針灸透刺鶴頂與內(nèi)膝眼穴對兔膝關(guān)節(jié)炎軟骨細胞免疫微環(huán)境調(diào)控的影響

張翠洲，劉 淵，張二尹，張嚴勻，張藝馨

廣西中醫(yī)藥大學(南寧 530001)

膝骨性關(guān)節(jié)炎(Knee osteoarthritis,KOA)病變部位主要涉及膝關(guān)節(jié)軟骨、軟骨下骨以及滑膜組織等[1]，是中老年人常見病和多發(fā)病，臨床上主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、關(guān)節(jié)變形、僵硬腫脹等為主，嚴重影響患者的生活質(zhì)量，雖然目前中西醫(yī)治療各有優(yōu)勢，但很難徹底解決本病軟骨細胞凋亡的病理改變[2]，近年來有學者進行多方面研究發(fā)現(xiàn)在退變的膝骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)液中，大量的免疫細胞及炎癥因子參與病變過程，與病情的嚴重程度成正相關(guān)[3]，因此在研究軟骨細胞凋亡和力學改變的基礎(chǔ)上，更多學者將研究骨關(guān)節(jié)炎的目光投入到機體免疫炎癥方面，對炎性因子與膝關(guān)節(jié)軟骨代謝標志物水平的影響作了相關(guān)報道[4]。近年來，研究報道[5-6]針灸穴位治療KOA具有較好的臨床療效，作為一種安全無副作用的治療方法備受肯定。筆者在臨床實踐中運用針灸透刺鶴頂與內(nèi)膝眼穴治療KOA，取得較滿意的臨床療效，但對其治療機理尚不清楚，因此本課題研究是否通過透刺鶴頂與內(nèi)膝眼穴調(diào)節(jié)膝關(guān)節(jié)免疫微環(huán)境而達到治療目的進行了研究，從而為推廣臨床治療提供理論依據(jù)。

材料和方法

1 材 料

1.1 動物：選取健康4～6月齡雌性新西蘭白兔24只，體質(zhì)量(2.05±0.1) kg，由廣西中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，許可證號：SYXK(桂)2003-0001。飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學實驗動物房，飼養(yǎng)溫度18℃～22℃，濕度45%～55%，自由飲食。

1.2 藥物與試劑：木瓜蛋白酶和L-半胱氨酸，購于美國Sigma公司、0.9%的生理鹽、1%戊巴比妥鈉、兔IL-6、TLR4、MyD88、IRF-7、MMP-13試劑盒由美國San Diego公司提供，對物品的操作過程嚴格按照說明書進行。

1.3 主要儀器：酶標儀、Western blot檢測儀、低溫冰箱及便攜式標本貯藏罐等，關(guān)節(jié)量尺、關(guān)節(jié)角度測量儀。

1.4 造模試劑的配置：2%木瓜蛋白酶和0.03mol/L L-半胱氨酸混合液配制，充分溶解和攪拌均勻，在無菌條件下用0.22μm濾膜過濾去除未溶解的雜質(zhì)，靜置30 min后待用[7]。

2 實驗方法

2.1 造模方法：將24只新西蘭兔隨機分為A、B、C三組，A組不做任何處理，B、C組于造模前1 h配制2%的木瓜蛋白酶和0.03 mol/L L-半胱氨酸混合液，于實驗的第1、4、7天向兔子右膝關(guān)節(jié)內(nèi)注入混合液0.5 ml。具體方法：將兔子固定于兔臺上，刮除右膝關(guān)節(jié)部位兔毛，用75%乙醇消毒后在髕韌帶附著點外上方約0.5 cm處進針注入造模劑混懸液。針頭刺入關(guān)節(jié)腔內(nèi)有落空感后回抽無血性液體，注入0.5 ml混合液，活動兔膝關(guān)節(jié)使混合液充分分布在關(guān)節(jié)內(nèi)[8]。術(shù)后連用3天青霉素鈉(國藥準字H37021950)5萬單位/(kg·d)，于造模1周后開始實驗。

2.2 實驗治療：A組為正常對照組給予生理鹽水灌胃，灌胃量為2 ml/100g；B組為造模組，生理鹽水灌胃，灌胃量為2 ml/100g，兩組均為1次/d灌胃，持續(xù)4周；C組給予針灸透刺鶴頂至內(nèi)膝眼穴位1次/d，20 min/次，持續(xù)4周。所有動物單籠飼養(yǎng)，4周末分別處死所有動物。

