膈肌呼出氣一氧化氮濃度、一氧化氮合酶表達(dá)水平及炎性因子水平與食管病變并慢性阻塞性肺疾病患者膈肌活動(dòng)度的相關(guān)性研究

王慧，張?chǎng)危η?，楊?/p>

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是因長(zhǎng)期慢性氣道炎癥引起的氣道重塑、氣流受限性疾病，嚴(yán)重影響患者的肺功能及生活質(zhì)量。膈肌是人體重要的呼吸肌，由膈肌介導(dǎo)的呼吸功能占所有呼吸肌的60%～70%［1-2］。COPD患者需用力呼吸才能保證肺泡通氣量，但長(zhǎng)期用力呼吸可增加膈肌負(fù)擔(dān)，導(dǎo)致膈肌疲勞，且膈肌機(jī)械位移范圍可隨肺過(guò)度充氣、肺容量增加而縮小［3-4］，進(jìn)而導(dǎo)致膈肌活動(dòng)度下降［5-6］。目前COPD患者膈肌活動(dòng)度改變的潛在分子機(jī)制尚不完全明確。一氧化氮（NO）是由一氧化氮合酶（NOS）催化精氨酸生成的重要?dú)怏w信號(hào)分子。COPD患者氣道慢性炎癥可使NOS表達(dá)上調(diào)［7］、NO生成增多，而氣道NO既可刺激炎性細(xì)胞活化和浸潤(rùn)、放大炎性反應(yīng)，又可啟動(dòng)肌肉的興奮收縮耦聯(lián)、引起氣道平滑肌及膈肌過(guò)度收縮［8-9］。本研究旨在探討膈肌呼出氣一氧化氮（FeNO）濃度、NOS表達(dá)水平及炎性因子水平與食管病變并COPD患者膈肌活動(dòng)度的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年6月—2018年12月河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院收治的食管病變行開(kāi)胸手術(shù)患者48例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）術(shù)前完善肺功能及FeNO濃度檢查；（2）術(shù)中留取膈肌標(biāo)本；（3）近期未接受糖皮質(zhì)激素及β2-受體激動(dòng)劑治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）胸廓畸形、脊柱畸形者；（2）合并肺間質(zhì)疾病、支氣管哮喘者；（3）合并自身免疫性疾病及肝腎功能異常者。根據(jù)術(shù)前是否合并COPD將所有患者分為對(duì)照組（未合并COPD，n=26）和COPD組（合并COPD，n=22）。對(duì)照組患者中男16例，女10例；年齡51～69歲，平均年齡（59.9±8.6）歲；體質(zhì)指數(shù)（22.08±3.77）kg/m2；吸煙史10例；合并癥：高血壓13例，糖尿病9例；實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)：血肌酐（70.14±10.77）mmol/L，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）（22.93±5.95）U/L，天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）（21.25±7.14）U/L，pH值（7.41±0.89）；左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）（64.58±9.34）%。COPD組患者中男14例，女8例；年齡52～71歲，平均年齡（60.3±8.2）歲；體質(zhì)指數(shù)（21.61±3.42）kg/m2；吸煙史11例；合并癥：高血壓12例，糖尿病8例；實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)：血肌酐（72.38±9.93）mmol/L，ALT（24.12±5.23）U/L，AST（21.93±4.58）U/L，pH 值（7.37±0.95）；LVEF（65.24±9.97）%。兩組患者性別（χ2=0.022）、年齡（t=0.164）、體質(zhì)指數(shù)（t=0.449）、吸煙率（χ2=0.645）、高血壓發(fā)生率（χ2=0.099）、糖尿病發(fā)生率（χ2=0.016）、血肌酐（t=0.744）、ALT（t=0.729）、AST（t=0.384）、pH值（t=0.150）、LVEF（t=0.237）比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：20150012），患者及家屬對(duì)本研究知情。

