松杉靈芝母種培養(yǎng)基篩選及菌株對(duì)比試驗(yàn)

胡志強(qiáng)，王鑫，王旭，亢學(xué)平，李健, 杜忠偉

(延邊朝鮮族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)院(延邊特產(chǎn)研究所)，吉林 延邊 133400)

松杉靈芝(GanodermatsugaeMurr.)別稱(chēng)鐵杉靈芝，松杉樹(shù)芝，屬靈芝科靈芝屬，生長(zhǎng)于海拔700～1400 m的紅松闊葉混交林、針葉混交林內(nèi)的落葉松﹑紅杉﹑冷杉﹑云杉的伐根和腐木上，分布于我國(guó)溫寒帶長(zhǎng)白山地區(qū)[1-2]。 現(xiàn)代研究表明，松杉靈芝營(yíng)養(yǎng)成分豐富，含有人體必需的氨基酸、核苷、微量元素、維生素及生物活性多糖、三萜類(lèi)化合物、生物堿等，同時(shí)還是維護(hù)人體健康所必須的膳食纖維的良好來(lái)源[3-5]。目前松杉靈芝栽培用種主要來(lái)源于野生資源的馴化和引種[6]。本研究對(duì)延邊地區(qū)的野生松杉靈芝的4個(gè)菌株進(jìn)行培養(yǎng)基篩選，為松杉靈芝的菌種選育提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株。松杉靈芝(GanodermatsugaeMurr.)菌株來(lái)源及編號(hào)見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)材料均來(lái)自延邊朝鮮族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所。

表1 供試松杉靈芝菌株及來(lái)源

1.1.2 培養(yǎng)基選擇。采用3種母種培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基，麥麩培養(yǎng)基，木屑浸汁+PDA混合培養(yǎng)基，以1000 mL體積為標(biāo)準(zhǔn)，具體配方如表2。

表2 培養(yǎng)基配方

1.2 研究方法

1.2.1 培養(yǎng)基制備

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基：稱(chēng)取200 g馬鈴薯，洗凈去皮切碎，加水1000 mL煮沸0.5 h，紗布過(guò)濾，再加10～20 g葡萄糖和17～20 g瓊脂，充分溶解后趁熱紗布過(guò)濾，分裝試管，每試管5 mL。

麥麩浸汁培養(yǎng)基：將麩皮與黃豆粉一起加水煮沸30 min,4層紗布過(guò)濾,在濾液中加入瓊脂、葡萄糖、硫酸鎂、磷酸二氫鉀。

木屑浸汁+PDA培養(yǎng)基：將硬雜木木屑和馬鈴薯分開(kāi)加水煮沸30 min，4層紗布過(guò)濾,混合后的濾液加入瓊脂、葡萄糖,磷酸二氫鉀, 硫酸鎂。

將3種培養(yǎng)基分別裝入18 mm×180 mm試管中,包扎成捆,裝入高壓滅菌鍋內(nèi),壓力升至0.12 kPa,保持30 min,待壓力表指針降至0后,打開(kāi)鍋蓋,取出試管后斜放冷卻。

1.2.2 培養(yǎng)基篩選。對(duì)所研究的4個(gè)菌株(YBSS1、YBSS2、YBSS3、YBSS4)，分別接入3種培養(yǎng)基中，接種量均為0.5 cm×0.5 cm，嚴(yán)格按照無(wú)菌的操作規(guī)范進(jìn)行。

1.2.3 培養(yǎng)與觀察。將接種后的試管置于培養(yǎng)箱內(nèi),25 ℃培養(yǎng),每隔2天觀察1次,并記錄接種數(shù)量、記錄菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)試管的時(shí)間，污染情況，成活率[7]，結(jié)果見(jiàn)表3；觀察菌絲的粗度 (粗、較粗、細(xì))、生長(zhǎng)勢(shì) (強(qiáng)、較強(qiáng)、弱)、疏密程度(密、較密、疏)[8],結(jié)果見(jiàn)表4。

1.2.4 栽培試驗(yàn)。對(duì)獲得的優(yōu)質(zhì)母種進(jìn)行出芝試驗(yàn)，通過(guò)隨機(jī)抽取15個(gè)子實(shí)體記錄菌蓋直徑、蓋厚及重量，進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，結(jié)果見(jiàn)表5；對(duì)4個(gè)菌株培養(yǎng)獲得的母種分別制作原種，然后做栽培種，每個(gè)菌株做100袋。原種和栽培種具體制作如下。