3 指標測定 治療結(jié)束后首先進行關(guān)節(jié)行為學檢測，膝關(guān)節(jié)的疼痛、步態(tài)、關(guān)節(jié)活動度及關(guān)節(jié)腫脹指標，采用關(guān)節(jié)測量儀和關(guān)節(jié)尺檢測并記錄，其后抽取各組兔耳緣靜脈血，離心后用ELISA檢測血清IL-6表達水平；最后處死實驗各組兔，取關(guān)節(jié)組織勻漿，提取蛋白，BCA法蛋白定量，調(diào)整蛋白濃度。Western blot分析目的蛋白TLR4、MyD88、IRF-7、MMP-13的表達水平。

4 統(tǒng)計學方法 統(tǒng)計分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件處理，各組之間比較用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 ELISA血清IL-6檢測 血清結(jié)果顯示C組檢測指標IL-6與A組相比較略高，但兩者比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；而B組血清IL-6水平高于其它兩組，三者比較有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，見表1。

表1 三組血清IL-6水平(ng/L)

2 Western blot檢測TLR4、MyD88、IRF-7、MMP-13表達情況 C組檢測指標TLR4、MyD88、IRF-7、MMP-13與A組各對應(yīng)指標比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，而B組TLR4、MyD88、IRF-7、MMP-13各項指標均高于C組，兩者各指標相互比較有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。見表2。

表2 三組Western blot檢測目的蛋白灰度值

3 行為學觀察結(jié)果 在治療結(jié)束后采用改良Lequesne MG評估方法對各組家兔膝關(guān)節(jié)的疼痛、步態(tài)、關(guān)節(jié)活動度及關(guān)節(jié)腫脹等行為學指標，進行計分評價，并計算結(jié)果總分差值進行統(tǒng)計學分析。結(jié)果B組4項各評分明顯上升，與A和C組相比三組均有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。見表3。

表3 三組行為學各項檢查結(jié)果(分)

討 論

膝骨性關(guān)節(jié)炎是一種臨床上較為常見的膝關(guān)節(jié)退行性病理改變，發(fā)于老年人當中，輕癥患者可見膝關(guān)節(jié)處明顯疼痛，以及活動受限等臨床表現(xiàn)，重癥時可致患者發(fā)生慢性殘疾[9]，嚴重影響患者的生命質(zhì)量等特點[10]，目前針對本病治療主要以減輕疼痛，緩解軟骨退變等為主，隨著研究的多樣性和不斷深入，除軟骨退變外，機體免疫炎癥對膝關(guān)節(jié)局部微環(huán)境產(chǎn)生的影響也正在被越來越多的學者關(guān)注[11]。研究發(fā)現(xiàn)，膝關(guān)節(jié)局部產(chǎn)生炎癥介質(zhì)是導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨退變和滑膜細胞活化的原因之一，與健康人對比，KOA患者的血清中某些炎癥介質(zhì)的水平明顯升高[12]，而KOA關(guān)節(jié)液中的蛋白可導(dǎo)致巨噬細胞通過TLR4信號通路產(chǎn)生炎癥因子[13]，同時關(guān)節(jié)組織中高度浸潤的T淋巴細胞釋放大量炎癥因子，這些炎癥因子可增強微環(huán)境的免疫反應(yīng)而促使軟骨基質(zhì)進一步破壞，因此在研究膝骨關(guān)節(jié)炎的病理機制時，應(yīng)不單從軟骨蛻變研究，更要研究免疫微環(huán)境的改變對KOA的病變機制的影響。

在前期的研究中[14]，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)和證實膝骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生與細胞CTX-Ⅱ和COMP存在密切的關(guān)聯(lián)性，多指標聯(lián)合應(yīng)用能大大提高膝骨關(guān)節(jié)炎的診斷準確性，在膝骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病中具有重要的作用，并且可以反映病情和證型的變化，這為本次研究提供了較堅實的實驗依據(jù)。同時近年來的研究發(fā)現(xiàn)[15]，結(jié)合骨生物學與骨免疫學研究，可以更好地揭示免疫系統(tǒng)和骨關(guān)節(jié)系統(tǒng)的密切聯(lián)系，深入研究免疫細胞在骨相關(guān)疾病的生理病理過程中發(fā)揮了重要作用是目前研究的一個趨勢。據(jù)研究報道[16]，炎性病變與TLRs信號通路在膝骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)揮著重要的作用，Toll樣受體(TLRs)做為模式受體之一，當膝骨關(guān)節(jié)受到炎性損傷時，會激活TLRs信號通路，使TLR相關(guān)受體(TLR3、TLR4、TLR7)與髓樣細胞分化因子(MyD88)結(jié)合，從而激活下游信號轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，而這兩者均屬于固有免疫的模式識別受體(PRR)，從而產(chǎn)生天然免疫激活程序，調(diào)控IL-6、TNF-α、MMP-13等重要炎癥因子，抑制炎癥反應(yīng)，這些研究為本次開展相關(guān)研究提供了理論和實驗基礎(chǔ)。