1.2 主要儀器及試劑 主要儀器：肺功能儀購(gòu)自德國(guó)耶格公司，F(xiàn)eNO測(cè)定系統(tǒng)購(gòu)自瑞典尼爾斯公司；主要試劑：超純RNA提取試劑盒、SuperRT cDNA第一鏈合成試劑盒、UltraSYBR Mixture試劑盒均購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，蛋白裂解液購(gòu)自Invitrogen公司，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）、神經(jīng)型一氧化氮合酶（nNOS）的第一抗體均購(gòu)自Abcam公司，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒購(gòu)自上海西唐生物科技有限公司。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 膈肌活動(dòng)度 比較兩組患者膈肌活動(dòng)度。檢查膈肌時(shí)，患者取仰臥位，將探頭置于患者右肋下緣、腋前線與鎖骨中線中點(diǎn)處，方向指向右肩部，獲取清晰的膈肌圖像后記錄患者在呼吸運(yùn)動(dòng)過(guò)程中膈肌超聲信號(hào)的波峰與波谷，根據(jù)波峰與波谷計(jì)算膈肌活動(dòng)度。

1.3.2 FeNO濃度 術(shù)前采用FeNO測(cè)定系統(tǒng)檢測(cè)兩組患者膈肌FeNO濃度，采用過(guò)濾器吸入外源性NO至最大肺活量后指導(dǎo)患者以50 ml/s的氣流速度呼氣，呼氣壓力為10～20 cm H2O（1 cm H2O=0.098 kPa），F(xiàn)eNO測(cè)定系統(tǒng)可自動(dòng)計(jì)算結(jié)果。本研究所使用的FeNO測(cè)定系統(tǒng)具備全面質(zhì)量控制功能：當(dāng)患者在測(cè)定過(guò)程中出現(xiàn)呼吸過(guò)弱或過(guò)強(qiáng)、漏氣、咳嗽和逆向呼或吸等情況時(shí)，系統(tǒng)主機(jī)可自動(dòng)強(qiáng)行終止測(cè)定。

1.3.3 膈肌NOS mRNA相對(duì)表達(dá)量 比較兩組患者膈肌NOS（包括iNOS、eNOS、nNOS）mRNA相對(duì)表達(dá)量。術(shù)中，取患者膈肌組織適量，采用超純RNA提取試劑盒分離、提取組織總RNA，以RNA為模板，采用SuperRT cDNA第一鏈合成試劑盒將RNA合成cDNA，取cDNA；按照UltraSYBR Mixture試劑盒配置聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）反應(yīng)體系，按照95 ℃ 10 s、特異性退火溫度15 s、72 ℃ 25 s的程序反應(yīng)進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，儀器上可顯示PCR循環(huán)曲線及循環(huán)閾值，根據(jù)循環(huán)閾值計(jì)算iNOS、eNOS、nNOS的mRNA相對(duì)表達(dá)量?；蛞镄蛄屑疤禺愋酝嘶饻囟纫?jiàn)表1。

表1 iNOS、eNOS、nNOS引物序列及特異性退火溫度Table 1 Primer sequence and specific annealing temperature of iNOS，eNOS and nNOS

1.3.4 膈肌NOS蛋白相對(duì)表達(dá)量 比較兩組患者膈肌NOS蛋白相對(duì)表達(dá)量。取膈肌組織適量，采用蛋白裂解液提取組織總蛋白，蛋白樣本經(jīng)加熱、變性后加入聚丙烯酰胺分離凝膠，采用電泳技術(shù)將蛋白樣本分離、電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素（NC）膜，將NC膜放入5%脫脂牛奶中封閉2 h，洗膜后在4 ℃環(huán)境中孵育iNOS、eNOS、nNOS的第一抗體過(guò)夜；第2天，洗膜后室溫孵育第二抗體2 h，再次洗膜并采用ECL顯影系統(tǒng)顯示蛋白條帶，以目的基因（iNOS、eNOS、nNOS）蛋白條帶的灰度值與內(nèi)參基因β-actin蛋白的灰度值比值為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3.5 膈肌炎性因子 比較兩組患者膈肌炎性因子〔包括腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素1β（IL-1β）、白介素6（IL-6）、白介素8（IL-8）〕水平。取膈肌組織適量，加入磷酸鹽緩沖液后進(jìn)行超聲勻漿，將勻漿液在4 ℃離心機(jī)中以12 000 r/min離心20 min（離心半徑5.5 cm），取上清液，采用ELISA檢測(cè)患者上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8水平，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（x± s）表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料分析采用χ2檢驗(yàn)；膈肌FeNO濃度、NOS表達(dá)水平及炎性因子水平與食管病變并COPD患者膈肌活動(dòng)度的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膈肌活動(dòng)度 COPD組患者膈肌活動(dòng)度為（2.74±0.52）cm，小于對(duì)照組的（3.89±0.67）cm，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.549，P＜0.05）。

