非小細(xì)胞肺癌PHLPP的表達(dá)與順鉑化療預(yù)后的關(guān)系

陳美芳 林玲 徐有祖 呂冬青 周超 鄭海紅

[摘要] 目的 觀察PHLPP的表達(dá)與順鉑化療預(yù)后的關(guān)系。 方法 收集2015年3月～2017年3月86例經(jīng)病理確診的Ⅳ期非小細(xì)胞肺癌患者，PHLPP、P-Akt、P-ERK的表達(dá)用免疫組化的方法評(píng)估，分析PHLPP的表達(dá)與臨床病理特征以及順鉑化療預(yù)后的關(guān)系。 結(jié)果 PHLPP的表達(dá)在P-Akt陰性組與陽性組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），在P-ERK陰性組與陽性組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;PHLPP的表達(dá)水平與P-Akt、P-ERK的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。單因素分析發(fā)現(xiàn)PFS與P-Akt、P-ERK的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，PFS與PHLPP的表達(dá)呈正相關(guān)，多因素分析發(fā)現(xiàn)PHLPP（OR值63.673，95%CI：14.858～272.865，P<0.001）、P-Akt（OR值1.912，95%CI：1.363～4.396，P=0.032）、P-ERK（OR值3.347，95%CI：1.810～6.186，P<0.001）是PFS的獨(dú)立預(yù)測因子。 結(jié)論 PHLPP可能通過負(fù)向調(diào)節(jié)Akt及ERK通道調(diào)控順鉑化療預(yù)后。

[關(guān)鍵詞] 非小細(xì)胞肺癌;PHLPP;順鉑;化療預(yù)后

[中圖分類號(hào)] R734.2 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A ? ? ? ? ?[文章編號(hào)] 1673-9701（2019）29-0032-05

Relationship between expression of PHLPP and prognosis of cisplatin chemotherapy in non-small cell lung cancer

CHEN Meifang1 ? LIN Ling1 ? XU Youzu1 ? LV Dongqing1 ? ZHOU Chao2 ? ZHENG Haihong3

1.Department of Respiratory Medicine， the Affiliated Taizhou Hospital of Wenzhou Medical University， Linhai ? 317000， China; 2.Department of Radiotherapy， the Affiliated Taizhou Hospital of Wenzhou Medical University， Linhai ? 317000， China; 3.Department of Pathology， the Affiliated Taizhou Hospital of Wenzhou Medical University， Linhai ? 317000， China

[Abstract] Objective To observe the relationship between the expression of PHLPP and the prognosis of cisplatin chemotherapy. Methods A total of 86 patients with stage Ⅳ non-small cell lung cancer diagnosed by pathology were collected from March 2015 to March 2017. Expression of PHLPP， P-Akt， and P-ERK was assessed by immunohistochemistry. The relationship between the expression of PHLPP and clinicopathological features and the prognosis of cisplatin chemotherapy was analyzed. Results The expression of PHLPP was statistically significantly different between the P-Akt negative group and the positive group（P<0.05）. There was a statistically significant difference between the P-ERK negative group and the positive group （P<0.05）; the expression level of PHLPP was negatively correlated with the expression of P-Akt and P-ERK. Univariate analysis found that PFS was negatively correlated with the expression of P-Akt and P-ERK. PFS was positively correlated with the expression of PHLPP. Multivariate analysis found that PHLPP （OR value： 63.673， 95%CI： 14.858-272.865， P<0.001）， P-Akt （OR value： 1.912， 95%CI： 1.363-4.396， P=0.032）， and P-ERK （OR value： 3.347， 95%CI： 1.810-6.186， P<0.001） were independent predictive factors of PFS. Conclusion PHLPP may regulate the prognosis of cisplatin chemotherapy by negatively regulating Akt and ERK channels.

