(cè)定吸光度OD。對(duì)照管：用蒸餾水代替多肽液，記作OD′，以蒸餾水代替淀粉液作空白[15]，記作OD″。

1.3.3 藜麥蛋白酶解工藝優(yōu)化

1.3.3.1 蛋白酶的篩選

選擇中性蛋白酶、堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶[16]、胰蛋白酶4種蛋白酶分別進(jìn)行初步水解。水解條件：藜麥蛋白質(zhì)量濃度1%，加酶量0.3×104U/g，在不同蛋白酶各自最適pH和溫度條件下酶解(見(jiàn)表1)，酶解時(shí)間為 60 min，以多肽得率和α-淀粉酶活性抑制率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選出多肽得率高且活性抑制率高的蛋白酶，進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

表1 不同酶所對(duì)應(yīng)不同的酶解條件Table 1 Different enzymatic hydrolysis conditions fordifferent enzymes

1.3.3.2 藜麥蛋白酶解單因素試驗(yàn)

酶解時(shí)間對(duì)α-淀粉酶活性抑制率的影響：稱取0.5 g藜麥粗蛋白粉5份，分別加入50 mL的水配制成1%的蛋白溶液，在pH 8.0、溫度50 ℃、加酶量0.3×104U/g的條件下分別酶解1，1.5，2，2.5，3 h。

酶解溫度對(duì)α-淀粉酶活性抑制率的影響：稱取0.5 g藜麥粗蛋白粉5份，分別加入50 mL的水配制成1%的蛋白溶液，在溫度30，40，50，60，70 ℃、pH 8.0、加酶量0.3×104U/g的條件下酶解2 h。

pH對(duì)α-淀粉酶活性抑制率的影響：稱取0.5 g藜麥粗蛋白粉5份，分別加入50 mL的水配制成1%的蛋白溶液，設(shè)定酶解溫度50 ℃，加酶量0.3×104U/g，分別在pH 6，7，8，9，10的條件下酶解2 h。

加酶量對(duì)α-淀粉酶活性抑制率的影響：稱取0.5 g藜麥粗蛋白粉5份，加入50 mL的水配制成1%的蛋白溶液，設(shè)定pH 8，溫度50 ℃，分別在加酶量0.2×104，0.3×104，0.4×104，0.5×104，0.6×104U/g的條件下酶解2 h。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

依據(jù)蛋白酶解工藝的單因素試驗(yàn)結(jié)果，以溫度、pH、加酶量、酶解時(shí)間4個(gè)因素為自變量，以α-淀粉酶活性抑制率為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面法四因素三水平試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，按照Box-Behnken原理進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)[17]。

表2 酶解工藝響應(yīng)面水平與因素設(shè)計(jì)表Table 2 Response surface levels and factors of enzymatic hydrolysis process

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

采用Orign 8.5、Design Expert 8.0.6軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 藜麥提取蛋白酶解制備多肽結(jié)果

2.1.1 多肽含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

圖1 雙縮脲法測(cè)得多肽標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of polypeptide determinedby biuret method

由圖1可得線性方程為，y=0.1687x-0.0119，相關(guān)系數(shù)為R2=0.9946。

式中：y為吸光度A；x為牛血清蛋白濃度，mg/mL。

2.1.2 蛋白酶的篩選

表3 不同蛋白酶對(duì)藜麥粗蛋白的酶解效果比較Table 3 Comparison of enzymatic hydrolysis effectsof quinoa crude protein by different proteases %

由表3可知，4種酶酶解后的多肽得率都超過(guò)了30%，對(duì)α-淀粉酶活性具有一定的抑制作用，說(shuō)明4種酶對(duì)藜麥蛋白都具有明顯的酶解效果，其中中性蛋白酶和胰蛋白酶的多肽得率超過(guò)50%，而堿性蛋白酶和胰蛋白酶酶解后的抑制率較風(fēng)味蛋白酶和中性蛋白酶高，蛋白酶解程度越大，多肽得率也越高，生成的低分子肽段就越多，具有抑制活性的肽段容易被降解導(dǎo)致抑制活性降低?？紤]到兩種因素，選擇胰蛋白酶進(jìn)行下一步的酶解試驗(yàn)。

