葉菌唑與肟菌酯及其復(fù)配對(duì)葡萄炭疽病菌及白腐病菌的室內(nèi)抑菌活性及田間防效

吉沐祥　鄔劼　王曉琳　黃潔雪　朱建飛　饒斌

摘要：為明確葉菌唑與肟菌酯的復(fù)配增效作用，在實(shí)驗(yàn)室條件下，以葡萄炭疽病菌（Glomerella cingulata）和白腐病菌（Coniothyrium diplodiella）為供試病原菌，采取菌絲生長(zhǎng)速率法，測(cè)定葉菌唑、肟菌酯以及二者混用對(duì)葡萄炭疽病菌和白腐病菌的毒力。結(jié)果表明，采用SR值法篩選得到葉菌唑與肟菌酯（復(fù)配組合3 ∶1、1 ∶1、1 ∶2、1 ∶3、1 ∶5）的最佳配比為1 ∶3，對(duì)葡萄炭疽病菌和白腐病菌的EC50值分別為0.614 7、0.939 8 μg/mL;田間防效調(diào)查結(jié)果表明，40%肟菌酯·葉菌唑4 500倍液、3 000倍液、1 500倍液、10%葉菌唑1 500倍液和30%肟菌酯1 500倍液施藥后50 d對(duì)葡萄炭疽病防效依次為53.00%、64.35%、73.85%、68.87、55.12%，對(duì)白腐病的防效依次為74.29%、82.29%、90.94%、8352和59.45%，40%肟菌酯·葉菌唑1 500倍液對(duì)葡萄炭疽病和白腐病的防效顯著高于30%肟菌酯1 500倍液，對(duì)炭疽病的防效高于10%葉菌唑1 500倍液，但未達(dá)到顯著性差異，對(duì)白腐病的防效顯著高于10%葉菌唑1 500倍液。因此，肟菌酯和葉菌唑復(fù)配防治葡萄炭疽病和白腐病增效明顯，其中以質(zhì)量比1 ∶3混合后對(duì)葡萄炭疽病菌和白腐病菌防治增效作用最為顯著，果穗套袋前可采用40%肟菌酯·葉菌唑1 500倍液浸果防治葡萄炭疽病和白腐病。

關(guān)鍵詞：葡萄炭疽病;葡萄白腐病;肟菌酯;葉菌唑;復(fù)配;田間防效

中圖分類(lèi)號(hào)：S436.631.1+5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）19-0098-05

收稿日期：2018-12-31

基金項(xiàng)目：江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號(hào)：CX（16）1013];江蘇省句容市農(nóng)業(yè)科技支撐計(jì)劃（編號(hào)：NY2018571423）。

作者簡(jiǎn)介：吉沐祥（1963—），男，江蘇寶應(yīng)人，研究員，主要從事植保農(nóng)藥與果樹(shù)病蟲(chóng)害綠色防控技術(shù)研發(fā)。Tel：（0511）80978060;E-mail：jilvdun2800@163.com。

葡萄（Vitis vinifera L.）是世界上產(chǎn)量最大的水果之一，其產(chǎn)量居世界水果第二位[1]。我國(guó)是葡萄生產(chǎn)大國(guó)，由于大多數(shù)葡萄栽培地區(qū)連年種植，導(dǎo)致病原菌菌源積累，從而使葡萄炭疽病和白腐病成為葡萄生產(chǎn)上的主要病害[2-3]。葡萄炭疽病主要是由膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）引起的。該病菌主要危害葉片，也危害果實(shí)、當(dāng)年生新枝蔓、卷須、葉柄等組織，造成10%～15%產(chǎn)量損失[5-6]。葡萄白腐病是由白腐盾殼霉（Coniella diplodiella）侵染引起的[4]。該病菌侵染迅速，主要危害果穗、枝蔓和葉片，給葡萄生產(chǎn)構(gòu)成極大威脅[7]。