KOA屬中醫(yī)學“痹證”、“骨痹”范疇[17]，主要由老年人機體肝腎不足、氣血虧虛，加之風邪寒濕入體等綜合原因而引發(fā)本病，表現(xiàn)為本虛標實，不通則痛的病理機制。因此本病的治療應(yīng)以改善局部血供、調(diào)理經(jīng)脈、開阻除痹、活血通絡(luò)為主[18]。本病屬于慢性遷延性疾病，中醫(yī)治療以中藥內(nèi)服外用、針灸推拿等為主，尤其擅長慢性勞損性疾病的治療，治療效果較好，并且安全性高，毒副作用小。其中針灸治療本病療效明確、操作便捷、創(chuàng)傷小且無毒副作用，為臨床治療膝骨關(guān)節(jié)炎常用方式。賀小卉[19]用不同針灸方式治療虛寒型膝骨關(guān)節(jié)炎患者162例，觀察骨性關(guān)節(jié)炎指數(shù)(WOMAC)評分及疼痛癥狀，觀察組顯效率是62.96%，總有效率是98.77%，均分別明顯高于對照組的46.91%及90.12%，認為利用溫針灸治療KOA患者可產(chǎn)生較好的療效。目前研究大多數(shù)學者從溫通角度出發(fā)[20]，取得了滿意的臨床療效，而在臨床運用中，我們發(fā)現(xiàn)通過透刺針法治療KOA，患者也能取得較滿意的療效，尤其是選取經(jīng)外奇穴內(nèi)膝穴和鶴頂穴時，療效顯著。內(nèi)膝穴和鶴頂穴位于膝關(guān)節(jié)內(nèi)上側(cè)，均屬經(jīng)外奇穴，均主膝痛，足脛無力，鶴膝風等病癥，尤其是對于早中期KOA的治療有明顯的效果，但缺少明確的治療機制研究和報道。目前針灸治療本病分為針刺、溫針灸、火針、電針、浮針等，《素問·痹論》載：“風寒濕三氣雜至，合而為痹也。其風氣勝者為行痹，寒氣勝者為痛痹，濕氣勝者為著痹也” 。痹證是指風、寒、濕、熱之邪侵襲人體經(jīng)絡(luò)，導(dǎo)致氣血不通，經(jīng)脈閉塞所引起的病證，臨床表現(xiàn)多為關(guān)節(jié)疼痛，活動障礙，酸軟無力，關(guān)節(jié)畸形等，目前研究表明[21]，針灸不僅能夠提高免疫細胞如淋巴細胞、中性粒細胞、單核巨噬細胞、NK細胞等的數(shù)量、活性及功能，還能通過減少損傷性細胞因子，增加保護性細胞因子，免疫球蛋白及補體等增強機體的免疫功能，且能延緩免疫器官的萎縮和功能退化[22-25]。

因而本次課題研究從免疫學TLRs信號通路為切入點，建立兔膝關(guān)節(jié)炎模型，運用現(xiàn)代醫(yī)學研究手段進行針灸透刺穴位治療膝骨關(guān)節(jié)炎的動物研究。結(jié)果研究發(fā)現(xiàn)運用針灸透刺鶴頂至內(nèi)膝穴，可以明顯改善兔膝關(guān)節(jié)的的疼痛、步態(tài)、關(guān)節(jié)活動度及關(guān)節(jié)腫脹等行為學指標，與模型組比較差異具有統(tǒng)計學意義，這表明透刺穴位有利于膝關(guān)節(jié)經(jīng)絡(luò)的疏通，起到疏經(jīng)通絡(luò)并調(diào)和氣血的治療效果。進一步抽取血清學和關(guān)節(jié)軟組織提取檢查，發(fā)現(xiàn)血清IL-6在C組較B組明顯降低，兩者比較差異具有統(tǒng)計學意義，與此同時關(guān)節(jié)組織的免疫學TLR4、MyD88、IRF-7、MMP-13檢測也同血清學檢測相一致。這充分說明運用透刺鶴頂至內(nèi)膝穴可以從內(nèi)改善關(guān)節(jié)免疫炎癥，同時改善關(guān)節(jié)的各項力學指標，還可利于膝關(guān)節(jié)血管的擴張，并加速血液循環(huán)，緩解或消除因關(guān)節(jié)損傷而導(dǎo)致的炎癥，最終發(fā)揮了消腫止痛和散寒通絡(luò)之功效。

此次研究證實了臨床運用此透刺手法治療膝骨關(guān)節(jié)炎確實有效，并且通過研究表明，膝骨關(guān)節(jié)炎不僅是軟骨退變性疾病，其免疫學的改變和參與也應(yīng)當?shù)玫街匾?。同時為臨床運用此法治療KOA和后期進一步利用細胞分子、生化等檢測技術(shù)更深一層探討具體信號通路及效應(yīng)的作用機制奠定基礎(chǔ)。