2.1.3 胰蛋白酶單因素酶解條件研究

酶解時(shí)間、酶解溫度、pH、加酶量對(duì)α-淀粉酶活性抑制率和多肽得率作用效果見(jiàn)圖2～圖5。

2.1.3.1 酶解時(shí)間對(duì)酶解效果的影響

圖2 酶解時(shí)間對(duì)多肽得率和α-淀粉酶抑制率的影響Fig.2 Effect of hydrolysis time on peptide yield and α-amylase inhibition rate

由圖2可知，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，多肽得率逐漸升高，這說(shuō)明在蛋白液濃度一定的條件下，酶解時(shí)間的延長(zhǎng)使酶與蛋白質(zhì)的作用時(shí)間越充分，蛋白質(zhì)被水解的程度大[18]，生成小分子片段的短肽越多，從而其多肽含量逐漸升高。在1～3 h之間酶解速率逐漸增加，在酶解初期，蛋白液中殘留的多糖、大分子蛋白會(huì)沉淀在燒杯底部，隨著酶與底部大分子蛋白充分接觸，酶解速率迅速增加。α-淀粉酶活性抑制率出現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在酶解時(shí)間為2 h 時(shí)，α-淀粉酶活性抑制率達(dá)到最大值27.1%，隨著酶解的持續(xù)進(jìn)行，之前酶解得到的α-淀粉酶抑制肽被酶解為更小分子的肽段，從而活性抑制率降低?？紤]兩種酶解試驗(yàn)結(jié)果，選擇酶解時(shí)間2 h為最佳。

2.1.3.2 pH對(duì)酶解效果的影響

圖3 pH對(duì)多肽得率和α-淀粉酶抑制率的影響Fig.3 Effect of pH on peptide yield andα-amylase inhibition rate

pH的改變影響了酶的最適反應(yīng)條件，易使酶失活和降解，進(jìn)而造成酶解反應(yīng)的中止。由圖3可知，多肽得率和α-淀粉酶活性抑制率都出現(xiàn)了先升高后下降的趨勢(shì)，在pH 8.0時(shí)多肽得率和α-淀粉酶活性抑制率都達(dá)到最高值，之后α-淀粉酶抑制率迅速減小，多肽得率趨于平緩并略有減小，由于過(guò)酸過(guò)堿的環(huán)境會(huì)使酶的活性部位遭到破壞或解離，pH對(duì)酶解效果至關(guān)重要。因此，選定胰蛋白酶的酶解pH為8.0進(jìn)行酶解。

2.1.3.3 酶解溫度對(duì)酶解效果的影響

圖4 酶解溫度對(duì)多肽得率和α-淀粉酶抑制率的影響Fig.4 Effect of hydrolysis temperature on peptide yieldand α-amylase inhibition rate

由圖4可知，多肽得率呈現(xiàn)持續(xù)升高趨勢(shì)，由于溫度的升高增大了酶與蛋白分子的接觸機(jī)會(huì)，酶的活性也隨之增強(qiáng)，多肽得率逐漸升高，α-淀粉酶活性抑制率也隨之升高，在50 ℃達(dá)到最大值26.8%，隨后出現(xiàn)降低，溫度超過(guò)60 ℃可能會(huì)直接使活性肽進(jìn)一步解離，喪失抑制活性，從而使α-淀粉酶活性抑制率下降。因此，選擇酶解溫度在50 ℃左右。

2.1.3.4 加酶量對(duì)酶解效果的影響

圖5 加酶量對(duì)多肽得率和α-淀粉酶抑制率的影響Fig.5 Effect of the additive amount of enzyme on peptide yield and α-amylase inhibition rate

由圖5可知，隨著加酶量的增加，多肽得率逐漸上升，α-淀粉酶活性抑制率先上升后下降，增大加酶量使得酶與底物蛋白分子充分接觸，一些沉淀在底部的大分子蛋白也隨著被水解，而隨之加酶量進(jìn)一步增加，一些具有α-淀粉酶活性抑制的肽段也隨之被水解為更小分子量的短肽，α-淀粉酶活性抑制率出現(xiàn)降低。當(dāng)加酶量在0.5×104U/g時(shí)，α-淀粉酶活性抑制達(dá)到最大值45.1%。因此，選擇加酶量在0.5×104U/g比較適宜。

2.2 胰蛋白酶響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)

2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果

響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4，采用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)表4中數(shù)據(jù)進(jìn)行方差、顯著性分析，結(jié)果見(jiàn)表5。

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Design and results of response surface experiment