[Key words] Non-small cell lung cancer; PHLPP; Cisplatin; Chemotherapy prognosis

肺癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率及死亡率呈明顯增高趨勢，其中非小細(xì)胞肺癌（no small cell lung cancer，NSCLC）占所有肺癌的80%[1]，多數(shù)患者確診時(shí)已處于晚期且預(yù)后差[2]。以鉑類為基礎(chǔ)的化療是晚期NSCLC的主要治療手段，然而晚期NSCLC的5年總生存率仍未超過16%[3]，對(duì)以鉑類為基礎(chǔ)的化療藥物產(chǎn)生耐藥是導(dǎo)致晚期NSCLC患者治療失敗的主要原因。

PH結(jié)構(gòu)域富含亮氨酸重復(fù)序列的蛋白磷酸酶（PH domainleucine-rich repeats protein phosphatase，PHLPP）是一個(gè)新的絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶，具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，已證實(shí)其為腫瘤抑制基因的角色[4]。PHLPP能負(fù)向調(diào)節(jié)蛋白激酶B（protin kinase，Akt）及細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protin kinase，ERK）信號(hào)通道，從而抑制腫瘤的增殖、分化，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的死亡[4-5]，國內(nèi)學(xué)者體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，順鉑的治療能激活A(yù)kt及ERK通道而產(chǎn)生耐藥[6]，從而提示PHLPP可能通過調(diào)節(jié)Akt和ERK水平調(diào)控NSCLC對(duì)順鉑化療的預(yù)后。本研究目的在于探索PHLPP在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)與順鉑化療預(yù)后的關(guān)系?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料

收集2015年3月～2017年3月我院病理組織庫采集的86例肺癌病例支氣管鏡活檢標(biāo)本，所有患者ECOG評(píng)分0或1分、有足夠的基線器官功能、白細(xì)胞計(jì)數(shù)>4×109/L（中性粒細(xì)胞絕對(duì)值>2×109/L，血小板計(jì)數(shù)>100×109/L，正常的肝功能，血清肌酐水平<1.4 mg/dL）、無其他嚴(yán)重并發(fā)癥?；颊叻制诟鶕?jù)AJCC的TNM分期系統(tǒng)（第7版，2009）。所有病例均首次接受含順鉑藥物化療，化療前均未接受放療且除外并發(fā)感染，包括鱗癌48例，腺癌38例，均屬于Ⅳ期患者。男56例，女30例，年齡41～71歲，中位年齡60歲。

1.2 試劑和儀器試劑

PHLPP抗體（abcam公司，編號(hào)ab89833），P-AKT抗體（arigo公司，編號(hào)ARG56418），P-ERK1/2抗體（arigo公司，編號(hào)ARG10568）。主要儀器：低溫離心機(jī)、組織均漿器、分光光度計(jì)、酶標(biāo)儀、Leica切片機(jī)、全自動(dòng)放免γ計(jì)數(shù)儀器、Leica顯微鏡。

1.3 方法

每份標(biāo)本均用4%多聚甲醛固定，石蠟固定包埋。免疫組化測定采用PowerVision二步法，按試劑盒說明書進(jìn)行：（1）取石蠟切片烤片后，脫蠟、脫水后;（2）0.3%H2O2，室溫15 min（避光），封閉內(nèi)源性過氧化物酶;（3）切片置入0.01 M（10 mM）檸檬酸緩沖液（pH 6.0）微波修復(fù)法修復(fù)抗原;（4）正常山羊血清處理，37℃，10～15 min;（5）滴加第一抗體（PHLPP、P-AKT及P-ERK等），放置濕盒內(nèi)37℃孵育2 h;（6）PBS洗滌后，滴加二抗（GTVision+/HRP），37℃，30 min;（7）PBS洗滌5 min，滴加預(yù)備好的顯色劑DAB工作液，即于光鏡下控制顯色。顯色完全后，置于蒸餾水中終止顯色;（8）流水沖洗，蘇木素復(fù)染，藍(lán)化;（9）脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，顯微鏡觀察。結(jié)合細(xì)胞陽性著色程度及陽性細(xì)胞比率分析各樣本的目的蛋白表達(dá)水平。

1.4 觀察指標(biāo)

記錄每位患者從開始化療到出現(xiàn)疾病進(jìn)展的時(shí)間，稱為無進(jìn)展生存期（progression-free survival，PFS）。觀察各組PHLPP的表達(dá)情況;PHLPP表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌臨床病理特征的關(guān)系;PFS與非小細(xì)胞肺癌臨床病理特征關(guān)系的單因素分析;PFS與非小細(xì)胞肺癌臨床病理特征關(guān)系的多因素分析;PFS曲線的結(jié)果分析。