1.2.4.1 原種制作：選用木屑83%、麩皮15%、蔗糖1%、生石膏1%，含水量60%、自然pH。裝瓶、滅菌：按配方把培養(yǎng)料拌勻、裝入菌種瓶，裝料要上緊下松，裝量距瓶口3～5 cm即可，裝好后擦凈瓶體，用塑料薄膜加報(bào)紙?jiān)o瓶口，然后進(jìn)行滅菌(高壓滅菌，121 ℃滅菌2 h)冷卻備用。接種：滅菌后培養(yǎng)料冷卻至30 ℃送入接種室，在無(wú)菌室內(nèi)進(jìn)行。接完的置于培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)[9]。培養(yǎng)：在溫度22～26 ℃，空氣相對(duì)濕度在45%～60%以下，約培養(yǎng)35～45天，菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)全瓶。

1.2.4.2 栽培種的制作：選用雜木屑83，麩皮15，石膏1，蔗糖1，含水量60%～65%[10]。選擇聚丙烯塑料袋(35 cm×17 cm)。經(jīng)過(guò)裝袋(裝袋時(shí)要注意上下松緊一致，刷清袋口培養(yǎng)料后用橡皮筋把兩端的袋口扎緊，然后進(jìn)行檢查塑料袋是否漏水，不漏水再滅菌)裝好袋后要及時(shí)滅菌，以防培養(yǎng)料發(fā)酵變質(zhì)。滅菌在121 ℃下滅菌2.5 h，滅菌后溫度降至自然溫度下，移入接種箱進(jìn)行無(wú)菌操作接種。將接種后的菌袋移入無(wú)菌培養(yǎng)室培養(yǎng)，發(fā)菌期間，室溫保持在25 ℃，每天通風(fēng)1次。黑暗培養(yǎng)，經(jīng)60～70天左右，菌絲便可長(zhǎng)滿(mǎn)袋。在此期間及時(shí)檢查是否有雜菌，發(fā)現(xiàn)后馬上處理。

1.2.4.3 出芝管理：袋料菌袋排袋方法，共排放5～7層做成菌墻，在最上面一層填土10 cm，并作成U字型，以便出芝期間補(bǔ)給營(yíng)養(yǎng)和水分。菌墻作好后即可在菌袋一端開(kāi)出芝口，大小以直徑2 cm、深1 cm，開(kāi)口后在墻面掛膜、保濕、保溫，促進(jìn)芝蕾形成，相對(duì)空氣濕度為70%～80%，溫度在20 ℃左右均可，經(jīng)10～15 d開(kāi)口處出現(xiàn)芝蕾，長(zhǎng)到2～3 cm時(shí)，直接向芝蕾表面噴灑霧水，棚內(nèi)濕度保持在90%～95%，溫度要求25～30 ℃，散射光，CO2濃度調(diào)節(jié)到0.1%以下，經(jīng)50 d左右時(shí)間靈芝子實(shí)體形基本成熟。

2 結(jié)果分析

菌絲是食藥用菌的子實(shí)體生長(zhǎng)基礎(chǔ)，是菌種選育的重要指標(biāo)，通過(guò)對(duì)4個(gè)野生松杉靈芝菌株在3種培養(yǎng)基中的長(zhǎng)勢(shì)可以對(duì)其作出初步的評(píng)價(jià)，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)獲得數(shù)據(jù)如表3～4。

表3 松杉靈芝在不同培養(yǎng)基下的長(zhǎng)勢(shì)

農(nóng)藝性狀是鑒別食用菌菌種或品種優(yōu)劣的重要標(biāo)準(zhǔn)之一。通過(guò)對(duì)子實(shí)體農(nóng)藝性狀的觀測(cè)并分別打分，菌蓋大小和菇體形態(tài)兩個(gè)指標(biāo)的總分為子實(shí)體農(nóng)藝性狀分值，其分值越高，菌株農(nóng)藝性狀越好[11]。生物轉(zhuǎn)化率中的測(cè)產(chǎn)量也是對(duì)食藥用菌質(zhì)量評(píng)價(jià)的指標(biāo)，4個(gè)菌株的栽培試驗(yàn)，測(cè)量第一次采收的平均菌蓋大小，厚度，測(cè)重量取平均值，結(jié)果如表5。

表4 菌絲的生長(zhǎng)狀態(tài)

表5 不同菌株松杉靈芝的質(zhì)量評(píng)價(jià)

3 結(jié)論

松杉靈芝的4個(gè)菌株，在不同培養(yǎng)基中的長(zhǎng)勢(shì)和生長(zhǎng)狀態(tài)存在的差異不顯著，但是也可以看出菌株“YBSS2”在3種培養(yǎng)基中菌絲長(zhǎng)勢(shì)比其他3個(gè)菌株(YBSS1、YBSS3、YBSS4)好，4個(gè)菌株在木屑浸汁+PDA培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最好；通過(guò)對(duì)栽培試驗(yàn)獲得的子實(shí)體質(zhì)量性狀的比較，菌株“YBSS2”較好，確定松杉靈芝菌株“YBSS2”為最優(yōu)菌株，可做為推廣栽培品種。