續(xù) 表

表5 回歸方程分析Table 5 Analysis of the regression equation

以酶解時(shí)間、pH、溫度、加酶量為響應(yīng)變量，α-淀粉酶活性抑制率為響應(yīng)值，通過(guò)響應(yīng)面回歸方程分析可知，藜麥多肽液具有α-淀粉酶活性抑制率的多元二次擬合回歸方程為：

Y=44.09+2.53A-1.87B+4.39C+4.47D+1.86AB+1.61AC+7.67AD+9.20BC+1.90BD-4.19CD-9.11A2-12.84B2-1.78C2-9.79D2。

由表5可知，模型的P<0.0001，表示模型回歸差異極顯著，失擬項(xiàng)P=0.8453>0.05，不顯著，說(shuō)明擬合程度良好[19]，能真實(shí)反映實(shí)際情況，模型可靠；模型回歸決定系數(shù)R2=0.9728>0.9，說(shuō)明α-淀粉酶活性抑制率結(jié)果與方程預(yù)測(cè)結(jié)果具有一致性，模型相關(guān)度好。試驗(yàn)?zāi)Ｐ托Ｕ禂?shù)RAdj2=0.9457，表明模型擬合程度較高[20]。說(shuō)明有94.57%試驗(yàn)結(jié)果值可以用此模型來(lái)解釋，因此結(jié)果可靠，模型可以對(duì)α-淀粉酶活性抑制率值進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。由回歸方程式中一次項(xiàng)系數(shù)可知，各因素對(duì)α-淀粉酶活性抑制率作用大小順序?yàn)?；加酶?D)>溫度(C)>酶解時(shí)間(A)>pH(B)。

2.2.2 響應(yīng)面分析與條件優(yōu)化

響應(yīng)面曲線分析，各因素間等高線圖和交互作用見(jiàn)圖6。

圖6 各因素交互作用對(duì)多肽液抑制α-淀粉酶活性作用的響應(yīng)面和等高線圖Fig.6 Response surface and contour diagrams of theinteraction of various factors on peptidesinhibiting α-amylase activity

由圖6可知，pH與時(shí)間、溫度與pH、加酶量與溫度交互作用的顯著性與表5中交互項(xiàng)P值的分析結(jié)果一致。a，c，e均呈橢圓形，表明因素間交互作用顯著，等高線的形狀可以判斷交互作用的強(qiáng)弱，3組等高線圖中加酶量與溫度交互作用最好，等高線中的曲線圍繞著響應(yīng)面在中間處形成頂點(diǎn)，即抑制率最大值。a，c，e響應(yīng)面圖開(kāi)口都朝下，隨著每個(gè)因素值的增加而響應(yīng)值增大，在達(dá)到響應(yīng)值最高點(diǎn)后，隨著因素值的增大而響應(yīng)值減小，響應(yīng)面的頂點(diǎn)即為最大響應(yīng)值。

經(jīng)Design Expert 8.0.6軟件分析得到優(yōu)化條件為：酶解時(shí)間2.22 h、pH 8.95、溫度60 ℃、加酶量0.53×104U/g，在此條件下，α-淀粉酶活性抑制率的理論最大值為47.82%，采用這一結(jié)果并結(jié)合實(shí)際條件，將酶解條件改為：酶解時(shí)間2 h、pH 9.0、溫度60 ℃、加酶量0.5×104U/g，得到的試驗(yàn)結(jié)果為45.54%，與理論預(yù)測(cè)值基本一致，建立的模型可以較好地反映藜麥多肽液具有抑制α-淀粉酶活性的能力，同時(shí)多肽得率為63.54%。

3 結(jié)論

以藜麥蛋白為試驗(yàn)材料，研究酶解后的多肽對(duì)α-淀粉酶活性的抑制率，篩選出最適用酶。在單因素酶解條件下，選擇酶解時(shí)間、pH、溫度、加酶量進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化結(jié)果顯示：加酶量和酶解溫度對(duì)α-淀粉酶活性的抑制作用比pH和酶解時(shí)間要強(qiáng)。試驗(yàn)結(jié)果表明：制備藜麥多肽的最佳提取工藝為：酶解時(shí)間2 h、pH 9、溫度60 ℃、加酶量0.5×104U/g，在此條件下α-淀粉酶活性抑制率為45.54%。為了提高多肽液對(duì)α-淀粉酶的活性抑制作用，還需對(duì)酶解多肽液進(jìn)行進(jìn)一步的純化處理。