化學(xué)防治仍是當(dāng)前防治葡萄白腐病和炭疽病的主要手段。目前，防治葡萄白腐病和炭疽病的常用藥劑有福美雙、代森錳鋅、多菌靈、甲基硫菌靈、咪鮮胺、氟硅唑、苯醚甲環(huán)唑、吡唑醚菌酯和腈菌唑等。有研究表明，由于頻繁使用，這些常用藥劑對(duì)葡萄炭疽病的防效已顯著下降，病菌已對(duì)甲基硫菌靈和多菌靈產(chǎn)生抗性[3，8]。因此，須篩選出防治葡萄白腐病和炭疽病的新藥劑，通過(guò)不同作用機(jī)制的殺菌劑輪換交替使用來(lái)抑制病菌抗性產(chǎn)生，從而滿(mǎn)足生產(chǎn)需求。葉菌唑是由日本吳羽化學(xué)公司研發(fā)的新款三唑類(lèi)殺菌劑，是病菌細(xì)胞膜的重[HJ1.4mm]要組分麥角甾醇生物合成中C-14脫甲基化酶抑制劑，其殺菌譜廣泛，活性高，對(duì)非靶標(biāo)生物低毒[9]。脫甲基化抑制劑殺菌劑是有效控制炭疽病的一種化學(xué)類(lèi)極少見(jiàn)的單位點(diǎn)殺菌劑，葉菌唑?qū)奶覙?shù)中分離到的大多數(shù)炭疽病菌小種有效[10]，除了C. truncatum小種[11]。肟菌酯是從天然產(chǎn)物[CM（26]β-甲氧基丙烯酸酯衍生物開(kāi)發(fā)的一類(lèi)新的含氟殺菌劑，具有廣譜、高效、低毒等特點(diǎn)[12]。因此，本研究測(cè)定葉菌唑、肟菌酯對(duì)葡萄炭疽病菌及白腐病菌的室內(nèi)生物活性以及二者按不同配比復(fù)配后的生物活性，并通過(guò)田間試驗(yàn)評(píng)價(jià)2種藥劑混用對(duì)葡萄炭疽病和白腐病的防治效果，以期為開(kāi)發(fā)防治葡萄白腐病和炭疽病的新藥劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株

葡萄炭疽病菌（Glomerella cingulata）和白腐病菌（Coniothyrium diplodiella），采自江蘇省句容市華陽(yáng)鎮(zhèn)下甸村葡萄園，由江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所植保研究室分離、鑒定并保存?zhèn)溆?。菌株保存于馬鈴薯蔗糖瓊脂（PDA）斜面上（4 ℃）。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)在PDA培養(yǎng)基平板上轉(zhuǎn)接1次后，于26 ℃條件下預(yù)培養(yǎng)3 d，從菌落邊緣取直徑為5 mm的菌絲塊用于測(cè)定。

1.1.2 供試藥劑

主要試劑有95%葉菌唑原藥（江蘇輝豐生物農(nóng)業(yè)股份有限公司）、97%肟菌酯原藥（江蘇耕耘化學(xué)有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 藥液的配制及濃度設(shè)計(jì)

母液配制：將葉菌唑原藥和肟菌酯原藥用甲醇溶解配制成1 000 μg/mL的母液。

炭疽病菌各藥劑單劑與復(fù)配劑的濃度設(shè)計(jì)：葉菌唑在含藥PDA培養(yǎng)基中的濃度為0.062 5、0. 125、0.25、0.50、1、2 μg/mL;肟菌酯在含藥PDA培養(yǎng)基中的濃度為0.25、0.5、1、2、4、8 μg/mL;葉菌唑·肟菌酯（質(zhì)量比3 ∶1、1 ∶1、1 ∶2、1 ∶3、1 ∶5）復(fù)配劑在含藥PDA中的濃度均為0.062 5、0125、0.25、0.5、1、 2 μg/mL。單劑與復(fù)配劑的濃度設(shè)計(jì)均為7個(gè)2倍稀釋的梯度濃度含藥PDA培養(yǎng)基。