1.5 免疫組化結(jié)果

判斷標(biāo)準(zhǔn)由一名高年資病理科主任醫(yī)師與一名高年資病理科主治醫(yī)師雙盲法統(tǒng)計(jì)染色結(jié)果，主要定位于胞漿內(nèi)。根據(jù)癌巢及正常組織中，計(jì)數(shù)陽性癌細(xì)胞占總癌細(xì)胞數(shù)的百分比，陽性細(xì)胞≥25%為陽性，<25%為陰性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗(yàn)。單因素分析采用Log-rank分析，多因素分析采用COX回歸分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PHLPP的表達(dá)情況

在非小細(xì)胞肺癌組織中高表達(dá)、低表達(dá)以及P-Akt陽性、P-ERK陽性的免疫組化圖像，見封三圖3。計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞占總癌細(xì)胞≥25%為陽性，<25%為陰性。

2.2 PHLPP表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌臨床病理特征的關(guān)系

本研究共對(duì)86例經(jīng)病理證實(shí)的晚期NSCLC患者進(jìn)行評(píng)價(jià)，男56例（65.12%），女30例（34.88%），中位年齡60歲，所有患者均給予順鉑藥物化療，記錄每位患者的PFS。PHLPP、P-Akt、P-ERK在肺癌的表達(dá)是通過免疫組化方法進(jìn)行評(píng)估的，對(duì)PHLPP的表達(dá)與肺癌臨床病理特征的關(guān)系進(jìn)行分析，見表1。結(jié)果顯示PHLPP高表達(dá)（2～3分）35例（40.70%），低表達(dá)（0～1分）51例（59.30%），PHLPP表達(dá)水平在不同年齡、性別、病理類型、有無吸煙史組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），在P-Akt陰性組與陽性組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.631，P=0.010），在P-ERK陰性組與陽性組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.072，P=0.044），PHLPP的表達(dá)水平與P-Akt、P-ERK的表達(dá)呈正相關(guān)。

2.3 PFS與非小細(xì)胞肺癌臨床病理特征關(guān)系的單因素分析

PFS在不同年齡、性別、病理類型、有無吸煙史組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。PFS在P-Akt陰性組與陽性組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.293，P=0.001），在P-ERK陰性組與陽性組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.139，P<0.001），PFS與P-Akt、P-ERK的表達(dá)呈負(fù)相關(guān);PFS在PHLPP高表達(dá)組與低表達(dá)組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=13.976，P<0.001），且PHLPP表達(dá)與PFS呈正相關(guān)，見表2。

2.4 PFS與非小細(xì)胞肺癌臨床病理特征的關(guān)系的多因素分析

對(duì)單因素分析中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的危險(xiǎn)因素進(jìn)行COX回歸分析發(fā)現(xiàn)，P-Akt：OR=1.912，95%CI：1.363～4.396，P=0.032;P-ERK：OR=3.347，95%CI：1.810～6.186，P<0.001;PHLPP：OR=63.673，95%CI：14.858～272.865，P<0.001。結(jié)果提示PHLPP、P-Akt、P-ERK的表達(dá)是影響PFS的獨(dú)立預(yù)測因子，見表3。

2.5 PFS曲線的結(jié)果分析

PHLPP高表達(dá)患者的PFS明顯長于PHLPP低表達(dá)患者[（8.42±0.94）個(gè)月vs （4.72±1.37）個(gè)月，P<0.001]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見封三圖4;P-Akt陰性患者的PFS明顯長于P-Akt陽性患者[（6.64±2.13）個(gè)月vs（4.90±1.92）個(gè)月，P<0.001]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見封三圖5;P-ERK陰性患者的PFS明顯長于P-ERK陽性患者[（6.92±1.76）個(gè)月vs （4.57±2.30）個(gè)月，P<0.001]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見封三圖6。

3 討論

以鉑類為基礎(chǔ)的化療是晚期NSCLC的主要治療手段，化療藥物耐藥是治療失敗和導(dǎo)致死亡率上升的主要原因[7]。降低腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑治療的耐藥率，對(duì)于提高晚期NSCLC的生存率至關(guān)重要。順鉑主要通過DNA的鏈內(nèi)交鏈和鏈間交鏈破壞DNA發(fā)揮其抗腫瘤活性[8]，而關(guān)于順鉑耐藥的機(jī)制，目前尚不明確。