2.2 膈肌FeNO濃度 COPD組患者膈肌FeNO濃度為（37.42±6.23）ppb，高于對(duì)照組的（14.52±2.77）ppb，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=16.896，P＜0.05）。

2.3 膈肌NOS mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量 COPD組患者膈肌iNOS、eNOS mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；兩組患者膈肌nNOS mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，見(jiàn)表2～3、圖1）。

2.4 膈肌炎性因子水平 COPD組患者膈肌TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見(jiàn)表4）。

2.5 相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，膈肌FeNO濃度、iNOS mRNA相對(duì)表達(dá)量、eNOS mRNA相對(duì)表達(dá)量、iNOS蛋白相對(duì)表達(dá)量、eNOS蛋白相對(duì)表達(dá)量及TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8水平均與食管病變并COPD患者膈肌活動(dòng)度呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05，見(jiàn)表5）。

圖1 兩組患者膈肌NOS蛋白電泳結(jié)果Figure 1 Electrophoretic results of NOS protein in diaphragm in the two groups

表2 兩組患者膈肌NOS mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（x±s）Table 2 Comparison of relative expression quantity of NOS mRNA in diaphragm between the two groups

表3 兩組患者膈肌NOS蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（x±s）Table 3 Comparison of relative expression quantity of NOS protein in diaphragm between the two groups

表4 兩組患者膈肌炎性因子水平比較（x±s）Table 4 Comparison of levels of inflammatory cytokines in diaphragm in between the two groups

表5 膈肌FeNO濃度、NOS表達(dá)水平及炎性因子水平與食管病變并COPD患者膈肌活動(dòng)度的Pearson相關(guān)分析結(jié)果Table 5 Pearson correlation analysis of FeNO concentration，expression of NOS and levels of inflammatory cytokines in diaphragm with diaphragm mobility in esophageal lesion patients complicated with COPD

3 討論

COPD是以不可逆氣流受限為主要特征的肺部疾病，氣流受限導(dǎo)致呼吸肌做功增加，患者需通過(guò)用力呼吸而保證肺泡足夠的通氣量，但長(zhǎng)期用力呼吸會(huì)引起呼吸肌疲勞甚至損傷［10］。膈肌是人體重要的呼吸肌，也是COPD較易累及的呼吸肌，有研究報(bào)道，COPD患者膈肌肌纖維縮短約40%，而肋間肌肌纖維縮短約7%［11］，膈肌疲勞或受損可使肌動(dòng)蛋白肌絲、肌球蛋白肌絲過(guò)度重疊，進(jìn)而導(dǎo)致患者膈肌活動(dòng)度下降；此外，COPD患者肺過(guò)度充氣、殘氣過(guò)多均會(huì)直接造成膈肌機(jī)械位移，進(jìn)而加劇膈肌活動(dòng)度下降［12-13］。本研究結(jié)果顯示，COPD組患者膈肌活動(dòng)度小于對(duì)照組，提示COPD患者膈肌活動(dòng)度下降，與劉岷等［6］研究結(jié)果一致。