白腐病菌各藥劑單劑與復(fù)配劑的濃度設(shè)計(jì)：葉菌唑在含藥PDA培養(yǎng)基中的濃度為0.062 5、0.125、0.25、0.5、1、2 μg/mL;肟菌酯在含藥PDA培養(yǎng)基中的濃度為0.312 5、0.625、1.25、2.5、5、10 μg/mL;葉菌唑·肟菌酯（質(zhì)量比 3 ∶1、1 ∶1、1 ∶2、1 ∶3、1 ∶5）復(fù)配劑在含藥PDA中的濃度為0.156 25、0.312 5、0.625、1.25、2.5、5 μg/mL。單劑與復(fù)配劑的濃度設(shè)計(jì)均為7個(gè)2倍稀釋的梯度濃度含藥PDA培養(yǎng)基。除母液外，所有試驗(yàn)藥劑系列濃度的藥液均為現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.2 殺菌劑對(duì)葡萄炭疽病菌和白腐病菌的室內(nèi)毒力測(cè)定

在溫度為25 ℃條件下培養(yǎng)3 d后利用十字交叉法測(cè)量各處理菌落直徑，以不含殺菌劑的PDA培養(yǎng)基為對(duì)照，每處理重復(fù)4次。計(jì)算出藥劑的抑制百分率，按毒力回歸方程y=a+bx計(jì)算藥劑抑制菌絲生長(zhǎng)的有效中濃度（EC50）作為毒力參數(shù)。

計(jì)算公式：抑制生長(zhǎng)率=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對(duì)照菌落凈生長(zhǎng)量-接種菌柄直徑）×100%。

1.2.3 殺菌劑對(duì)葡萄炭疽病菌和白腐病菌的最佳配比離體試驗(yàn)篩選

采用幾率值分析法計(jì)算每個(gè)殺菌劑對(duì)靶標(biāo)菌菌絲生長(zhǎng)的有效抑制中濃度，并通過(guò)下面公式計(jì)算混合藥劑的增效系數(shù)（SR）。

式中：a表示藥劑A在混合藥劑中所占的比例;b表示藥劑B在混合藥劑中所占的比例;EC50（Obs）為實(shí)際測(cè)定的混合藥劑對(duì)病原菌的抑制中濃度;EC50（exp）為混合藥劑對(duì)病原菌的理論抑制中濃度。通過(guò)上面2個(gè)公式計(jì)算得每個(gè)設(shè)定比例的配方的SR值，SR>1.5說(shuō)明2種藥劑復(fù)配具有增效作用，0.5≤SR≤1.5說(shuō)明2種藥劑之間復(fù)配具有相加作用，SR<0.5 表明2種藥劑為拮抗作用[13]。

1.2.4 殺菌劑對(duì)葡萄炭疽病和白腐病的田間防效試驗(yàn)

1.2.4.1 試驗(yàn)田概況

試驗(yàn)于2016年在句容市戴家邊戴子龍葡萄園進(jìn)行。葡萄品種為夏黑，栽培方式為棚架，樹(shù)齡為6年，田間管理水平良好，試藥前1周未使用其他農(nóng)藥。

1.2.4.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將肟菌酯、葉菌唑按質(zhì)量比3 ∶1的比例加工成40%肟菌酯·葉菌唑懸浮劑。試驗(yàn)共設(shè)40%肟菌酯·葉菌唑懸浮劑（江蘇擎宇化工科技有限公司）1 500、3 000、4 500倍液，10%葉菌唑懸浮劑（江蘇輝豐生物農(nóng)業(yè)股份有限公司）1 500倍液，30%肟菌酯懸浮劑（江蘇耕耘化學(xué)有限公司）1 500倍液，設(shè)清水對(duì)照6個(gè)處理，每個(gè)處理4次重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組排列，每個(gè)小區(qū)供試3株葡萄樹(shù)。