PHLPP家族中包含三個(gè)同工酶，分別是PHLPP1α、PHLPP1β和PHLPP2，具有抑制腫瘤細(xì)胞生長與遷移能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，證實(shí)其為腫瘤抑制基因的角色[4]。已有研究證實(shí)PHLPP在多種腫瘤組織呈低表達(dá)，如膠質(zhì)瘤[8]、結(jié)腸癌[9，10]、前列腺癌[11]、胃癌[12]和膽囊癌[13-14]，本研究中PHLPP在肺癌組織中呈低表達(dá)，低表達(dá)量為59.30%，這與Lv D[15]等報(bào)道PHLPP在肺腺癌組織中的表達(dá)量明顯減少相一致。Gao T等[4]發(fā)現(xiàn)PHLPP蛋白可以拮抗細(xì)胞內(nèi)P13K/Akt信號(hào)通路，從而成為Akt的負(fù)調(diào)節(jié)物。也有學(xué)者在神經(jīng)細(xì)胞和B細(xì)胞模型研究中發(fā)現(xiàn)，PHLPP1的超表達(dá)能抑制ERK的磷酸化，而SiRNA敲除PHLPP1能提高ERK的磷酸化水平，表明PHLPP能負(fù)向調(diào)節(jié)ERK信號(hào)通道[15]，以上體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明PHLPP能負(fù)向調(diào)節(jié)Akt及ERK通道從而發(fā)揮抑制腫瘤的作用[4-5]。本研究中PHLPP表達(dá)水平在不同年齡、性別、病理類型、有無吸煙組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而與P-Akt以及P-ERK的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，表明PHLPP可能通過負(fù)向調(diào)節(jié)Akt及ERK通道而發(fā)揮抗腫瘤的作用，這與前述體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相一致。

已有研究證實(shí)，Akt和ERK與腫瘤的發(fā)生及化療的預(yù)后有關(guān)[16-17]，并與肺癌的放化療預(yù)后也呈現(xiàn)相關(guān)性[18]。國內(nèi)學(xué)者Wang M等研究[6]發(fā)現(xiàn)，在A549細(xì)胞系中，順鉑治療能使Akt和ERK產(chǎn)生磷酸化而激活，而阻斷Akt和ERK信號(hào)通道能增敏A549細(xì)胞對(duì)順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而證實(shí)Akt和ERK通道的活化與肺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的化療預(yù)后有關(guān)。本研究統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，P-Akt、P-ERK陰性患者比P-Akt、P-ERK陽性患者的PFS明顯延長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，PFS與P-Akt以及P-ERK的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，這與Wang M等[6]研究結(jié)果一致。Xie Y[19]等報(bào)道PHLPP高表達(dá)預(yù)示著EGFR-TKI靶向治療獲得性耐藥的時(shí)間更長，并提示PHLPP可能通過Akt及ERK通道調(diào)控EGFR-TKI的獲得性耐藥。本研究中封三圖4～6的PFS曲線可見PHLPP高表達(dá)患者比低表達(dá)患者PFS明顯延長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明PHLPP的表達(dá)水平與PFS呈正相關(guān)，而P-Akt、P-ERK的表達(dá)與PFS呈負(fù)相關(guān)，而COX回歸分析發(fā)現(xiàn)PHLPP、P-Akt以及P-ERK的表達(dá)均是PFS的獨(dú)立預(yù)測因子，可以推測PHLPP可能通過負(fù)向調(diào)節(jié)Akt及ERK通道調(diào)控腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑化療的預(yù)后。

含鉑藥物化療是治療晚期NSCLC的主要手段，而鉑類藥物耐藥是目前面臨的主要問題，通過本研究發(fā)現(xiàn)PHLPP可能通過Akt及ERK通道調(diào)控腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑的化療預(yù)后，故進(jìn)一步探索PHLPP基因可能成為肺癌新治療和改善順鉑耐藥的新靶點(diǎn)。

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（收稿日期：2019-06-06）