相關(guān)研究表明，膈肌收縮功能損傷除與鈣離子釋放介導(dǎo)的興奮收縮耦聯(lián)異常有關(guān)外，還與肌細(xì)胞損傷有關(guān)［14］。氣道慢性炎癥是COPD患者的基本病理特征，而FeNO是臨床評(píng)價(jià)氣道炎癥的常用無(wú)創(chuàng)指標(biāo)［15］。NO是人體重要的氣體信號(hào)分子，可招募炎性因子、放大炎性反應(yīng)，造成氣道平滑肌、膈肌損傷；另外，NO還可通過(guò)影響自由基生成、電子鏈傳遞等過(guò)程而破壞興奮收縮［16-17］。本研究結(jié)果顯示，COPD組患者膈肌FeNO濃度高于對(duì)照組，且膈肌FeNO濃度與食管病變并COPD患者膈肌活動(dòng)度與呈負(fù)相關(guān)，與既往研究結(jié)果一致［18-19］，提示COPD患者氣道內(nèi)大量生成的FeNO可通過(guò)直接損傷膈肌及興奮-收縮耦聯(lián)等使食管病變并COPD患者膈肌活動(dòng)度下降。

NOS包括iNOS、eNOS、nNOS，可通過(guò)催化精氨酸代謝生成NO。張運(yùn)濤等［7］研究表明，COPD患者膈肌NOS mRNA表達(dá)水平升高，但并分析不同類型NOS表達(dá)水平。本研究結(jié)果顯示，COPD組患者膈肌iNOS、eNOS mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，但兩組患者nNOS mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示iNOS、eNOS可能參與了食管病變并COPD患者膈肌損傷過(guò)程。呼吸肌長(zhǎng)期過(guò)度做功、慢性炎癥均可誘導(dǎo)iNOS表達(dá)；eNOS與膈肌中內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、毛細(xì)血管重構(gòu)關(guān)系密切。本研究結(jié)果還顯示，膈肌iNOS mRNA相對(duì)表達(dá)量、eNOS mRNA相對(duì)表達(dá)量、iNOS蛋白相對(duì)表達(dá)量、eNOS蛋白相對(duì)表達(dá)量與食管病變并COPD患者膈肌活動(dòng)度均呈負(fù)相關(guān)，提示膈肌iNOS、eNOS表達(dá)水平升高可能是導(dǎo)致食管病變并COPD患者膈肌活動(dòng)度下降的機(jī)制之一。

氣體信號(hào)分子NO具有促炎活性，可通過(guò)激活炎性反應(yīng)而加重膈肌損傷、導(dǎo)致膈肌活動(dòng)度下降［16-17］。TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8是由NO調(diào)控的常見(jiàn)促炎因子［20-22］。本研究結(jié)果顯示，COPD組患者膈肌TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8水平高于對(duì)照組，提示COPD患者膈肌存在炎性反應(yīng)；進(jìn)一步行Pearson相關(guān)分析顯示，膈肌TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8水平均與食管病變并COPD患者膈肌活動(dòng)度呈負(fù)相關(guān)，提示膈肌炎性因子水平升高與食管病變并COPD患者膈肌活動(dòng)度下降有關(guān)。

綜上所述，膈肌FeNO濃度、iNOS及eNOS表達(dá)水平、炎性因子水平升高與食管病變并COPD患者膈肌活動(dòng)度下降有關(guān)；但本研究?jī)H進(jìn)行了相關(guān)性分析，并不能證實(shí)膈肌FeNO濃度、iNOS及eNOS表達(dá)水平、炎性因子水平升高與食管病變并COPD患者膈肌活動(dòng)度下降之間的因果關(guān)系，今后可結(jié)合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

作者貢獻(xiàn)：王慧進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，研究的實(shí)施與可行性分析；張?chǎng)?、薛乾隆進(jìn)行數(shù)據(jù)收集、整理、分析；楊淼進(jìn)行結(jié)果分析與解釋，論文的修訂；王慧負(fù)責(zé)撰寫(xiě)論文，負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，對(duì)文章整體負(fù)責(zé)、監(jiān)督管理。

本文無(wú)利益沖突。