1.2.4.3 統(tǒng)計(jì)方法

于2016年6月15日，果穗分別用上述藥劑浸果處理，藥后2 h套袋，果實(shí)成熟后摘袋調(diào)查果實(shí)病害。每個(gè)處理隨機(jī)取5個(gè)果穗，調(diào)查并記錄每穗果粒數(shù)和發(fā)病果粒數(shù)，并計(jì)算發(fā)病果粒率和果粒防效。

葡萄炭疽病和白腐病以發(fā)病果粒率表示各處理的發(fā)病情況，結(jié)果計(jì)算公式：

發(fā)病果粒率=發(fā)病粒數(shù)/調(diào)查總果粒數(shù)×100%;

防治效果=（對(duì)照區(qū)病果率-處理區(qū)病果率）/對(duì)照區(qū)病果率×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 室內(nèi)抑菌活性測(cè)定

2.1.1 葉菌唑與肟菌酯對(duì)葡萄炭疽病病菌和白腐病病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

由表1可知，葉菌唑與肟菌酯的濃度分別為0.062 5～2 μg/mL和0.25～8 μg/mL時(shí)，對(duì)葡萄炭疽病抑菌率分別為2.12%～72.73%、17.88%～66.97%。當(dāng)葉菌唑與肟菌酯的濃度分別為0.062 5～2 μg/mL 和0.312 5～10 μg/mL時(shí)，對(duì)葡萄白腐病抑菌率分別為5.45%～76.36%、15.76%～72.73%。這表明2種殺菌劑對(duì)葡萄炭疽病菌及白腐病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制活性以及對(duì)葡萄炭疽病菌及白腐病菌菌絲生長(zhǎng)的最低抑制濃度有差異。

2.1.2 葉菌唑與肟菌酯復(fù)配對(duì)葡萄炭疽病病菌及白腐病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

由表2可知，葉菌唑與肟菌酯5種混配組合的濃度為0.062 5～2 μg/mL時(shí)，3 ∶1、1 ∶1、1 ∶2、1 ∶3和1 ∶5的配比復(fù)配組合對(duì)葡萄炭疽病病菌菌絲生長(zhǎng)抑菌率分別為18.18%～76.36%、4.24%～72.73%、12.73%～70.91%、14.55%～75.15%、13.94%～71.21%。由表3可知，當(dāng)葉菌唑與肟菌酯5種混配組合的濃度為 0.156 25～5 μg/mL時(shí)，3 ∶1、1 ∶1、1 ∶2、1 ∶3和 1 ∶5 的配比復(fù)配組合對(duì)葡萄白腐病病菌菌絲生長(zhǎng)抑菌率分別為15.45%～7879%、9.09%～79.39%、19.09%～84.24%、18.18%～83.64%、15.76%～78.18%。

2.1.3 葉菌唑、肟菌酯及其復(fù)配劑對(duì)葡萄炭疽病病菌和白腐病菌的毒力測(cè)定 2種單劑和5種復(fù)配組合對(duì)葡萄炭疽病病菌的作用模型如表4所示，濃度對(duì)數(shù)與防治效果幾率值的相關(guān)系數(shù)均≥0.960 4，說(shuō)明防治效果幾率值的變異有96.04%或以上來(lái)自濃度對(duì)數(shù)的變異，表明用所得模型表達(dá)濃度對(duì)數(shù)與防治效果幾率值的關(guān)系可行。

由表4可知，葉菌唑、肟菌酯單劑對(duì)葡萄炭疽病病菌的EC50分別為0.898 3、3.670 7 μg/mL，葉菌唑?qū)ζ咸烟烤也【z生長(zhǎng)的抑制活性高于肟菌酯。葉菌唑、肟菌酯單劑對(duì)葡萄白腐病病菌的EC50分別為0.838 6、3.395 5 μg/mL，葉菌唑?qū)ζ咸寻赘【z生長(zhǎng)的抑制活性同樣也高于肟菌酯（表5）。

根據(jù)Wadley評(píng)價(jià)法，葉菌唑與肟菌酯對(duì)炭疽病病菌分別以質(zhì)量比1 ∶1、1 ∶3、1 ∶2和1 ∶5的復(fù)配，增效系數(shù)（SR）分別為1.97、3.37、2.62、2.53，增效系數(shù)（SR）﹥1.5，表現(xiàn)出增效作用，質(zhì)量比3 ∶1的復(fù)配，增效系數(shù)（SR）在0.5～1.5之間，表現(xiàn)出相加作用;葉菌唑與肟菌酯對(duì)白腐病病菌分別以質(zhì)量比1 ∶3和1 ∶2的復(fù)配，增效系數(shù)（SR）分別為2.05和151，增效系數(shù)（SR）﹥1.5，表現(xiàn)出增效作用，質(zhì)量比3 ∶1、1 ∶1 和 1 ∶5 的復(fù)配，增效系數(shù)（SR）在0.5～1.5之間，表現(xiàn)出相加作用;因此，葉菌唑和肟菌酯復(fù)配對(duì)葡萄炭疽病病菌及白腐病病菌的都有較高抑制作用，推薦最佳復(fù)配配比為 1 ∶3。其中，葉菌唑 ∶肟菌酯=1 ∶3的增效系數(shù)最高;葉菌唑 ∶肟菌酯=3 ∶1的增效系數(shù)最低。生產(chǎn)中可根據(jù)原藥的成本和實(shí)際使用效果確定合適的配比。

2.2 田間藥效試驗(yàn)

由表6可知，40%肟菌酯·葉菌唑4 500倍液、3 000倍液、1 500倍液、10%葉菌唑1 500倍液、30%肟菌酯1 500倍液，成熟采收時(shí)（施藥后50 d）對(duì)葡萄炭疽病的防治效果分別為53.00%、64.35%、73.85%、68.87%、55.12%，40%肟菌 酯· 葉菌唑1 500倍液對(duì)葡萄炭疽病的防治效果極顯著高于30%肟菌酯1 500倍液，防治效果高于10%葉菌唑1 500倍液，但未達(dá)到顯著性差異。由表7可知，40%肟菌酯·葉菌唑4 500倍液、3 000倍液、1 500倍液、10%葉菌唑1 500倍液和30%肟菌酯1 500倍液施藥后50 d對(duì)葡萄白腐病的防治效果分別為74.29%、82.29%、90.94%、83.52%、59.45%;40%肟菌酯·葉菌唑3 000倍液對(duì)葡萄白腐病的防治效果極顯著高于30%肟菌酯1 500倍液，與10%葉菌唑1 500倍液防效相當(dāng);40%肟菌酯·葉菌唑1 500倍液對(duì)葡萄白腐病的防治效果極顯著高于30%肟菌酯1 500倍液和10%葉菌唑1 500倍液。

3 結(jié)論與討論

葡萄炭疽病和白腐病是葡萄的主要病害，在我國(guó)發(fā)生頻率較高，目前化學(xué)藥劑防治仍是葡萄炭疽病和白腐病防治的有效措施。甾醇對(duì)維系細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，保持真核細(xì)胞結(jié)構(gòu)的流動(dòng)性十分重要[14]，三唑類(lèi)殺菌劑是一種含有三氮唑的有機(jī)雜環(huán)類(lèi)化合物，可通過(guò)三唑環(huán)上的N-4與真菌細(xì)胞色素p-450中的鐵卟啉中心的亞鐵離子配位，進(jìn)而抑制其底物的脫甲基化反應(yīng)，來(lái)阻斷麥角甾醇的合成，使真菌的細(xì)胞膜功能受到破壞，影響真菌菌絲或者是孢子的形成[15]。自第1個(gè)三唑類(lèi)殺菌劑三唑酮面世以來(lái)，這類(lèi)殺菌劑如三唑醇、戊唑醇、烯唑醇、丙環(huán)唑、腈菌唑、葉菌唑等陸續(xù)被開(kāi)發(fā)，三唑類(lèi)殺菌劑是現(xiàn)階段合成種類(lèi)數(shù)最多的麥角甾醇合成抑制劑[14]。目前葉菌唑主要應(yīng)用于禾本科作物防治白腐病、葉銹病、矮形銹病、穎枯病、黃銹病以及穗鐮刀菌、殼針孢菌等引起的病害[16]。陸學(xué)云研究發(fā)現(xiàn)，40%葉菌唑·戊唑醇水乳劑150 g/hm2對(duì)小麥赤霉病田間防效達(dá)97.2%[17]。葉菌唑在美國(guó)南卡羅來(lái)納州登記為防治桃樹(shù)病害的藥劑[14]，同時(shí)在美國(guó)被登記為防治蘋(píng)果白腐病和黑腐病的殺菌劑[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，葉菌唑單劑對(duì)葡萄炭疽病病菌和白腐病菌的EC50僅為0.898 3、0.838 6 μg/mL。甲氧基丙烯酸酯類(lèi)殺菌劑具有廣譜性和高殺菌活性的特點(diǎn)，其作用機(jī)制是抑制線(xiàn)粒體中的電子傳遞，破壞ATP的產(chǎn)生，最終導(dǎo)致病菌因失去能量而死。目前，已經(jīng)商品化的甲氧基丙烯酸酯類(lèi)殺菌劑主要有嘧菌酯、吡唑醚菌酯、肟菌酯和啶氧菌酯等。肟菌酯主要應(yīng)用于大豆、谷物、玉米和葡萄等作物。肟菌酯對(duì)大多數(shù)真菌綱的病害具有良好的活性[19]，針對(duì)油菜菌核病其防效優(yōu)于多菌靈[20]。在美國(guó)西瓜炭疽病防治試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，肟菌酯增加了總果實(shí)數(shù)量和重量，提高了果實(shí)可溶性固形物含量，并降低了炭疽病癥狀的果實(shí)比例[21]。解維星等研究發(fā)現(xiàn)，30%肟菌酯·苯醚甲環(huán)唑水乳劑1 000倍液對(duì)黃瓜白粉病的防治效果好，第2次藥后 10 d 防效可達(dá)92.68%[12]。本研究結(jié)果表明，肟菌酯單劑對(duì)葡萄炭疽病菌和白腐病菌的EC50分別為3.670 7、3.395 5 μg/mL。

甲氧基丙烯酸酯類(lèi)殺菌劑如肟菌酯、嘧菌酯和吡唑醚菌酯等，如果長(zhǎng)期使用，可能會(huì)存在一定的抗藥性隱患，將其與作用機(jī)制不同的其他種類(lèi)殺菌劑混配可延緩或降低抗藥性的發(fā)生。不同種類(lèi)殺菌劑復(fù)配產(chǎn)生的增效作用，不僅可以減少殺菌劑的用量，還可以提高殺菌劑的活性，降低農(nóng)藥使用成本，減少對(duì)環(huán)境的污染[22]。本試驗(yàn)得出，葉菌唑和肟菌酯以質(zhì)量比 1 ∶3 的比例混合，在離體條件下對(duì)葡萄炭疽病和白腐病都具有增效作用，在田間條件下40%肟菌酯·葉菌唑 1 500 倍液對(duì)葡萄炭疽病和白腐病的平均果粒防效極顯著高于30%肟菌酯1 500倍液，對(duì)炭疽病的平均果粒防效與10%葉菌唑 1 500 倍液防效相當(dāng)，對(duì)白腐病的平均果粒防效顯著高于10%葉菌唑1 500倍液，本研究結(jié)果為40%肟菌酯·葉菌唑 1 500 倍液應(yīng)用于葡萄炭疽病和白腐病防治提供了依據(jù)，可在生產(chǎn)中進(jìn)一步示范應(yīng)用。

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